Este artículo presenta un método basado en la expresión de luciferasa de alto rendimiento para valorar varios virus de ARN y ADN utilizando manipuladores de líquidos automatizados y manuales.
Artículo de método
De Alto Rendimiento La titulación de luciferasa que expresan virus recombinantes
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Resumen
Resumen
Los ensayos de placa estándar para determinar los títulos virales infecciosos pueden llevar mucho tiempo, no son susceptibles a un gran volumen de muestras y no se pueden realizar con virus que no forman placas. Como alternativa a los ensayos de placa, hemos desarrollado un método de valoración de alto rendimiento que permite la valoración simultánea de un gran volumen de muestras en un solo día. Este enfoque implica la infección de las muestras con un virus marcado con luciferasa Firefly, la transferencia de las muestras infectadas a una línea celular permisiva adecuada, la posterior adición de luciferina, la lectura de placas para obtener lecturas de luminiscencia y, finalmente, la conversión de luminiscencia a títulos virales. La evaluación de la citotoxicidad mediante un colorante de viabilidad metabólica puede incorporarse fácilmente al flujo de trabajo en paralelo y proporcionar información valiosa en el contexto de un cribado de fármacos. Esta técnica proporciona un método fiable y de alto rendimiento para determinar los títulos virales como alternativa a un ensayo de placa estándar.
Introducción
Los ensayos clásicos de placas virales siguen siendo un pilar en la investigación de virus, a pesar de que pueden llevar mucho tiempo y constituyen un importante cuello de botella para obtener resultados de los experimentos. Han surgido métodos de cuantificación indirecta de virus más rápidos, como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), ELISA y la citometríade flujo 1-4. Innovaciones recientes, como el contador de virus Virocyt, pueden contar virus directamente utilizando tecnología avanzada de clasificación de flujo y a través de una combinación de proteínas y colorantes de ADN/ARN5. Si bien todos estos métodos sin duda han acelerado el ritmo de la investigación de virus, cada método tiene sus ventajas e inconvenientes. Por ejemplo, la qPCR puede permitir la cuantificación de una secuencia específica del genoma viral, pero no puede discriminar eficazmente los viriones infecciosos de los defectuosos6. Los ELISA pueden ser muy específicos, sin embargo, requieren un anticuerpo adecuado contra la proteína viral diana deseada y pueden ser muy costosos. Si bien la tecnología de citometría de flujo ofrece muchas ventajas y ha mejorado significativamente, el rendimiento y la accesibilidad a equipos altamente especializados siguen siendo un obstáculo. Es importante destacar que todas estas técnicas no son ideales para el cribado de alto rendimiento, para lo cual la facilidad y el tiempo necesarios para la etapa de cuantificación del virus son de vital importancia.
Aquí describimos una técnica de alto rendimiento y fácilmente automatizable para titular virus que expresan un transgén de luciferasa de luciferasa luciérnaga (Fluc). Este método genera títulos virales aproximados en una muestra de prueba basados en lecturas de señales de luminiscencia mediante el uso paralelo de una curva estándar de cantidades conocidas de virus. Las muestras que contienen cantidades desconocidas de virus que expresan luciferasa se transfieren a una línea celular de "plaqueo" permisiva en paralelo con la curva de dilución estándar del virus y la luminiscencia asociada al virus se lee después de unas horas de tiempo de incubación. Esto permite la generación de resultados rápida, cuantitativa y, a menudo, en el mismo día, a diferencia de los protocolos clásicos de ensayo de placa, que suelen requerir varios días de incubación para contar manualmente las placas visibles7-9.
El protocolo describe los pasos de nuestro método de valoración utilizando el virus de la estomatitis vesicular oncolítica que codifica un transgén Fluc (VSV∆51-Fluc) como ejemplo y proporciona una visión general de 1. Preparación de la muestra 2. El recubrimiento de una línea celular permisiva para la titulación de virus utilizando un dispensador automático 3. La preparación de la curva estándar viral 4. La transferencia de los sobrenadantes de la muestra a la línea celular permisiva utilizando una pipeta manual de 96 pocillos 5. La evaluación de la citotoxicidad de la muestra utilizando un reactivo de viabilidad celular 6. La preparación del sustrato de luciferina 7. Lectura de bioluminiscencia y 8. Análisis de datos.
