Proteína Aislamiento del desarrollo embrionario del corazón del ratón Válvula Región

Resumen

El análisis de la expresión de proteínas en válvulas de ratones embrionarios jóvenes se ha visto obstaculizado por el limitado tejido disponible. Este manuscrito proporciona un protocolo para la preparación de proteínas a partir de regiones de válvulas de ratón embrionarias en desarrollo para el análisis de Western blot.

Resumen

Western blot es una técnica comúnmente empleada para detectar y cuantificar los niveles de proteínas. Sin embargo, en el caso de muestras de tejido pequeñas, este método de análisis puede no ser lo suficientemente sensible como para detectar una proteína de interés. Para superar estas dificultades, examinamos los protocolos para obtener proteínas de válvulas cardíacas humanas adultas y modificamos estos protocolos para los homólogos embrionarios tempranos en desarrollo. En resumen, las regiones de la válvula aórtica embrionaria de ratón, incluida la válvula aórtica y la pared aórtica circundante, se recogen en el volumen mínimo posible de un tampón de lisis basado en Tris con inhibidores de la proteasa. Si es necesario en función de la estrategia de cría, los embriones se genotipifican antes de agrupar cuatro regiones de la válvula aórtica embrionaria para su homogeneización. Después de la homogeneización, se utiliza un tampón de muestra basado en SDS para desnaturalizar la muestra para ejecutarla en un gel SDS-PAGE y el posterior análisis de Western blot. Aunque la concentración de proteínas sigue siendo demasiado baja para cuantificarla mediante ensayos espectrofotométricos de cuantificación de proteínas y queda muestra para análisis posteriores, esta técnica puede utilizarse para detectar y semicuantificar con éxito proteínas fosforiladas mediante Western blot a partir de muestras agrupadas de cuatro regiones embrionarias de la válvula aórtica de ratón de día 13,5, cada una de las cuales produce aproximadamente 1 μg de proteína. Esta técnica será beneficiosa para estudiar la activación de la vía de señalización celular y los niveles de expresión de proteínas durante el desarrollo temprano de la válvula embrionaria del ratón.

Introducción

Ser capaz de identificar y cuantificar los niveles de expresión de proteínas es una técnica estándar para animal- y los experimentos basados ​​en células. Sin embargo, a pesar de un interés de larga data en el desarrollo de la válvula cardíaca embrionaria temprana, la evaluación de la expresión de proteínas en este tejido específico durante el desarrollo se limita actualmente a la inmunohistoquímica en tanto el pollo y ^1,2 ratón. Parte de la dificultad de cuantificar la expresión de proteínas en las válvulas de desarrollo de la mayoría de organismos modelo (por ejemplo, de pollo y de ratón) es el pequeño tamaño de las válvulas, lo que limita la cantidad de proteína que se puede obtener. Por lo tanto, para los análisis cuantitativos, los investigadores normalmente se basan en la extracción de ARN y amplificación por PCR cuantitativa posterior o el análisis de microarrays ^2-5. Sin embargo, los niveles de expresión de ARN y proteínas no son del todo correlativa ^6, por lo que se centra en la expresión del ARN no pueden dar una explicación rigurosa de los numerosos cambios que se producen en cualquier señalización dadavía en varias ocasiones durante la evolución. Sobre la base de este límite en la metodología actualmente disponible, el objetivo de este procedimiento fue desarrollar un protocolo para la obtención fiable de cantidades suficientes de proteína a partir de las regiones de la válvula cardiaca de embriones de ratón en desarrollo para el análisis cuantitativo de los cambios que se producen en diversas vías de señalización que son importantes en la maduración de este tejido.

