Pequeños técnicas de imagen permiten animales exámenes de diagnóstico de serie y las intervenciones terapéuticas en vivo. Recientemente, el alcance de las aplicaciones se ha ampliado significativamente y actualmente incluye la evaluación del desarrollo de tumores del colon, la cicatrización de heridas y el seguimiento de la inflamación. Este protocolo se ilustran estas diversas aplicaciones potenciales de la endoscopia murino.
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Artículo de método
Murino Endoscopia para En Vivo Healing Multimodal Imaging de Carcinogénesis y Evaluación de la herida y la inflamación intestinal
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Resumen
Resumen
Los modelos de ratón se utilizan ampliamente para estudiar la patogénesis de las enfermedades humanas y para evaluar los procedimientos de diagnóstico, así como las intervenciones terapéuticas preclínica. Sin embargo, la evaluación válida de alteraciones patológicas a menudo requiere el análisis histológico, y cuando se realiza ex vivo, requiere la muerte del animal. Por lo tanto en entornos experimentales convencionales, los exámenes de seguimiento intra-individuales son raramente posible. Así, el desarrollo de la endoscopia murino en ratones vivo permite a los investigadores por primera vez tanto a visualizar directamente la mucosa gastrointestinal y también repetir el procedimiento de supervisión para las alteraciones. Existen numerosas aplicaciones para la endoscopia murino in vivo, incluyendo el estudio de la inflamación intestinal o la cicatrización de heridas, la obtención de biopsias de la mucosa en varias ocasiones, y para administrar localmente agentes de diagnóstico o terapéuticos que utilizan catéteres de inyección en miniatura. Más recientemente, la imagen molecular se ha extendido mo de diagnóstico por imágenesdalidades que permiten la detección específica de moléculas diana diferentes utilizando fotosondas específicos. En conclusión, la endoscopia murino se ha convertido en una novedosa tecnología de vanguardia para el diagnóstico experimental de imágenes in vivo y puede tener un impacto significativo en la investigación preclínica en diversos campos.
Introducción
Los modelos animales han enriquecido enormemente nuestra comprensión de numerosas patologías intestinales. El ratón de laboratorio (Mus musculus) se ha convertido en un modelo animal de primera en la investigación biomédica, debido a su abundante información genética y genómica y es fácilmente disponible en cepas transgénicas y knockout. Además de mejorar la comprensión patogénesis de la enfermedad, los modelos animales se utilizan también importante para probar los fármacos candidatos, así como las intervenciones diagnósticas o terapéuticas preclínicos. Sin embargo, a pesar de la variedad de modelos de ratones que imitan las enfermedades humanas, muchas opciones de diagnóstico y de intervención que se utilizan de forma rutinaria en la atención al paciente no están disponibles para los ratones. En consecuencia, las estrategias de vigilancia para monitorear el curso de la enfermedad murino o el efecto de las intervenciones terapéuticas a menudo se limitan a observaciones indirectas o análisis post mortem. Si bien existen procedimientos no invasivos para los ratones de vigilancia vitalidad como índices de actividad de la enfermedad, quantification de la pérdida o ganancia de peso, la sangre, la orina y las heces análisis, estos son sólo indicadores indirectos y están sesgadas por la variabilidad interindividual. Además, los análisis post mortem prevenir observaciones longitudinales en puntos de tiempo repetitivos. Sofisticadas técnicas de imagen para monitorear actividad de la enfermedad en ratones han sido recientemente introducido 1,2. Aunque estas técnicas de imagen permiten el análisis repetitivos, que sólo proporcionan una visión descriptiva y, a menudo impreciso en el intestino, no permitir la visualización directa de la mucosa o permitir las intervenciones diagnósticas o terapéuticas, tales como la adquisición de la biopsia o la aplicación tópica y intramucosa de los fármacos candidatos.