Protocolo
1. Preparación de muestras
- Obtener muestras que contienen luciferasa que expresa el virus (en el presente documento VSVΔ51-Fluc como ejemplo) para la titulación y la transferencia en placas de 96 pocillos. Alternativamente, realizar infecciones en placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos y sobrenadantes de uso directamente.
- Deja dos columnas no tratados para la inclusión de las curvas de calibración. Para experimentos realizados directamente en placas de 96 pocillos, título al final del experimento (40 horas después de la infección) o almacenar a -80 ° C y el título en una fecha posterior.
2 Preparación de células permisivas para la titulación del virus
- 24 horas antes de la titulación, preparar una suspensión de células Vero a una concentración de 2,5 x 10 5 células / ml en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 10% de suero fetal bovino (FBS), 30 mM HEPES, y 1% de penicilina / estreptomicina. NOTA: Aunque este protocolo utiliza células Vero, cualquier línea celular permisiva adecuado para la infección por VEV podría abe utiliza.
- Seed 2.5 x 10 4 células (100 l) en sólidas placas de fondo plano de 96 pocillos blancos usando un dispensador de microplacas.
- Preparar 12 ml de suspensión de células por placa, además de 5 ml para el cebado.
- Clean microplaca dispensador de casete mediante el lavado del tubo con 50 ml de agua estéril.
- Llenar las líneas dispensador de microplacas con suspensión de células y dejar 5 ml de suspensión de células fluyen a través.
- Seleccionar un programa que prescindir de 100 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de paredes blancas. Dispense, y repetir según sea necesario para las placas adicionales. También sembrar unos pozos en una placa de fondo plano de 96 pocillos claro si las placas de paredes blancas opacas inferior se utilizan para la verificación de la salud celular y la densidad.
- Cuando haya terminado, las células ras de espalda en el recipiente original. Limpiar el casete mediante la ejecución de 50 ml de etanol al 70% seguido de 50 ml de agua estéril caliente a través de la tubería.
- Asegúrese de cassette y tubo son apcuadamente limpiada entre usos.
- Se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora.
3. Preparación de la curva estándar Viral
- Preparar una curva estándar de VSVΔ51-Fluc en DMEM libre de suero tal que la concentración final de unidades formadoras de placa (pfu) por ml después de la transferencia en células Vero es la siguiente: 10 8 pfu / ml, 10 7 pfu / ml, 10 6 pfu / ml, 10 5 pfu / ml, 10 4 pfu / ml, 10 3 pfu / ml, 10 2 pfu / ml, y 10 1 pfu / ml. Preparar 50 l de cada concentración por placa de células Vero, más un 10% adicional.
NOTA: título del stock de virus luciferasa tendrá que ser evaluado de una manera clásica 10 con el fin de generar una curva estándar que permita una cuantificación absoluta. De lo contrario, la cuantificación relativa se puede lograr sin información precisa título estableciendo arbitrariamente título viral basaen pasos de dilución. Por ejemplo, la primera dilución de la curva estándar se puede establecer en 10 8 unidades virales y la dilución 1/10 a 10 7 siguiente y así sucesivamente. En este contexto, se debe expresar valores como el cambio veces en comparación con una muestra pre-determinado como la cuantificación absoluta no será exacta.
4. Transferencia de sobrenadantes de ejemplo en células permisivas
- Compruebe células Vero en placas en la placa de 96 pocillos de fondo claro con bajo un microscopio de luz para confirmar que las monocapas son al menos el 95% de confluencia.
- Transferir 25 l de muestra de sobrenadante sobre células Vero sembradas en placas de paredes blancas. No transfiera sobrenadantes en las 2 columnas designadas para las curvas de calibración. NOTA: Esto se puede hacer de forma simultánea para todos los pozos en una sola placa usando un manipulador de líquidos de 96 canales.
- Uso de una pipeta multicanal de 8 o 12 canales, añadir 25 l de cada dilución de la curva estándar preparada en la Etapa 3 a las células Vero enlas 2 columnas designadas.
- Centrifugar las placas durante 5 minutos a 430 xg a TA.
- Incubar durante 5 horas a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora.
5. Evaluación de la viabilidad de la célula
- NOTA: Cuando a partir de los sobrenadantes obtenidos a partir de experimentos de infección realizados en placas de 96 pocillos claros, la viabilidad de la muestra se puede evaluar antes de la cuantificación con un colorante indicador de viabilidad celular, tales como resazurina.
