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Artículo de método

Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica Apc Min / + Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal

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⸱

DOI:

10.3791/51916

⸱

6 de octubre de 2014

 ,  , 
1Department of Oncology, INSERM U661, Functional Genomic Institute, 2Department of Anatomy, University of California

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Mediante el uso de ratones reporteros transgénicos y marcadores fluorescentes inyectables, la microscopía confocal de disco giratorio intravital a largo plazo permite la visualización directa del comportamiento de las células mieloides en el adenoma intestinal en el modelo de cáncer colorrectal ApcMin/+.

Resumen

Células mieloides son las células inmunes más abundantes dentro de los tumores y se ha demostrado para promover la progresión tumoral. Técnicas de imagen intravital modernos permiten la observación del comportamiento celular en vivo en el interior del órgano, pero puede ser un reto en algunos tipos de cáncer debido a la accesibilidad de órganos y el tumor tales como intestino. La observación directa de los tumores intestinales no ha sido descrito previamente. Un procedimiento quirúrgico aquí descrito permite la observación directa de la dinámica celular mieloides dentro de los tumores intestinales en ratones vivos mediante el uso de ratones transgénicos reportero fluorescente y trazadores inyectables o anticuerpos. Para este propósito, una de cuatro colores, multi-región, disco giratorio microscopio confocal micro-lensed que permite formación de imágenes continua a largo plazo con una rápida adquisición de la imagen se ha utilizado. APC Min / + ratones que desarrollan múltiples adenomas en el intestino delgado se cruzan con los ratones c-FMS-EGFP para visualizar las células mieloides y con ratones ACTB-ECFPpara visualizar las células epiteliales intestinales de las criptas. También se describen procedimientos para el etiquetado de diferentes componentes tumorales, tales como vasos sanguíneos y neutrófilos, y el procedimiento para el posicionamiento del tumor para formación de imágenes a través de la superficie serosa. Time-lapse películas recopilados de varias horas de proyección de imagen permiten el análisis del comportamiento de las células mieloides in situ en el microambiente intestinal.

Introducción

Evidencia abrumadora ahora demuestra que el microambiente tumoral, que consiste en poblaciones de células heterogéneas, incluyendo fibroblastos, células endoteliales, células inmunes e inflamatorias, matriz extracelular, y factores solubles, juega un papel crucial en la iniciación y progresión de tumores sólidos mediante la contribución a casi todos características del cáncer 1. De hecho, durante la progresión tumoral, hay constantes interacciones dinámicas entre las células cancerosas transformadas y las células del estroma que evolucionan para generar un microambiente favorable a la malignidad 2. Entre las células inmunes que infiltran el microambiente tumoral, las células mieloides son los más abundantes 3. Compuesto de macrófagos asociados al tumor (TAM), células supresoras de origen mieloide (MDSCs), células dendríticas (DC) y los neutrófilos (PMNs), células mieloides son reclutados desde la médula ósea y se infiltran en los tumores progresivamente, liberando citoquinas, factores de crecimiento y proteasas que puede promoverel crecimiento del tumor y se extendió 4. La diafonía entre las células cancerosas y las células mieloides es compleja, pero dinámico. Por lo tanto la comprensión de la naturaleza de sus interacciones es crucial para determinar por qué estas células promueven la progresión del cáncer en lugar de participar en una respuesta inmune anti-tumor, y puede ayudar a encontrar nuevas dianas para controlarla.

