Las células globoides son una característica patológica definitoria de la enfermedad de Krabbe, una leucodistrofia que actualmente carece de una terapia efectiva a largo plazo. Hemos desarrollado un modelo de cultivo celular para estudiar la biología innata y el potencial patogénico de la microglía activada y su transformación en células globoides.
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Artículo de método
Un In Vitro Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular
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Resumen
Resumen
La función precisa de la microglia multi-nucleado, llamadas células globoides, que son únicamente abundantes en el sistema nervioso central de leucodistrofia de células globoides (GLD) no está clara. Esta brecha en el conocimiento se ha visto obstaculizado por la falta de un adecuado modelo in vitro para el estudio. Aquí se describe un sistema de cultivo glial murino primaria en el que el tratamiento con resultados psicosina en multinucleación de microglia se asemejan a las células globoides característicos encontrados en GLD. El uso de este novedoso sistema, se definieron las condiciones y modos de análisis para el estudio de las células globoides. El uso potencial de este sistema modelo fue validado en nuestro estudio anterior, que identificó un posible papel de metaloproteinasas de matriz (MMP) -3 en GLD. Este novedoso sistema in vitro puede ser un modelo útil para estudiar la formación y función, sino también el potencial manipulación terapéutica, de estas células únicas.
Introducción
Leucodistrofia de células globoides (GLD), también conocida como enfermedad de Krabbe, es una enfermedad desmielinizante fatal resultante de la pérdida de mutaciones de función en el galatocerebrosidase (GALC) gen 1. La forma más frecuente de GLD es la variante infantil, que se caracteriza por un inicio en la primera infancia y se caracteriza por un curso clínico agresivo del motor y el deterioro cognitivo que conduce a la muerte prematura a menudo antes de los cinco años de edad 2,3. Las pruebas genéticas se utiliza para verificar el diagnóstico de GLD 4. Neuropatología de GLD revela desmielinización generalizada, atrofia neuronal, a....
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Política de Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio establecidos por la Oficina de Laboratorio Animal Welfare (NIH) y sólo con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Connecticut Health Center.
1 Preparación de mezcla de culturas gliales
- Esterilice todos los instrumentos antes de su uso. Añadir 3 ml de solución enfriada con hielo estéril salina equilibrada de Hank (HBSS) que no contiene cationes (Mg2 + o Ca2 +) a tres estériles 60 mm placas de Petri mantenidas en hielo para....
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Resultados
Este protocolo, como está escrito, se espera que tome aproximadamente 36 días para completar de principio a fin (Ver Figura 1: Esquema de flujo de trabajo experimental). Ha sido nuestra experiencia que el desarrollo de células globosas-como "en este sistema de cultivo primario es a la vez fiable y reproducible: la formación de células multinucleadas en respuesta a psicosina se observó consistentemente con 7 días de tratamiento.
La tinción inmunocitoquímica de microglia utili.......
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Discusión
El protocolo descrito en el presente documento proporciona un nuevo sistema modelo para estudiar el desarrollo y la caracterización funcional de microglia activadas y células globoides. Antes de trabajo por Im et al. utilizando una línea celular HEK293 proporciona un modelo para el desarrollo del presente protocolo para el estudio de la formación de células globosas 21. También es importante señalar que las células globoides derivados en el modelo se diferencian de las células globoides nativos ident.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (RG 5001-A-3 a S.J.C.), los Institutos Nacionales de Salud (NS065808 a E.R.B.; NS078392 a S.J.C.), fondos iniciales del Centro de Salud de UConn (a SJC) y el Fondo de la Familia Kim (UCHC en apoyo de K.I.C.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Hank' s solución salina equilibrada (HBSS) que no contiene cationes (Mg2+ y Ca2+). | Life technologies | 14175-095 | |
| Kit de disociación de tejido neural | Miltenyi | 130-092-628 | |
| 40 μ m filtro de celdas | Fisherbrand | 22363547 | |
| Hank' s solución salina equilibrada (HBSS) que contiene cationes (Mg2+ y Ca2+). | Gibco | 14025-092 | |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| suero fetal bovino (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Penicilina/estreptomicina | Life technologies | 15070-063 | |
| Laminina | Sigma | L2020 | |
| Solución de tripsina-EDTA Tecnologías | de la vida | 25299-056 | |
| Psychosine | Sigma | P9256 | |
| Dimethyl sulfóxido (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehído (PFA) | Microscopía electrónica Science | 19208 | |
| Suero normal de cabra (NGS) | Invitrogen | PCN5000 | |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 | |
| Alexa Fluor conjugado antisera | Life Technologies | Varios | |
| medios de montaje | Southern Biotech | OB100-01 | |
| Kit de ensayo fagocítico | Cayman Chemicals | 500290 | |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
Referencias
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al.
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Reimpresiones y permisos
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