- Añadir resazurina en una cantidad igual al 10% del volumen en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de muestras que contienen virus y células. Incluir celular sólo controla así como el control de sólo los medios de comunicación para determinar los valores de 100% y 0% de viabilidad, respectivamente.
- Después de 2-4 horas (tiempo de incubación variarán dependiendo del tipo celular y de la concentración de polvo del colorante disponible comercialmente o reconstituida), leer y grabar la señal usando un lector de placas de fluorescencia (530-560 de excitación, 590 de emisión). Informe viabili celularTy para una muestra de acuerdo a la fórmula relativa Actividad Metabólica = ((señal de muestra de prueba - señal de control negativo) / (célula única señal de control - señal de control negativo)) x 100%
6. Preparación del sustrato luciferina
- 30 min antes del final de la incubación de 5 h, preparar la luciferina para obtener una solución / ml 2 mg en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Preparar 2,5 ml por placa, más un extra de 2 ml. Proteja la solución de la luz. NOTA: La luciferina también se puede preparar antes en el día y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
7. Reading bioluminiscencia
- Después del período de incubación de 5 h, se añaden 25 l de luciferina a cada pocillo de células Vero en las placas de sólido blanco. Añadir luciferina de forma manual o con un dispensador automático integrado en el luminómetro. NOTA: El uso de un instrumento con sólo un único punto y final lee puede requerir la adición de una luciferasa buf lisis compatiblefer antes de añadir el sustrato luciferina para mejorar la consistencia.
- Leer las placas con los siguientes parámetros:
- Agitar durante 5 seg.
- Espere 30 seg.
- Leer luminiscencia a un valor apropiado de sensibilidad / exposición fija. Si la opción está disponible en el instrumento, utilice múltiples puntos lee (por ejemplo, 3 x 3 de la matriz) para mejorar la precisión.
- Grabar y guardar la intensidad bioluminiscente cuantificado.
- Si se utilizó un dispensador automático para agregar luciferina purgar la luciferina y cebar las líneas con agua estéril tibia.
Análisis de datos 8.
- Para obtener resultados precisos, resolver la regresión no lineal para generar una ecuación de Hill partir de las curvas estándar. Aplicar esta ecuación para las muestras tituladas para calcular unidades de expresión virales. Algunos virus o situaciones pueden producir una curva estándar con una relación lineal; en este caso, para resolver una ecuación lineal.
Resultados
Un resumen del flujo de trabajo que describe el método de alto rendimiento se ilustra en la Figura 1. Figura 2 muestra los resultados de una curva estándar típica ofVSVΔ51-Fluc. De cuatro parámetros análisis de regresión no lineal genera una parcela colina desde la que desconocido pfu de entrada (estimación de la titulación viral) se puede interpolar. Estos títulos estimados se denominan unidades de expresión virales (VEU). Figura 3A muestra Veus y los títulos obtenidos mediante la realización de un ensayo de placa estándar con las mismas muestras 10. Las muestras procedían de un experimento en el que se utilizaron diversos productos químicos para mejorar la replicación y propagación de VSVΔ51-Fluc en 786-0 células. Veus interpolados a partir de la curva estándar debe ser multiplicado por un factor que se basa en la dilución de los sobrenadantes de la muestra que se transfiere a las células Vero (en este caso, el factor de dilución es 5). La correlación lineal entre los títulos y VEU se muestra en la Figura 3B Con un R 2 de 0,8083 y la puntuación r de Pearson de 0,899 (p <0,0001). En la Figura 4, los datos de citotoxicidad celular típicos obtenidos a partir de un ensayo metabólico se muestra para 786-0 células tratadas con productos químicos antes de la infección con VSVΔ51-Fluc. Finalmente, la Figura 5 muestra curvas típicas estándar obtenidos con diversos virus (virus del herpes simple (HSV), virus vaccinia, y virus adeno-asociado (AAV), todos expresar luciferasa de luciérnaga) y describe tiempos de incubación y los ciclos de congelación-descongelación, según se requiera.