La observación directa por microscopía intravital proporciona información sobre la dinámica de células dentro de los tejidos de ratones vivos 5. Un niño de cuatro-color, multi-región, el sistema confocal de disco giratorio micro-lensed fue diseñado para estudiar las células del estroma en los tumores mamarios 6. Este enfoque permite formación de imágenes continuo a largo plazo e incluye varias ventajas, tales como (a) adquisición de imágenes rápidas para minimizar los artefactos de movimiento, (b) la anestesia a largo plazo, (c) adquisición de cuatro colores para seguir diferentes tipos de células, (d) el marcaje fluorescente de diferentes componentes tumorales, y (e) observación de diferentes microambientes tumorales ingeniohin el mismo ratón evitar ratón para 7-9 variabilidad ratón. Con esta tecnología, diferentes comportamientos celulares han sido reportados en el modelo de virus de tumor mamario (MMTV) polioma medio promotor impulsado T oncogén (PYMT) que muestra etapas progresivas de la tumorigénesis. Linfocitos T reguladores (Treg, visualizado por el transgén EGFP Foxp3) migran preferentemente en la proximidad de los vasos sanguíneos que el DCS (CD11c-DTR-EGFP), fibroblastos de carcinoma asociado (FSP1 + / + EGFP) y las células mieloides (c-fms EGFP) exhiben mayor motilidad en la periferia del tumor que dentro de la masa tumoral. En la condición de hipoxia sistémica aguda, las células migraron de manera diferente: Tregs detener la migración en contraste con las células mieloides que continúan mover 6. Además, en el mismo modelo de ratón, se ha demostrado que los cambios de sensibilidad doxorrubicina con el estadio del tumor, la distribución de drogas está relacionada con la respuesta al fármaco, y doxorrubicinatratamiento conduce a la contratación CCR2-dependiente de las células mieloides a los tumores. Por lo tanto, las imágenes en directo también se puede utilizar para obtener información sobre las respuestas de drogas in situ y la biología de la quimio-resistencia 10,11.

Poliposis coli (APC) mutaciones genéticas adenomatosos ocurren comúnmente en los adenomas colorrectales y carcinomas humanos 12 y la mutación de una sola copia de los resultados Apc genes en la poliposis adenomatosa familiar (PAF), que confiere un riesgo extremadamente alto de cáncer de colon 13. La cepa de ratón APC Min / + lleva una mutación en el codón 850 truncamiento del gen APC y se desarrolla de forma espontánea múltiples adenomas intestinales en todo el intestino delgado de 14 16. Intravital de imágenes a largo plazo del intestino es difícil debido a la invasividad del procedimiento, desde la apertura de la cavidad peritoneal es necesaria para el acceso al intestino. Corto plazo de imágenes en vivo studies han sido publicados anteriormente en intestino sano 17,18, pero la observación directa a largo plazo de los tumores intestinales no se ha reportado. Un procedimiento quirúrgico ha sido diseñado y perfeccionado para visualizar tumores a través de la superficie serosa del intestino, usando el sistema de microscopía intravital disco giratorio utilizado anteriormente para los tumores de mama 6,10 imagen. En este trabajo, un protocolo se describe que permite seguir el comportamiento de las células mieloides dentro de los tumores en el intestino delgado mediante el uso de APC Min / + ratones.

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Protocolo

NOTA: Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con los procedimientos aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC), UCSF. Todos los experimentos de imagen eran procedimientos no de supervivencia y los animales fueron sacrificados inmediatamente después del final de la adquisición de imágenes.

1. generación de ratones

NOTA: APC Min / + ratones, portadores de una mutación en el gen Apc, desarrollan espontáneamente 50-100 adenomas en el intestino delgado.

  1. Cruz APC Min / + ratones con la línea de ACTB-ECFP, que expresa ECFP bajo el promotor de la actina, y además con la línea c-fms-EGFP, que expresa EGFP bajo el promotor c-fms para detectar las células mieloides. Los animales heterocigotos para ACTB-ECFP y c-fms-EGFP se utilizan para detectar la fluorescencia.
  2. Utilice ratones a los 3-4 meses de edad para imagen adenomas claramente detectables.

2 Preparación de Materiales antes de la cirugía

NOTA: Los detalles de la configuración de microscopio han sido previamente descrito 6,7.