Recientemente, los sistemas endoscópicos de alta resolución para uso en ratones vivos se han desarrollado 3,4. Por primera vez estas técnicas endoscópicas permiten la visualización directa de las patologías de la enfermedad del colon endoluminales tales como la curación de heridas o inflamación intestinal proporcionar objestado reflexivo, en tiempo real permitiendo estudios longitudinales en el mismo animal en puntos de tiempo repetitivos. Aparte de permitir biopsias repetidas en un ratón individual, sistemas endoscópicos también se pueden utilizar para influir terapéuticamente de un tumor distinto o inflamación localizada al permitir la aplicación directa de una sustancia para el área de interés. Además, como sustancias terapéuticas y de control pueden ser entregados directamente a la zona de interés, esto se puede realizar en el mismo ratón, con exclusión de la variabilidad inter-individual. Estos sistemas ahora se han empleado para la evaluación de la inflamación del colon, curación de heridas, biopsias de hígado ortotópico laparoscópicos y la inducción de tumores hepáticos 8 y el desarrollo del tumor usando varios sistemas de puntuación tales como el índice endoscópica murino de gravedad de la colitis (MEICS) 5-7. MEICS consta de cinco parámetros para evaluar la inflamación: engrosamiento de la pared del colon, los cambios del patrón vascular, presencia de fibrina, la granularidad de los mucosal de la superficie, y la consistencia de heces.
En este protocolo se describe el uso de la endoscopia rígida en modelos murinos de cicatrización de la herida intestinal, inflamación y cáncer de colon. En primer lugar, se demuestra la evaluación endoscópica de la curación de heridas y la inflamación colónica así como la evaluación longitudinal de la actividad de la colitis y el estudio de carcinogénesis en el colon murino. Más allá del uso descriptivo de la endoscopia murino, se proporcionan instrucciones detalladas sobre el uso de instrumentación endoscópica para obtener biopsias, y la aplicación tópica y intramucosa de diferentes componentes de interés (por ejemplo, fármacos candidatos o células tumorales). Por último, demostrar el uso de la endoscopia de fluorescencia murino, que emplea sofisticadas técnicas de imagen molecular, en el entorno de los tumores colorrectales.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) de acuerdo con la Ley de Protección Animal alemán.
1. Materiales y Configuración Experimental
- Cuidado de los animales
- Utilice femenino o ratones machos de cualquier cepa que pesa de 20 a 25 g y alojarlos según la legislación local de cuidado de animales.
- Alimente ratones con Chow especial para roedores y aplicar chow-alfalfa libre de por lo menos tres días antes de la fluorescencia exámenes para minimizar endoluminal autofluorescencia.
- Proporcionar autoclave beber agua ad libitum.
- La inducción de la colitis inducida por DSS aguda
- Preparar un 3% (w / v) de sulfato de dextrano sódico (DSS, peso molecular: 36,000-50,000 Da) solución disolviendo 3 g de DSS en 100 ml de agua en autoclave. Ofrecer esta solución ya que el agua potable exclusivo de ratones ad libitum y calcular 5 ml de solución de DSS-por ratón / día. RSS contratones rol con agua tratada en autoclave sin DSS ad libitum 9.
- La inducción de cáncer colorrectal
- Disolver azoximetano mutagénico (OMA) (PRECAUCIÓN Puede provocar cáncer y daños genéticos!) En solución salina isotónica estéril para obtener una concentración final de 1 mg / ml. Aplicar una dosis única de 10 mg AOM por kg de peso corporal por vía intraperitoneal usando una jeringa de 1 ml (30 G) 10.
- Ratones reto (con exclusión de los ratones de control) con ciclos repetitivos de 3% (w / v) DSS desde el día 0 a 7, 14 a 21 días, el día 28 a 35 y de 42 a 49 días para inducir inflamatoria con la carcinogénesis colorrectal. Alimente los ratones con agua tratada en autoclave solamente entre estos desafíos (véase la figura 4A para un calendario detallado). Alimente los ratones de control con agua tratada en autoclave durante todo el experimento.
- Preparación de la endoscopia de fluorescencia (FE)
- Uso de fluoresceína-Isothiocyanat (FITC) - dextrano (peso molecular 70.000 Da; FITC: Glucosa = 1: 250) para detección de adenoma de colon por realce visual de la displasia asociada patrón vascular.