Figura 1 Flujo de trabajo de titulación de virus de alto rendimiento y ensayo de citotoxicidad usando VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 x 10 4 células Vero por pocillo (100 l) y se incuba a 37 ° C. (B) 24horas más tarde la transferencia de 25 l de curva estándar en que las células Vero (2 columnas por placa). (C) Transferencia de 25 l de muestras que se tituló a células Vero restantes. Placas de centrífuga y se incuban a 37 ° C. (D) en una cantidad igual al 10% del volumen en el pozo, añadir reactivo resazurina a la placa que contiene las muestras originales. Incubar las placas a 37 ° C. (E) Después de 3 horas, leer y registrar la fluorescencia y evaluar la citotoxicidad. (F) Después de 5 horas, se añaden 25 l de solución de 2 mg / ml de luciferina a cada pocillo de células Vero. Leer la luminiscencia y calcular unidades de expresión viral.
Figura 2. esperada curva estándar de VSV Δ 51-Fluc. Expresión de luciferasa era yoasured 5 hr post transferencia sobrenadante en cinco puntos diferentes dentro de un pocillo utilizando un luminómetro y la bioluminiscencia se expresó en unidades relativas de luz (RLU promedio). La media de RLU se representó frente de entrada conocida pfu / ml para resolver la regresión no lineal y generar una ecuación de Hill. El promedio de dos curvas en paralelo y barras de error estándar se muestra (r 2 = 0.9993).
Figura 3 Comparación de los títulos de ensayo de placa estándar con los obtenidos por el método de alto rendimiento. (A) Los títulos virales en pfu / ml obtenida por ensayo de placa estándar en células Vero se compararon con los títulos virales calculados (VEU / ml) de las mismas muestras tituladas utilizando el ensayo de luciferasa de alto rendimiento. (B) relación lineal entre VEU / ml y el título obtenerse a través de p estándarensayo laque. Se muestran curva de regresión lineal y el coeficiente de determinación (R 2).
Viabilidad de la muestra antes de la transferencia sobrenadante sobre células Vero se determinó mediante la evaluación de la actividad metabólica celular utilizando una solución de resazurina disponible comercialmente Figura 4 Muestra viabilidad.. Valores de fluorescencia primas se normalizaron a la de los pozos no tratados, no infectados.
Figura 5. esperado curvas estándar con HSV, vaccinia, y virus de AAV. La expresión de luciferasa se midió en cinco puntos diferentes dentro de un pocillo utilizando un luminómetro y la bioluminiscencia se expresó en rela mediastivas unidades de luz (RLU). (A) curva estándar HSV se añadió a las células Vero plateado 24 horas antes a una densidad de 2,5 x 10 4 células por pocillo (100 l) y la medición de la luciferasa se realizó 17 h después de la transferencia sobrenadante (R 2 = 0,9489, n = 1). Una ecuación de Hill fue generado mediante la resolución de la regresión no lineal. Curva estándar (B) Vaccinia se añadió a las células Vero chapado 24 hr antes una densidad de 2,5 x 10 4 células por pocillo (100 l) y se incubaron durante 2,5 horas a 37 ° C, después de lo cual se tomaron mediciones de luciferasa (R 2 = 0,9892). Una ecuación lineal fue generada por resolver para la regresión lineal. (C) de AAV curva estándar se añadió a las células de carcinoma de pulmón humano (A549) chapado en 24 horas antes a una densidad de 2,5 x 10 4 células por pocillo (100 l) y la medición de la luciferasa se hizo 24 horas después de la infección. Una ecuación de Hill fue generado mediante la resolución de la regresión no lineal. El promediode se muestran cinco curvas en paralelo y barras de error estándar (R 2 = 0.9926).
Discusión
El enfoque basado en la luciferasa descrito aquí ofrece un número de ventajas sobre otros métodos existentes incluyendo su facilidad, rapidez, mínima necesidad de equipo, y relativamente bajo costo. Un elemento clave para esto es la evitación de un paso de dilución en serie. Sin embargo, los derivados basados en dilución de serie de este protocolo son ciertamente factible y se usaron recientemente para evaluar los títulos de Ébola luciferase-expresando en una pantalla antiviral de alto rendimiento 11. Mientras inherentemente más lento y más caro, estas adaptaciones pueden proporcionar un mayor rango dinámico para la cuantificación viral cuando es necesario. Además de ser particularmente adecuado para la evaluación de los títulos virales en el contexto de las pantallas de alto rendimiento, nuestro método de cuantificación viral basado en un solo paso de la luciferasa genera estimaciones precisas de viriones infecciosos en el caso de la replicación de los virus. Además, las lecturas de luminiscencia junto con los datos de citotoxicidad del mismo experimento dan una másimagen completa del efecto de las condiciones experimentales en las células diana, que es particularmente útil en el contexto de los virus oncolíticos y pantallas de drogas.
