Summary
Este método foi desenvolvido com o objectivo de proporcionar uma solução de fármaco estável através da artéria carótida, para avaliar a farmacocinética de drogas novas em modelos de rato.
Abstract
Ao propor a utilização de um fármaco, a combinação de fármacos, ou a entrega de drogas para um novo sistema, deve-se avaliar a farmacocinética do fármaco no modelo de estudo. Como o uso de modelos do rato são muitas vezes um passo vital para a descoberta de drogas pré-clínica e no desenvolvimento de drogas 1-8, é necessária a concepção de um sistema para introduzir medicamentos em ratos de uma maneira reprodutível uniforme,. Idealmente, o sistema deve permitir a recolha de amostras de sangue em intervalos regulares ao longo de um período de tempo definido. A capacidade para medir as concentrações de droga por espectrometria de massa, tem permitido aos investigadores seguir as mudanças nos níveis de droga no plasma ao longo do tempo em murganhos individuais 1, 9, 10. Neste estudo, o paclitaxel foi introduzido em ratinhos transgénicos como uma infusão arterial contínua ao longo de três horas, enquanto que as amostras de sangue foram simultaneamente tomadas por hemorragias retro-orbital em momentos set. Infusões artéria carótida são uma alternativa potencial para as infusões de veia jugular, quando factores tais comotumores mamários ou outras obstruções fazer infusões jugular impraticável. Usando esta técnica, as concentrações de paclitaxel no plasma e tecido atingido níveis semelhantes em comparação com a infusão jugular. Neste tutorial, vamos demonstrar como a cateterização da artéria carótida com sucesso através da preparação de um cateter otimizado para o modelo individual do mouse, em seguida, mostrar como inserir e fixar o cateter na artéria carótida de rato, coloque a ponta do cateter para fora através da parte traseira do pescoço do rato, e ligar o rato a uma bomba para entregar uma velocidade controlada de influxo de drogas. Várias sangramentos retro-orbital de baixo volume para permitir a análise de concentrações de droga no plasma ao longo do tempo.
Introduction
A infusão da droga através da carótida pode ser realizada de forma fiável e reprodutível pelo equipamento e técnica de optimização. O procedimento não é complicado, embora exija um bom controle e atenção aos detalhes. Superior cuidado e habilidade são necessários para isolar a artéria carótida e inserir o cateter, o qual pode, geralmente, ser adquirido através da prática. Cirurgia por um técnico experiente não deve exceder uma hora. Após a cirurgia bem sucedida, o rato deve aparecer normal e saudável (embora o rato pode reagir com a infusão da droga real), e fármaco (s) podem ser administrados em uma dosagem uniforme e contínua controlada. As amostras de sangue devem ser tomadas a partir de um site que não seja da artéria carótida; sangramentos retro-orbital provou fácil de coletar e satisfatória para análise das concentrações de drogas.
Cateteres de tamanho e forma ideal são um trunfo inestimável para a execução de uma infusão de sucesso 11. Encontramos o cateteres disponíveis commercially muitas vezes a ser muito grande e / ou muito flexível para permitir um acesso conveniente para a artéria carótida do rato. Ele provou preferível cateteres de moda do tubo de polietileno usado para conectar o mouse para a infusão de seringa. Assim, todos os tubos, conectores e agulhas de dimensões eram consistentes, que simplificados conjunto de infusão. Usando esta técnica, não é necessário empurrar a ponta do cateter na artéria além do ponto onde ainda é visível, e o fluxo sanguíneo para a artéria carótida não é restaurado até depois de o cateter é inicialmente fixado. Isto reduz os riscos de punção da artéria ou de ter o cateter empurrado para fora pela alta pressão do fluxo sanguíneo. O projeto cateter aqui não incorpora uma "colisão" para segurá-la no lugar, garantindo assim o cateter bem com suturas e fita cirúrgica é uma prioridade.
Infusões pode ser preferível para as injecções de bolus iv comuns, como um imitador de melhor administração clínica demedicamentos, tais como taxanos 3, 12, 13. A técnica aqui descrita foi desenvolvida originalmente para permitir a infusão em modelos de rato, em que o acesso à veia jugular ou femoral foi impedida por crescimento do tumor mamário e / ou vascularização excessiva da área de inserção. Este método pode muitas vezes ser adequado, mesmo em camundongos livres de tumor: apesar de isolar e cateterização da carótida é um pouco mais invasivo, descobrimos que é preferível a jugular, pois a propensão da parede jugular para rasgar resultou em inserções mais falhou e falhas para completar o curso de tempo de 3 horas.