  1. Microscopio
    1. Encienda la manta calefactora. Encienda el láser de argón para 488 nm de excitación y el de estado sólido de 405 nm, 561 nm y 640 nm láseres. Encienda el microscopio, la unidad de control de disco giratorio, el AOTF, la unidad de control de láser, y el controlador de la cámara.
    2. Abra el obturador microscopio, lo que convierte el LED rojo. Encienda el ordenador y el software de la cámara.
  2. Plataforma de Imagen
    1. Asegúrese de que el inserto etapa es limpio. De lo contrario, limpia con agua y jabón y luego secar.
    2. Tome dos cubreobjetos y utilice cinta de laboratorio para fijarlos en el inserto. Coloque el inserto en el escenario y limpiar con toallitas con alcohol.
    3. Con la cinta de laboratorio, adjuntar la manta de calentamiento a la parte derecha de la etapa.
    4. Verificar la integridad de la membrana de goma en el cono de la nariz y cambiarlo si necessary. Posición y fijar el cono de la nariz para la administración de anestesia con isoflurano al animal mediante el uso de una gasa y cinta de laboratorio.
  3. El isoflurano Sistema de Anestesia
    1. Vuelva a llenar el tanque de isoflurano.
    2. Encienda el vacío y ajustar a 1,2 l / min.
    3. Añadir agua destilada hasta el nebulizador y conectar el nebulizador para el sistema de isoflurano.
    4. Encienda el analizador de oxígeno y conectarlo al sistema de isoflurano. A su vez en el tanque de oxígeno y asegurar que el analizador de oxígeno muestra 100%. Ajuste el flujo de O 2 a 0,2 L / min.
    5. Encienda el tanque de nitrógeno y ajustar el flujo a 0,8 L / min. Asegúrese de que el analizador de oxígeno muestra un 21%.
  4. Preparación de Herramientas de la cirugía y la Plataforma
    1. Limpie 2 pares de pinzas de disección y tijeras con agua y jabón.
    2. Encienda el esterilizador de cuentas en caliente y se deja alcanzar 250 ° C. Esterilice los instrumentos de cirugía durante 30 segundos. Dejarlas enfriar.
    3. Coloque un remojo de laboratorio en el banco de la cirugía.
    4. Use una tapa de espuma de poliestireno como plataforma quirúrgica. Cubra con un pedazo de remojo laboratorio. Preparar una segunda pieza de remojo laboratorio a cambiar después de afeitar el ratón.
    5. Coloque el cono de la nariz con la línea de la anestesia en la tapa de espuma de poliestireno cubierta, y adjuntarlo a la tapa de espuma de poliestireno (no en el laboratorio de remojo) con un poco de cinta y utilizar dos agujas a ambos lados del cono de la nariz para mantenerla en su lugar.
    6. Ensamble betadine, toallitas de alcohol, gasas estériles, super pegamento, portaobjetos, máquina de afeitar eléctrica, y 4 unidades de cinta de laboratorio.

3 Preparación de las inyecciones

  1. Bajo el capó, preparar una jeringa de insulina (28 G x ½ in) con 7 l de conjugado de stock AF647 Ly-6G (Gr1) de anticuerpos (1 mg / ml) en 100 l de 2000 kDa-rodamina dextrano (4 mg / ml ) para inyección retro-orbital. Inyección retro-orbital se recomienda en APC Min / + ratones ya que la anemia que se desarrolla en estos animales hace que la difficu venas de la colaLT para detectar a través de la piel.
  2. Preparar una segunda jeringa de insulina con 1 mg / kg de atropina diluido en 150 l de PBS por vía subcutánea (sc) antes de la inyección de imágenes para amortiguar los movimientos peristálticos del intestino.