El ejemplo ilustrado aquí utiliza un virus de ARN de una sola hebra negativa en replicación; Sin embargo, este protocolo se puede adaptar a un número de replicar y no replicante virus con unos pocos ajustes menores de protocolo. Esto incluye virus de ADN tales como vaccinia, HSV, y AAV (véase la Figura 5). Las muestras infectadas con virus intracelulares, tales como virus de la vacuna, por ejemplo, requieren un paso de liberación de virus antes de la cuantificación (por ejemplo, al menos un ciclo de congelación-descongelación). Cuando se aplica esta técnica a otros virus, es necesario para optimizar el tiempo de incubación de la transferencia del sobrenadante viral o lisado a la lectura de las placas por el luminómetro. Este parámetro dependerá principalmente en el ciclo de replicación del virus en la línea celular permisiva y la fuerza de la promoter conducir la expresión de luciferasa. Esto se hace mejor mediante el uso de la curva estándar completo en la etapa de optimización. Para hacer esto, uno debe infectar la línea celular permisiva apropiado con varios repeticiones de la curva estándar preparada y leer cada repetición en un momento en diferentes puntos después de la transferencia. Idealmente, se elige un punto de tiempo de incubación que conduce a una relación lineal entre log (RLU) y log (título) que abarca el rango de la muestra título esperado. Para VSVΔ51-Fluc, esto es típicamente de 10 4 pfu / ml -10 7 pfu / ml durante un tiempo de incubación de 5 h. Si se espera que los títulos más bajos o más altos a partir de muestras, uno puede simplemente aumentar o reducir el tiempo de incubación, respectivamente. Alternativamente, las muestras pueden ser diluidas a caer dentro de la gama mucho como se hace normalmente para ELISA.
Como se mencionó anteriormente, este método es muy adecuado para realizar pantallas de alto rendimiento de medicamentos utilizando bibliotecas de drogas como la mayoría de los pasos se pueden automatizar. Las células se pueden sembrar efficiently usando un dispensador de microplacas automatizado, la biblioteca de fármacos se puede añadir usando un manipulador de líquidos de 96 canales, el virus se puede añadir usando un dispensador de microplacas y placas de leer usando un luminómetro automatizado. En teoría, esto también se puede adaptar a 384 pocillos o formatos más pequeños; Sin embargo, la limitación a este fin es el número de células que pueden sembrarse, menos células dadas conduce a un rango más estrecho en la linealidad de la LOG (RLU) a LOG (título) relación. Finalmente, la evaluación de la viabilidad celular usando la resazurina o otros colorantes metabólicos se puede incorporar fácilmente en el flujo de trabajo, lo que permite la discriminación de compuestos citotóxicos en las pantallas de antivirales o la identificación de compuestos que conducen a la muerte sinérgica en combinación con virus 12. Sin embargo, las limitaciones de este método incluyen el requisito de un virus transgén que expresa luciferasa, que no siempre es posible, y la disponibilidad de una línea celular permisiva suficientemente. Sin embargo, es probable posible adaptarel método para su uso con otros genes informadores (por ejemplo, GFP) proporcionó el método de cuantificación reportero tiene una linealidad adecuado y relación señal a ruido. En general, el método de alto rendimiento descrito puede ser modificado para adaptarse a muchos virus diferentes y adaptarse a diversas aplicaciones.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Vanessa Garcia está financiada por una beca de posgrado Queen Elizabeth II Ontario en Ciencia y Tecnología y Cory Batenchuk por una beca del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio de águila modificado de Dulbeccos (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Suero fetal bovino | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare una solución de 1 mM, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferina sal de potasio | Biotium | 10101-2 | |
| Poliestireno blanco sólido de fondo plano de 96 pocillos Microplacas tratadas con TC | Corning | 3917 | Las placas de 384 pocillos también se pueden utilizar para un mayor rendimiento |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Lector de microplacas monocromador |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | sistema de pipeteo manual de 96 puntas |
| Liquidator96 LTS Puntas esterilizadas con filtros | Mettler Toledo | LQR-200F | Cualquier punta filtrada estéril compatible con las pipetas de elección es apropiada |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Se utiliza para recubrir células en una placa de 96 pocillos |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Fluorímetro de microplaca |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