Embora os resultados aqui apresentados são de C57BL / 6J (in-educado casa) ratos, temos utilizado essa técnica para infundir com sucesso paclitaxel em várias linhagens de camundongos, incluindo FVB e mistos estirpes, a seguir a farmacocinética em modelos de ratos manipulados transgenicamente para regular as funções de transportadores celulares. As amostras de sangue e tecidos coletados mostraram níveis esperados de paclitaxel, no intervalo dos níveis observados após infusões jugulares 1. Esta técnica pode ser esperado funcionar igualmente bem em outros modelos de ratinho e com outras soluções injectáveis.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cancer Center, Animal Care Institucional e Uso do Fox Chase e pelo Biotério, e encontrado para estar em conformidade com as diretrizes institucionais para o tratamento humano dos animais.
1. Preliminar Preparação
- Preparação do cateter: Preparar um cateter a partir de um curto comprimento de tubagem de polietileno, modificado para formar um diluído, ponta furada (Figura 3A). Faça várias cateteres com antecedência e salvar indefinidamente.
- Acender um bico de Bunsen, e ajustar para estabelecer uma chama baixa constante. Segure tubulação perto de chama para amolecer polietileno. Quando a tubulação começa a derreter, lentamente puxe as duas pontas para criar uma seção engrossada da tubulação, aproximadamente 0,25 mm de diâmetro externo.
- Corte uma extremidade chanfrada cerca de 0,75 centímetros ao longo seção fina. Isso garante tubulação suficiente para ser fixada na artéria, sem criar uma excessivamente longo cateter.
NOTA: Um final longo e fino em the cateter tem uma propensão para entupir. Um excessivamente longo final também pode conter líquido suficiente para mudar significativamente a capacidade de volume de líquido do cateter. - Embotar a extremidade chanfrada, passando rapidamente através da chama - quando devidamente aquecido, o fim torna-se ligeiramente arredondada e ampliada. Os ganchos de ponta ligeiramente para trás, o que ajuda ancorar o tubo durante a inserção na artéria.
- Corte os 6,0 centímetros tubulação a partir do ponto onde começa a fina. Isso faz com que um cateter muito manejável, que é longo o suficiente para enfiar até a saída do pescoço e para manter e trabalhar com confortavelmente, mas curto o suficiente para impedir que o mouse de roer excesso de tubulação ou exigindo muito volume de infusão extra para limpar salina inicial .
- Prepare uma seringa de aproximadamente 0,2 ml de solução de heparina, coberto com uma agulha embotada. Inserir a agulha na extremidade larga do cateter (Figura 3B). Preencha cateter com heparina, tendo o cuidado de assegurar que não há bolhas ema tubagem. Coloque a seringa com heparina e cateter de lado em uma área estéril. Esterilizar cateteres por irradiação gama, através da colocação do cateter (s) numa placa de Petri, e expondo a 20 Gy de irradiação gama. Se você não tiver acesso a uma fonte de radiação gama, verifique com seu biotério para investigar outros meios de esterilização, tais como gás ou esterilização química. Não autoclave, como o polietileno não pode ser esterilizada pelo calor.
- Criação de um chumbo de solução salina (Figura 3B).
- Prepara-se uma segunda seringa de cerca de 0,5 ml de solução salina estéril, tendo o cuidado de garantir uma linha livre de bolhas.
- Corte um segundo pedaço de tubo, de aproximadamente 15 centímetros, e deslizar para a agulha da seringa embotada. Anexar uma porta de conector para a extremidade livre do tubo.
- Teste que o fluxo de solução salina é desobstruída por bem avançar um pequeno volume de solução salina através da liderança. Utilize este chumbo salina após a inserção do cateter, para verificar o fluxo atravéscateter, e para lavar a linha de sangue. Coloque a seringa salina de lado em uma área estéril.
- Antes da cirurgia, esterilizar o material em autoclave, ou, alternativamente, esterilização por gás ou esterilização de contas de vidro.
- Prepare a área cirúrgica esterilizada.
- Limpe as superfícies de bancada e microscópio com desinfectante etanol como 70% ou dióxido de cloro. Cubra banco e base de microscópio com um pano limpo descartável, absorvente.
- Prepare uma placa cirúrgica cobrindo com duas camadas de papel limpo, absorvente, bem presa com fita adesiva.
- Coloque para fora todos os materiais cirúrgicos (como catalogado na lista de materiais) para que sejam facilmente acessíveis.
- Corte três comprimentos de sutura estéril, 8 centímetros cada, e reserve com outros suprimentos. Coloque um porto onde será facilmente disponível (Figura 3B).