Válvulas embrionarias son ya comúnmente disecados de los ratones para el aislamiento de ARN y análisis de expresión génica posterior ^2-5. Sin embargo, estos estudios se han limitado a la utilización de la expresión génica como una lectura de salida de activación de la vía de señalización, que no permite la detección de detectar proteínas modificaciones post-traduccionales que pueden afectar a la señalización aguas abajo. Utilizando las técnicas de aislamiento de ARN como punto de partida, comenzamos con la disección de las regiones de interés. Debido a que nuestro interés se detecta proteínas fosforiladas que eran indicativos de pat señalizaciónhway actividad durante un período específico de desarrollo de la válvula aórtica (E13.5-14.5), que realiza todas las disecciones en tampón Tris-fosfato libre y se recogió las válvulas en un tampón de lisis a base de Tris con inhibidores de fosfatasa y proteasa. En nuestro caso específico, sólo se recogieron las regiones de la válvula aórtica, pero la región de la válvula pulmonar podrían obtenerse fácilmente al mismo tiempo. Las regiones de la válvula fueron entonces homogeneizada y combinado con un tampón de muestra que se utiliza actualmente para estudiar la expresión de proteínas en las válvulas cardiacas adultas ^7. Mediante el uso de pequeños volúmenes de muestra (por ejemplo, 2 l) y puesta en común de las regiones de la válvula a partir de embriones con el mismo genotipo, hemos sido capaces de detectar las proteínas fosforiladas y no fosforilada en el día embrionario 13.5 ^8. Debido a que las regiones de válvula pueden ser congelados y almacenados en tampón de lisis, los embriones pueden ser genotipados si es necesario antes de la puesta en común.

Esta técnica amplía el conjunto de herramientas que están disponibles para evaluar signalin celularg vías durante el desarrollo y ofrece un cumplido cuantitativa de inmunohistoquímica, específicamente para las válvulas cardíacas en desarrollo. Esta técnica debe ser de beneficio no sólo para los cardiólogos de desarrollo, sino también a todos los biólogos del desarrollo que trabajan con embriones en fase inicial están interesados ​​en regiones que contienen tejido limitado.

Protocolo

NOTA: Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.

1. Impuestos Especiales de la válvula aórtica

1. Usando una técnica de eutanasia aprobadas para la etapa embrionaria de interés, la eutanasia a un ratón embarazada con cachorros en el día embrionario deseado (E) del desarrollo.
2. Utilice 70% de etanol para esterilizar el abdomen de la hembra embarazada. Levante la piel y los músculos de la parte inferior del abdomen hacia arriba y lejos de los órganos internos, y disecar la cavidad abdominal inferior Open femenino para permitir el acceso a la trompa uterina.
3. Para recuperar el cuerno uterino, mantenga el cuello del útero con una pinza y caudal cuidadosamente cortado al fórceps. Levante el cuerno uterino, cortar cualquier tejido conectivo que mantiene la bocina en su lugar, y completar la eliminación mediante la reducción de la unión de la trompa uterina con el oviducto.
4. Coloque el cuerno uterino diseccionado en una placa de Petri que contiene cold 0,1 M de tampón Tris (pH 7,6) y enjuague según sea necesario. A continuación, cortar el cuerno uterino en sentido longitudinal para exponer los sacos embrionarios abierta.
5. Para exponer el embrión, cortar y abrir un saco embrionario en la unión de la placenta y el embrión y cortar los vasos umbilicales para liberar el embrión. Coloque el embrión diseccionado en un segundo plato de Petri con frío tampón Tris 0,1 M. Devuelva la primera placa de Petri con los restantes embriones no seccionada a hielo hasta que esté listo para el próximo embrión.
6. Para mejorar el acceso de la pared torácica en el embrión, decapitar al embrión. Si genotipado es necesario, retire y guarde un pedazo de tejido extra en un tubo Eppendorf se colocó en hielo.
7. Coloque el embrión en su parte posterior, y cortar la pared torácica verticalmente a lo largo del lado de la caja torácica, cerca de una extremidad anterior, y horizontalmente por encima del diafragma para visualizar el corazón. Luego, abrir la pared torácica para exponer el corazón.
8. Con unas pinzas para mantener en alto a lo largo de los grandes vasos, levantar el corazón con unas pinzas y cortar los vasos debajo. Eln, corte por encima de la pinza para liberar el corazón. Si los vasos pulmonares permanecen sin cortar, los pulmones se pueden eliminar con el corazón y deben ser removidos antes de continuar.
9. Corte y retire la arteria pulmonar por encima del nivel de la válvula; en las etapas embrionarias descritos en este documento, la arteria pulmonar es ligeramente opaca, que ayuda en su discriminación de la región de la válvula. Corte justo debajo de la válvula pulmonar, evitando el miocardio ventricular trabeculado y recoger como se describe en el paso 1.10 si esta región es también de interés. Aquí y en la siguiente etapa, usar la acción capilar para extraer el exceso de tampón Tris lejos de la región de interés antes de la recogida en tampón de lisis.
10. Retire cuidadosamente la aorta distal a la válvula aórtica, justo por encima del nivel de la válvula; como la arteria pulmonar, la aorta se mantiene ligeramente opaca en estas etapas embrionarias, ayudar en su eliminación. Corte justo debajo de la válvula aórtica, evitando de nuevo el miocardio ventricular trabeculado, y transferir elválvula usando fórceps a un tubo Eppendorf con tampón de lisis 2 l (descrito en la Tabla de Materiales) que contiene inhibidores de la proteasa y fosfatasa en hielo.
11. Repetir los pasos 1.6 a 1.10 hasta que las válvulas han sido extirpados de todos los embriones, la recogida de cada válvula en un tubo Eppendorf separado. Si todos los embriones tienen el mismo genotipo, todas las válvulas pueden ser recogidos en un solo tubo Eppendorf.
12. Si el genotipado se va a realizar para determinar qué válvulas para agrupar juntos, colocar inmediatamente las muestras en tampón de lisis a -80 ° C hasta su uso posterior. Las muestras pueden luego ser agrupados después de genotipado (etapa 2.1.1).