- Administrar 60 mg de dextrano-FITC conjugado diluido en 100 l de PBS por vía intravenosa 5 minutos antes de un examen endoscópico de fluorescencia.
- Anestesia
- Proporcionar un suministro continuo para la anestesia de isoflurano (1,5 LO 2 / min; 1,5-2% en volumen de isoflurano [2-cloro-2-(difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano]). Utilice un equipo especial de anestesia veterinaria con una mascarilla para controlar estrechamente la anestesia.
- Preparación de enema
- Inculcar 2 ml de enema líquido (contenido: hidrogenofosfato disódico 1,5% (w / v) y dihidrogenofosfato de sodio 11% (w / v)) en el colon si se sospecha de carga fecal significativa que puede ocultar la vista.
2. Equipo técnico
- Utilice una estación de trabajo endoscópica veterinaria que se elaboró y aprobó el uso de la endoscopia pequeño animal. Conecte el workstation a una unidad de cámara, una fuente de luz de xenón, una bomba de aire y a un monitor de PC convencional para la luz blanca de la endoscopia. A continuación, conecte la cámara y el telescopio rígido miniatura (1,9 mm de diámetro exterior, 10 cm de longitud; la Figura 5).
- Utilice funda de endoscopio con canal de trabajo (Figura 5D) para la aplicación de fórceps de biopsia o tubo de inyección. Utilice la vaina sin canal de trabajo para colonoscopia diagnóstica.
- Configurar los ajustes de la fuente de luz para la endoscopia de fluorescencia para excitar trazadores utilizados (por ejemplo, 490 nm para el dextrano conjugado con FITC). Además, integrar un filtro de paso de banda adecuado entre el telescopio y la cámara (por ejemplo, 525 nm para el dextrano conjugado con FITC).
- Inserte las pinzas de biopsia flexibles (3 Charr., 28 cm) a través del canal de trabajo del endoscopio para obtener biopsias.
- Introducir el tubo flexible de inyección (0,96 mm) a través del canal de trabajo para la administración tópica, intramucoso o endoluminal undministración de agentes de diagnóstico o terapéuticos.
- Utilice una mesa de examen que se puede calentar con una temperatura de 42 ° C. Esto evita que los ratones hipotermia durante el examen.
3. Anestesia de Animales
- Coloque el ratón en una caja pequeña, pero a prueba de fugas y administrar isoflurano (100% (v / v), 5% en volumen, 3 L / min). Espere hasta que el ratón pierde el conocimiento.
- Transferir el ratón sobre la mesa de examen para la endoscopia. Continuar la inhalación de isoflurano a través de la máscara de cara con una dosis de 100% v / v, 1,5% en volumen, 1,5 L / min. Siempre aplique ungüento para los ojos para evitar la sequedad ocular, mientras que bajo anestesia.
- Evaluar la eficacia de la anestesia mediante la comprobación de los reflejos. Compruebe la 'vuelta alrededor reflex': si anestesiado suficientemente, un ratón que se en la espalda no debe dar la vuelta. Compruebe los dedos de los pies 'reflejo': cuando la anestesia es adecuada, suave pellizco entre los dedos de los animales no debe llevar a la retirada de la pata (etapa detolerancia quirúrgica).
4. Colonoscopia
- Coloque ratón anestesiado propensa / en la espalda a la mesa de examen.
- Administrar 2 ml de enema mediante una cánula abotonado en el colon si se sospecha de la carga fecal significativa que puede dificultar la visión. Espere a que los ratones que defecan después de administrar el enema. Inserte el endoscopio con mucho cuidado para evitar la perforación.
- Abra las dos válvulas de la funda con uno de ellos está conectado a la bomba de aire. Selle la otra válvula con su dedo índice para prescindir de aire. Inflar colon con aire, lenta y cuidadosamente, sobre todo en el caso de la biopsia o la inyección.
- Avanzar endoscopio sólo hasta la flexura del colon derecho a evitar la perforación (4-5 cm del ano).