4 Preparación del intestino for Imaging

  1. Verifique que la línea de la anestesia a la cámara de inducción está abierto, y las líneas a la mesa de operaciones y el microscopio están cerrados.
  2. Transferir el animal a la cámara de anestesia. Cierre la cámara de anestesia y encienda el isoflurano y el 4% (con 21% O 2).
  3. Cuando el ratón se respira profunda y lentamente (después de 5-6 min), la transferencia a la fase quirúrgica en su flanco e inyectar la solución de anticuerpos Gr1 y / o solución de dextrano retro-orbital.
  4. Abra la línea de la anestesia vinculado a la plataforma quirúrgica. Cierre de la línea a la cámara de anestesia y poner el ratón sobre su espalda con su nariz en el cono de la anestesia.
  5. Reducir el isofluranoconcentración de 4% a 2,5%.
  6. Verifique que el ratón está bien anestesiado pellizcando su almohadilla plantar y probar el reflejo corneal.
  7. Añadir ungüento oftálmico lubricante en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
  8. Asegure las extremidades del ratón a la etapa quirúrgica mediante la adición de cinta de laboratorio.
  9. Quite el pelo de la superficie ventral utilizando una máquina de afeitar eléctrica. También quite el pelo de la extremidad posterior izquierda para colocar el oxímetro antes de la adquisición. Retire el remojo de laboratorio de la etapa quirúrgica y reemplazar por uno limpio para evitar la contaminación del cabello.
  10. Desinfectar la superficie ventral con toallitas con alcohol y betadine.
  11. Se inyecta la solución de atropina (de 3.2) sc en un flanco del ratón.
  12. Hacer un 1 cm incisión de línea media ventral a través de la piel y el peritoneo mediante el uso de tijeras y un par de fórceps. Tire con cuidado de 3-4 cm de intestino e identificar uno o varios tumores a la imagen.
  13. Tome un vaso micrdiapositiva oscope y la posición de un bucle del intestino en él con un tumor en la parte superior.
  14. Añadir un poco de pegamento súper a unos pocos lugares a lo largo del intestino para adjuntarlo a la diapositiva. Espere un minuto para que el pegamento se seque. Use un marcador para dibujar una línea en la diapositiva que apunta al tumor con el fin de facilitar su localización con el confocal.

5. Posicionamiento del ratón en el escenario y Preparación para la Adquisición de imágenes

  1. Retire la cinta de laboratorio a partir de las extremidades.
  2. Abra la línea de anestesia para la platina del microscopio y cerrar la una a la plataforma quirúrgica.
  3. Transferir el ratón con cuidado a la platina del microscopio con su lado ventral hacia abajo y la nariz en el cono de la nariz. Asegure la línea de la anestesia con un poco de cinta de laboratorio.
  4. Vuelva a colocar el ratón y / o la diapositiva con el fin de tener el intestino en el centro de una de las ventanas de cubierta con engobe. Cinta suavemente por el tobogán con cinta laboratorio.
  5. Conecte la sonda del oxímetro a la extremidad izquierda del ratón parasiga su corazón y los niveles de tasas y saturación arterial de oxígeno respiratorias.
  6. Cubra el ratón en la manta eléctrica para evitar la hipotermia.
  7. Disminuir la concentración de isoflurano del 2,5% al ​​1-1,5% para formación de imágenes.