2. Cirurgia
- Preparação do animal
- Anesthetize rato pela exposição a 2-3% de isoflurano em câmara de anestesia conectado a precisão vaporizador. Retirar rato da câmara, e raspar o cabelo do pescoço / torso superior do rato, e abaixo da orelha direita (local de saída do cateter). Administrar veterinária vaselina pomada oftálmica para os olhos para evitar a secura sob anestesia. Certifique-se de que o animal não despertar durante as preparações cirúrgicas por rato permitindo tempo suficiente na câmara de inalação antes de prep (pelo menos de dois minutos), ou através da administração de isoflurano para rato por meio de um cone de nariz durante a preparação. Retorno do mouse para câmara de anestesia.
- Quando o rato é suficientemente inerte, mover para a área cirúrgica esterilizada, coloque anestesia cone do nariz sobre o nariz ea boca do mouse e desviar o fluxo de isoflurano para nariz cone. Confirme anesthetization adequada por beliscar a pata com uma pinça; quando o mouse não mostra nenhuma reação, prossiga para a próxima etapa.
- Posicione o mouse sobre as suas costas, com a cabeça virada para ainvestigador. Prenda as orelhas, fore-patas traseiras e-patas para placa cirúrgica com fita adesiva ou outro dispositivo de retenção para manter o mouse estável. Limpe a área da incisão com iodopovidona e 70% de etanol.
- Isolamento da artéria carótida
- Faça um 1 centímetro longitudinal cortar um pouco para a direita da linha média do pescoço. Utilize uma pinça para separar o músculo e gordura para expor a traqueia (figura 4A). Localize a artéria carótida, paralela à da traquéia (Figura 4B).
- Com cuidado, use uma pinça para fáscia separado que recobrem a artéria (Figura 4C). Levemente puxar o nervo vago além da carótida, e inserir uma pinça para dentro do espaço entre os dois. Fórceps gentilmente abertos para criar uma lacuna na fascia e, cuidadosamente, afastar o nervo da artéria, a partir da bifurcação da artéria perto da laringe (extremidade anterior), para cima (posterior) na medida do possível (pelo menos 3 mm) ( Figura 4D).
- Limpar qualquer refáscia maining até a artéria é bem isolado (Figura 4E). Adicionar uma gota de salino para a área de cirurgia ocasionalmente para manter o tecido húmido e, assim, menos quebradiço e menos propensos a rasgar aleatoriamente.
- Colocação de sutura e preparação para a inserção do cateter de artéria (Figuras 4, 5).
- Use uma pinça para tirar um fio de sutura de seda sob a artéria. Dê um nó seguro para fechar a artéria tão longe em direção ao anterior quanto possível (Figura 4F).
- Desenhe uma segunda linha sob a artéria. Dê um nó retrátil para fechar temporariamente a artéria tão longe em direção ao posterior possível (Figura 4F).
- Desenhe uma terceira linha sob a artéria. Dê um nó muito solto entre os dois primeiros suturas, a ser usado para fixar rapidamente o cateter após a colocação (Figura 4G).
- Mantenha todas as extremidades das suturas para fora do caminho molhando-os com um pouco de etanol a 70%.
- Com a sutura, pegue o nó mais baixo para puxar a artéria pouco tenso. Nick artéria acima, mas muito perto, a sutura anterior (Figura 4H). Tenha cuidado para não cortar muito profundamente, mas verifique a fenda para garantir que a abertura é desobstruída.
- Remover cateter cheio de heparina de agulha de seringa, tentando evitar a criação de grandes bolsões de ar em cada extremidade. Manipular o cateter para a posição de bisel em um ângulo confortável, geralmente para baixo e ligeiramente para a direita (para destros).
- Enquanto segurando a sutura para manter a artéria restante ligeiramente tenso, insira suavemente cateter na fenda (Figura 4I). Use a pinça para segurar a sutura anterior e puxe para baixo sobre a artéria cateter (empurrando para cima excessivamente com o cateter pode causar o fim chanfrado para perfurar a artéria). Cuidadosamente libertar o cateter e anterior sutura.
- Fixar o cateter, apertando o nó da sutura meio, perto da entrada do cateter na artéria. Faça um nó triplo apertado, mas não se esqueça de puxar tão apertada como a obstruir o fluxo através do cateter. Além disso fixar o cateter, amarrando-o para baixo com o fio de sutura anterior, a seguir à entrada da artéria.
- Fixar a vantagem de solução salina para o cateter por meio do conector de ficha, novamente tentando evitar a introdução de bolhas de ar na linha.
- Segure as extremidades da sutura posterior e puxe para liberar o nó. Manobra da sutura para baixo da artéria, em relação ao final do cateter (não remova o fio). O sangue deve fluir para o cateter; se não houver fluxo sanguíneo, mexer suavemente cateter para tentar remover a constrição.
- Quando o fluxo parece desobstruída, use o último fio (da sutura posterior) para amarrar um nó adicional, ligeiramente acima da sutura médio.