- Colonoscopia diagnóstica
- Examinar la mucosa de las alteraciones inflamatorias o malignas, mientras que tirando hacia atrás el endoscopio. Tire hacia atrás lentamente para evaluar toda la circunferencia del intestino. Evaluar pa intraluminalthologies utilizando los sistemas de puntuación establecidos apropiadas según sea necesario.
- Para justificar la posición endoscópica idéntico para la adquisición de imágenes durante visualizaciones repetitivos de las áreas de la herida, tenga en cuenta la distancia entre el ano murino y la lesión de la mucosa. Además, el uso de la punta de las pinzas de biopsia como un espaciador para lograr distancia idéntica entre el endoscopio y el área de la herida durante la adquisición de imagen. El tamaño de la herida está relacionada con el tamaño de la funda de endoscopio, que comprende 3 mm.
NOTA: Coloque endoscopio en posición idéntica en comparación óptica con documentación fotográfica de los exámenes anteriores. Medida lesiones en el mismo ángulo y la distancia de cada seguimiento examen endoscópico.
- Procedimiento de biopsia
- Tomar biopsias con la ayuda de dos investigadores. Introducir las pinzas de biopsia con cuidado a través del canal de trabajo hasta que la punta de la pinza es visible en el monitor a la segunda investigador. Pinzas de apertura y cierre con cuidado a unvoid perforación.
- Mueva fórceps para el sitio de la patología.
- Procedimiento de inyección
- Realizar el procedimiento de inyección con la ayuda de dos investigadores. Tubo flexible de inyección pre-llenado (0,96 mm) completamente con el agente a administrar. Empuje el tubo a través del canal de trabajo hasta que la cánula (30 G) es visible en el monitor para el segundo investigador. Preparar la multa jeringa y administrar suavemente la cantidad solicitada de agente de diagnóstico o terapéutico. Los volúmenes de inyección debe ser de 50 l como máximo.
- Inserte la aguja en el submocosa en un ángulo de 15-30 grados. Enfrentar el bisel en la dirección de la mucosa. La mucosa muestra un signo de elevación característica después de la inyección con éxito.
- Endoscopia de fluorescencia (FE)
- Administrar 60 mg de dextrano-FITC conjugado diluido en 100 l de PBS por vía intravenosa antes de la fluorescencia examen endoscópico.
- Compruebe el punto de tiempo óptimo entre la inyección desu fluorescente trazador marcado y el procedimiento de formación de imágenes que depende de la farmacología trazador. Configurar los ajustes de sistema de filtro de paso de banda de acuerdo a la longitud de onda de excitación y emisión del trazador utilizado. Realizar la endoscopia de fluorescencia para trazadores no específicos de volumen de sangre (por ejemplo, FITC) inmediatamente después de la inyección intravenosa del colorante fluorescente para evaluar el patrón vascular de la superficie mucosa.
- Considere la posibilidad de obtener imágenes de varias horas después de la aplicación del marcador en caso de trazadores específicos o "sondas inteligentes" para ofrecer un mejor objetivo de fondo-ratio.
- Realizar fotos y de video-documentación de los resultados.
5. Post-colonoscopia
- Separar el ratón en una jaula vacía y colóquela sobre una toalla de papel para proteger el ratón de la aspiración de la camada. Calentar el ratón con una lámpara redlight para prevenir la hipotermia. Observe el ratón y no lo deje sin vigilancia hasta que se haya recuperado la suficienteconciencia para mantener decúbito esternal. Una vez completamente consciente, colocar el ratón de nuevo a su respectiva jaula.
- Al final del experimento, el lugar del ratón en una caja pequeña, pero a prueba de fugas y administrar CO 2 (100% (v / v), 100% vol, 3 L / min). Espere hasta que el ratón pierde el conocimiento completo y deja de respirar. Despacho del ratón por fractura de cuello. Lleve a cabo una laparotomía abdominal y explantar el colon. Abra el colon longitudinalmente y lavarlo para su posterior evaluación histológica o molecular.