6. Adquisición de Imágenes mediante μManager Software

  1. Aumentar la velocidad CSUX a 2.500 rpm para mejorar la calidad de la imagen en los ajustes de configuración.
  2. Utilice el menú desplegable para elegir Objetivo 10X 0,5 NA o 20X 0,75 lente objetivo NA Fluar.
  3. Elija el láser 405 nm en el menú desplegable en color.
  4. Haga clic en en vivo y ajustar el enfoque con el microscopio.
  5. Haga clic en Automático para ajustar automáticamente la intensidad máxima y mínima de píxeles de la imagen de la pantalla sobre la base de los valores de los píxeles extremos en la imagen. Un histograma de intensidad de imagen de visualización de píxeles se presenta en el gráfico en la parte inferior de la ventana principal.
  6. Ajuste la exposición de la cámara en la ventana Panel de control Piper porcambiando el número de relojes (Un reloj es 33,333 ms).
  7. Si la señal es demasiado brillante con la exposición más bajo, disminuir la intensidad del láser utilizando la unidad de control del microscopio.
  8. Compruebe la intensidad de la señal de 488 nm, 561 nm y 640 nm láser de líneas. Ajusta la intensidad del láser con propia unidad de control del láser (488 nm y 561 nm) o la unidad de control microscopio.
  9. En la ventana Multi D Adquisición, marque la casilla de puntos de tiempo y escriba el número de puntos de tiempo y el intervalo de tiempo deseado.
  10. Marque la casilla Z-pilas, elija "Z relativa" y definir Z-inicio y Z-final relativa a la posición actual.
    NOTA: Para 10X o 20X objetivo, empezar con 3 aviones Z, 8 micras o 4 micras aparte respectivamente.
  11. Marque la casilla de posiciones múltiples (XY) para obtener imágenes de varios lugares, a continuación, haga clic en Editar lista de posiciones, marque 4 a 6 posiciones diferentes.
  12. Marque la casilla de Canales y añadir canales de Nueva y seleccione láseres líneas desde el menú desplegable y tipe en la exposición para cada canal (en múltiplos de 33.333 mseg).
  13. A consultar Guardar imágenes en la ventana de "adquisición Multi D".
  14. Seleccione una carpeta y todas las imágenes obtenidas se guardarán automáticamente en esta carpeta con el nombre de prefijo dado.
    NOTA: Cada adquisición continua se guardará en una subcarpeta separada como archivos TIFF individuales para cada rebanada Z en cada color en cada punto de tiempo.
  15. Guarde todos los ajustes, haga clic en Guardar configuración en la ventana Multi D Adquisición.
  16. Haga clic en Adquirir en la ventana de adquisición multi-dimensional para iniciar la adquisición.
  17. Si la sonda de oxímetro no se usa o deja de funcionar bien (cuando el pulso no es estable o difícil de detectar), comprobar la eficacia de la anestesia cada 15 minutos durante el procedimiento de imagen pellizcando la almohadilla plantar y comprobando el reflejo corneal. Ajuste la anestesia si el ratón es sensible a estos estímulos.
  18. Después de la adquisición, la eutanasia el ratón por el aumento de la concent isofluranoración a 5%. Cuando no hay movimientos respiratorios son detectables, quite el ratón desde el escenario y realizar una dislocación cervical.

7. Análisis de Imágenes mediante Imaris Software

  1. La conversión a .ims de Archivos (Figura 1A)
    1. Abra el software de la cámara, haga clic en Archivo y luego Batch Converter.
    2. Haga clic en Agregar archivos y seleccione el primer archivo de la primera posición. Repita el procedimiento para cada posición.
    3. Para cada archivo cargado, haga clic en Configuración y compruebe que la configuración "T" para Time, "c" para los canales y "z" de Z-pilas aparecen en ese orden.
    4. Guardar en la carpeta deseada. Explorar y crear un nuevo archivo como convertir.
    5. Haga clic en Set para todos y de inicio.
  2. Ajustes (que complementa la figura 1B)
    1. Ir a la carpeta Construcción específica y abrir el primer archivo.
    2. En la ventana de ajuste de la pantalla, ajustar el fondoseñal de corte modificando el número mínima para cada canal si es necesario.
    3. Si es necesario, ajustar la intensidad de la señal modificando el número Max (cuanto menor es el número máximo, mayor es la intensidad de la señal).
      NOTA: Los ajustes de la señal de intensidad / contraste permiten el punto culminante de un comportamiento de la célula o de un compartimento con el fin de tener una visualización más agradable. No cambia el resultado en sí.
    4. Haga clic en Editar e imagen en Propiedades.
    5. Cambie las x, y, y los valores z (para un objetivo de 10X, x e y = 0,712, z = 8 m; para un objetivo de 20X: x e y = 0,36, z = 4 micras).
    6. Haga clic en Todos Equidistante para ajustar los puntos de tiempo. Añade la fecha de inicio y la hora de inicio de la adquisición. Añade la fecha de finalización y la hora de finalización de la adquisición (que complementa la figura 1C).
    7. Haga clic en el botón Reproducir para ver la película.
    8. Haga clic en Editar y Eliminar los puntos de tiempo para eliminar las imágenes borrosas.
    9. Para unir dos adquisiciones separadas Together en una película, ir al último punto de la primera película de hora y haga clic en Editar> Añadir puntos de tiempo para añadir el segundo archivo.
  3. Guardar como película (Figura 1D Complementario)
    1. Haga clic en Registro, seleccione la extensión mov y un factor de compresión de 0.
    2. Haga clic en Guardar.