Extracción 2. Proteína

1. Descongele tejidos recogidos en el hielo y se centrifuga a 13.100 xg durante 1 min para recoger los tejidos en tampón de lisis en la parte inferior del tubo.
   1. Si se genotipo embriones, utilizar una pipeta para recoger suavemente y tampón piscina lisis que contiene las regiones de la válvula a partir de embriones con genotipos similares. Para asegurar una fuerte by, la puesta en común 3-4 regiones de la válvula a partir de embriones E13.5 se recomienda por muestra.
   2. Si todos los embriones eran de la misma genotipo y todas las regiones de la válvula se recogieron juntos en el paso 1.10, lisar toda la muestra, como se describe en el Paso 2.2.
2. Compruebe el volumen de la muestra agrupada resultante y añadir tampón de lisis hasta un volumen total de 40 l; entonces, desarticular y homogeneizar muestras usando 5 mm bolas de acero inoxidable en tubos Eppendorf. Operar el Lyser durante 2-4 min a 50 Hz, según las instrucciones del fabricante. Centrifugar los tubos brevemente, (~ 13.100 xg durante 1 min), y transferencia de muestras a tubos nuevos, dejando atrás los restos insolubles.
3. Preparar y muestras separadas para SDS-PAGE y transferencia de Western blot posterior, siguiendo un protocolo como Eslami et al ^9. Secante para una proteína de control de carga es esencial para la cuantificación de proteínas.

Resultados

Utilizando esta técnica de preparación, hemos sido capaces de detectar fosforilados Smad ^1,5,8 (pSmad) en las regiones de la válvula aórtica individuales de E13.5 embriones. Como se muestra en la Figura 1A, la proteína aislada de incluso una sola región de la válvula es suficiente para detectar una banda pSmad débil. Intensidad de la señal aumenta proporcionalmente con el número de regiones de la válvula que se agruparon. Es importante destacar que la relación pSmad / β-actina se mantiene cas...

Discusión

La capacidad de cuantificar los niveles de proteína a principios de embriones de ratón y Chick regiones válvula cardíaca proporciona una herramienta adicional para la comprensión de los eventos de señalización celular críticas para el desarrollo de la válvula. Nuestro protocolo descrito en este documento no difiere en gran medida de los procedimientos de aislamiento de proteínas convencionales. Sin embargo, mediante la modificación de algunas medidas clave, que hemos obtenido con éxito proteínas fosforiladas desde muy p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
		embarazada cronometrada	Para ser diseccionada en la etapa embrionaria de interés
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
Microtijeras	Fine Science Tools	15003-08
Pinzas finas, #5	Fine Science Tools	11251-30
Aguja de disección tenedores	Ted Pella Inc.	13560
Agujas de disección	Ted Pella Inc.	13561-10
Micropipeta, 20 μ l, con puntas
Tampón			50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	Añadir 1 comprimido a 10 ml tampón de lisis
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Perlas de acero inoxidable	Microcentrífuga