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Resultados
En la vigilancia in vivo de cicatrización de la herida intestinal
Durante la endoscopia de rutina, heridas de la mucosa fueron inducidas mecánicamente por fórceps de biopsia en miniatura con un diámetro de 3 Francés (igual a 1 mm; Figura 1A). Posteriormente, la cicatrización de heridas se monitorizó mediante exámenes endoscópicos diarias y cuantificado por medición de la zona de la herida residual utilizando software de edición de imagen, por ejemplo, Ima...
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Discusión
Cicatrización de la herida epitelial es un proceso continuo. Exfoliación fisiológica continua de células de la superficie dentro de la mucosa gastrointestinal se produce requiere la regeneración frecuente de las células epiteliales 16. En consecuencia, con problemas de curación de heridas tiene un inmenso impacto en varias enfermedades incluyendo las úlceras gastrointestinales y fuga anastomótica 17 18. Evaluación del fondo molecular, así como potenciales candidatos a fármacos para estimular la cic...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a Sonja Dufentester y Elke Weber para la asistencia técnica de expertos. Agradecemos Faekah Gohar para la corrección del manuscrito y Stefan Brückner apoyo informática médica. Este trabajo fue apoyado por una beca interdisciplinaria del Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth fue apoyado por una beca de investigación de la Facultad de Medicina de la Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner fue apoyado por una posición de giro "Gerok" de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Agradecemos Heike Blum para la ilustración de la historieta del ratón.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos | |||
| Dieta sin alfalfa | Harlan Laboritories, Madison, Estados Unidos | 2014 | |
| Azoximetano (AOM) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania | A5486 | |
| Bepanthen ungüento oftálmico | Bayer, Leverkusen, Alemania | 80469764 | |
| Sulfato de dextrano sódico (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Suecia | DB001 | |
| Eosina | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania | E 4382 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica | 352070 | |
| Florene 100 V/V | Abbott, Wiesbaden, Alemania | B506 | |
| Hematoxilina | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania | HHS32-1L | |
| Isopentano (2-metilbutano) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania | M32631-1L | |
| Azul de metileno | Merck, Darmstadt, Alemania | 1159430025 | |
| O.C.T. Compuesto Tissue Tek | Sakura, Zoeterwonde, Países Bajos | 4583 | |
| Omnican F - cánula | Braun, Melsungen, Alemania | 9161502 | |
| Solución salina tamponada con fosfato, PBS | Lonza, Verviers, Bélgica | 4629 | |
| Cloruro de sodio 0,9% | Braun, Melsungen, Alemania | 5/12211095/0411 | |
| Dieta estándar | Altromin, Lage, Alemania | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Países Bajos | 4566 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Alemania | 04-0002 | |
| Equipo | |||
| AIDA Control | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 20 096020 | |
| Filtro de paso de banda | Semrock, Rochester, Estados Unidos | HC 716/40 | |
| Filtro de paso | de banda Semrock, Rochester, Estados Unidos | HC 809/81 | |
| Pinza de biopsia, 3 Fr., 28 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 61071ZJ | |
| Dell Monitor | Dell, Fráncfort del Meno, Alemania | U2412Mb | |
| Funda de examen, 9 Fr.Karl | Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 61029D | |
| Funda de examen, 9 Fr.Karl | Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 61029C | |
| Cable de luz de fibra óptica, 3,5 mm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 69495NL | |
| Azul fluoresceína Sistema de filtrado | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 20100032 | |
| Filtro de barrera de fluoresceína | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 20100033 | |
| Interruptor de pedal | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 20010430 | |
| Telescopio HOPKINS, 1,9 mm, longitud 10 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 1830231 | |
| SCB D-luz P | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 20 133720 | |
| SCB tricam SL II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 20 2230 20 | |
| Instrumentos de juego de tubos VETPUMP II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 69811 | |
| Tricam PDD PAL | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 20221037 | |
| UniVet Porta | Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Alemania | BKGM 0451 | |
| Vetpump 2 | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemania | 69321620 |
Referencias
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