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Resultados

Mediante el uso de microscopía confocal de disco giratorio, los tejidos no tumorales y tumorales en el intestino delgado de APC Min / +; ACTB-ECFP; ratones c-fms-ECFP se pueden visualizar desde la superficie serosa. Después de formación de imágenes, software de la cámara se utiliza para analizar y ajustar la adquisición (Figura 1). Después intravenosa (iv) la inyección de 2000 kDa de dextrano fluorescente rodamina y un anticuerpo conjugado Ly-6G 647, los vasos sangu...

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Discusión

En este trabajo, un protocolo detallado se describe para la hilatura disco de imagen confocal de las dinámicas celulares mieloides en tumores intestinales durante varias horas en un animal vivo, fotografiados desde la parte serosa del intestino.

Para evitar la inflamación y para tener condiciones fisiológicas óptimas, formación de imágenes del intestino tiene que ser hecho en el órgano intacto. Sin embargo, las imágenes desde el lado de la serosa del intestino es un reto, ya que la luz tiene...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a Ying Yu para APC Min / + ratones genotipado. Este estudio fue apoyado por fondos del INSERM y donaciones (CA057621 y AI053194) de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Apcmin/+ ratonesLaboratorio Jackson2020
Ratones ACTB-ECFPLaboratorio Jackson3773
ratones cfms-EGFPLaboratorio Jackson18549
Dextrano de 2.000 kDa, conjugado con rodaminaInvitrogenD7139
IsofluranoMayordomo Suministro de Salud Animal29450
NitrógenoUCSF Oxígeno UCSF
1x PBScultivo celular UCSF
Tampón salinoUCSF Instalación
Anti-ratón Ly-6G (GR1) Anticuerpo AF647UCSF NúcleoStock 1 mg/ml. Uso a 7 μ g/ratón
AtropinaLARC UCSFUso a 1 mg/kg ratón
Toallitas con alcoholBecton Dickinson 326895
28 G x 1/2 pulg. jeringa de insulinaBecton Dickinson329465
Remium cubreobjetosFisher Scientific12-548-5M24x50-1
BetadineLARC UCSF
Manta térmicaGaymar Industrias
Esterilizador de perlascalientes Fine Science Tools18000-45Encender 30 min antes de usar
Aplicadores con punta de algodónMicroscopía electrónica de 6 pulgadas Sciences72310-10
Sistema de anestesiaSummit Anesthesia Support
Microscopio invertidoCarl Zeiss IncZeiss Axiovert 200M
Inserto de etapaInstrumentación
Aplicada Oxímetro de ratón, software y sensoresStarr Ciencias de la VidaNebulizador MouseOx
Soporte de anestesia de la cumbre
ImarisBitplane
μ Gerentelaboratorio Vale, UCSFSoftware de código abierto
Cámara ICCDStanford PhotonicsXR-Mega-10EX S-30
Disco giratorio confocal cabeza de sacanYokogawa CorporationCSU-10b
Instalación de de cultivo celular de anticuerpo monoclonal Sientific del

Referencias

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