La neurotoxina botulínica es una de las toxinas más potentes entre los agentes de bioamenaza de categoría A, sin embargo, no se dispone de una terapéutica posterior a la exposición. El enfoque de imágenes de alto contenido es una metodología poderosa para identificar nuevos inhibidores, ya que permite el cribado multiparamétrico utilizando neuronas motoras biológicamente relevantes, el objetivo principal de esta toxina.
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Artículo de método
Un alto contenido de imágenes de Ensayo para la Identificación de la neurotoxina botulínica Inhibidores
En este artículo
Resumen
Resumen
La proteína-25 asociada al sinaptosómico (SNAP-25) es un componente del complejo soluble del receptor de proteína de unión NSF (SNARE) que es esencial para la liberación de neurotransmisores sinápticos. La neurotoxina botulínica serotipo A (BoNT/A) es una metaloproteasa de zinc que bloquea la exocitosis del neurotransmisor mediante la escisión del componente SNAP-25 del complejo SNARE. Actualmente no existen medicamentos autorizados para tratar la intoxicación por NTBo/A después de la internalización de la toxina por las neuronas motoras. El desarrollo de medidas terapéuticas eficaces para contrarrestar la intoxicación por NTBo/A ha sido limitado, debido en parte a la falta de ensayos sólidos de alto rendimiento para el cribado de bibliotecas de moléculas pequeñas. En este trabajo describimos un ensayo de imagen de alto contenido (HCI) útil para la identificación de inhibidores de la NTBo/A. Los esfuerzos iniciales de optimización se centraron en mejorar la reproducibilidad de los resultados entre placas en múltiples experimentos independientes. Se descubrió que la automatización de la inmunotinción, la adquisición y el análisis de imágenes aumentaba la consistencia del ensayo y minimizaba la variabilidad, al tiempo que permitía la evaluación multiparamétrica de compuestos experimentales en un sistema de neuronas motoras murinas.
Introducción
La bacteria Clostridium botulinum produce la neurotoxina botulínica, una de las toxinas biológicas más potentes conocidos por el hombre 1. Hay 7 diferentes serotipos de BoNT (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induce parálisis en la unión neuromuscular debido a la proteolisis complejo SNARE 2,3. SNARE proteolisis evita neurotransmisor-vesícula de la membrana de fusión y por lo tanto bloquea la exocitosis de neurotransmisores 4. El objetivo SNARE específica depende del serotipo particular, BoNT involucrado en el proceso de intoxicación. BoNT / A y BoNT / E escinden SNAP-25 mientras que escinde BoNT / C ambos SNAP-25 y sintaxina 5.....
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Protocolo
Placa 20000 diferenciado células ES de ratón (MES) / pocillo en placas de 96 una lisina recubiertos con poli-D así y mantener en la neurona motora medios diferenciación terminal durante 5-7 días.
Administración 1. El compuesto y la intoxicación con BoNT / A
Lleve a cabo todos los trabajos siguientes en un recinto BSL2 para mantener el cumplimiento con las pautas de los CDC / NIH.
- Preparar soluciones madre 10 mM de cada compuesto de la biblioteca en 100% de DMSO en placas de 96 pocillos de polipropileno. Utilice el stock de 10 mM para preparar una placa de dilución intermedia que es 10 veces mayor qu....
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Resultados
Los datos de los controles alto y bajo crearon dos poblaciones distintas con la diferencia de dos medianas superiores a 3 desviaciones estándar (Figura 7A). El objetivo del proceso de selección es encontrar los compuestos dentro de la población de la muestra con los valores más cercanos a la población control positivo, suponiendo una distribución normal dentro de la población de la muestra (Figura 7B, (i)). Los puntos de datos que están más allá de 3 desviaciones estándar de la media se.......
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Discusión
La alta potencia de las neurotoxinas botulínicas y la relativa facilidad de su militarización ha dado lugar a su clasificación en la categoría A (la más alta prioridad) agentes biothreat por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. Desafortunadamente, no existen terapias aprobadas por la FDA para contrarrestar BoNT después de la intoxicación por toxina ha sido interiorizado por las neuronas motoras. Cualquier mecanismo druggable que promueve la recuperación neuronal de BoNT intoxicación podría conduc.......
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Divulgaciones
Krishna P Kota es un empleado de Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, que produce instrumentos y software utilizados en este manuscrito. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente los puntos de vista o las políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU., el Departamento de Defensa de los EE. UU., el Departamento del Ejército de los EE. UU. o las instituciones y empresas afiliadas a los autores.
Agradecimientos
La financiación fue proporcionada por la Oficina Conjunta de Ciencia y Tecnología - Defensa Química Biológica (JSTO-CBD), la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa (DTRA) bajo el número de proyecto patrocinador CCAR# CB3675 y los Institutos Nacionales de Salud (1 R21 AI101387-01 y 5 U01AI082051-05).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Neurotoxina botulínica A | Metabiológicos | NA | Sin número de catálogo |
| Placas de microtitulación | Greiner | 655946 | Placas de poli-D-lisina de 96 pocillos |
| BACs anticuerpo | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Metanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehído | Thermo Scientific | 28908 | |
| Suero de caballo | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini estación de trabajo automatizada | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII anticuerpo de tubulina | R& D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antiratón IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti conejo IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Software de análisis de imágenes | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Lejía Clorox | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| Pila de placas |
Referencias
- Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S.
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Reimpresiones y permisos