- Com pinças em cada lado, utilizar um par de pinças para segurar o cateter logo abaixo da sutura anterior, e com a outra, pressionar uma dobra para dentro do cateter por isso vai dobrar facilmente para o lado. Repita o procedimento para criar uma segunda dobra. Isto permite que a extremidade livre do cateter a ser puxado para a parte traseira da cabeça do rato, sem forçar a ponta do cateter para ligar lateralmente contra a parede da artéria.
- Ligue o rato sobre o seu lado (esquerdo), mantendo-se o cone de nariz posicionada sobre a boca e nariz, e limpar a área da incisão com etanol a 70% e povidona-iodo. Adicione uma pequena incisão (aproximadamente 4 mm) abaixo e atrás da orelha direita. Use uma pinça para segurar a aba aberta de pele, durante o trabalho da sonda romba oco sob a pele para criar um canal através do mordente, para a cavidade no pescoço. É aconselhável levar a sonda ao redor da glândula salivar, em vez de tentar ir entre a glândula e pele. Use uma pinça para liberar cuidadosamente um espaço para a sonda para sair.
- Passe plugue porta / cateter através de sonda para sair no pescoço. Não puxe muito difícil; certifique-se o cateter não está esmagando ou constrição dos vasos sanguíneos ou órgãos.
- Administrar analgésico tópico para incisão no peito, e perto ferida com seda ou grampos.
- Retire do mouse da anestesia, e permitir que animal a se recuperar em um ambiente limpo, aquecido espaço (lugar gaiola em cima de uma almofada de aquecimentoou sob uma lâmpada de aquecimento), durante pelo menos 30 min.
3. Infusão
- Preparar alíquotas de 5 mg / ml, solução de paclitaxel / metanol.
- Medir 50 mg de paclitaxel para um tubo de centrífuga de 15 ml. Adicionar 10 ml de metanol estéril. Tubo Cap. Rodar à mão ou num agitador rotativo à temperatura ambiente até que o pó esteja dissolvido.
- Alíquota de 500 ml de solução em 20 pequeno, congelador tubos de seguros, e armazenar a -20 ° C.
- Aliquota indivíduo Descongelar à temperatura ambiente ou em banho de água a 37 ° C, imediatamente antes da infusão.
- Preparar a bomba de infusão (Figura 6).
- Corte um longo comprimento de tubo de polietileno de cerca de 40 cm. Anexar uma agulha embotada de uma extremidade, e uma porta de conector para o outro.
- Desenha-se droga dentro de uma seringa com um diâmetro interno conhecido (a maioria das bombas programáveis irá exigir que o diâmetro do cilindro da seringa, a fim de calcular a velocidade de the bomba de braço). Coloque a agulha da seringa e para carregar o medicamento através da agulha e da tubagem.
- Situar a seringa na bomba de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro a bomba para que a droga está fluindo sem problemas fora do conector, e ele está pronto para perfusão.
- Anexar mouse para bombear.
- Segure o mouse estável e usar a pinça hemostática para prender cateter, perto do plugue porta. Remova o plugue e substituir com o conector ligado à seringa e tubos.
NOTA: O sangue pode começar a fluir de volta através de tubos. - Rapidamente administrar uma bomba rápida para limpar o volume do cateter (calculada através da observação empírica o volume de 6 cm de tubo), em seguida passar imediatamente para a razão de infusão desejada.
- Segure o mouse estável e usar a pinça hemostática para prender cateter, perto do plugue porta. Remova o plugue e substituir com o conector ligado à seringa e tubos.
- Continue infusão Paclitaxel para o curso de tempo de três horas.
- Monitorar tubos ocasionalmente para verificar se há vazamentos nos cruzamentos como este é frequentemente um sinal de um bloqueio no fluxo para o mouse.Assista o mouse para reações esperadas ou inesperadas à infusão (letargia ou hiperatividade, sinais de desconforto).
- Dependendo da duração e da natureza da infusão, o mouse pode não comer ou beber, mas não se esqueça de fornecer o acesso a alimentos e água de acordo com a política estabelecida da instituição. Esteja ciente do potencial para desidratar o mouse através da recolha de grandes quantidades de sangue.
- Continue a manter o warm gaiola com uma almofada de aquecimento ou uma lâmpada, a não ser que o mouse aparece a vontade de ficar longe do calor. Se um animal não é sacrificado dentro de várias horas após a cirurgia, implementar plano de tratamento pós-cirúrgico do animal, incluindo as condições de habitação estéreis e tratamento para dor pós-cirúrgica.
- Manter uma vigilância apertada sobre o mouse, especialmente no primeiro poucos minutos, para garantir que ele não puxe o tubo através hiperatividade, ou irritação da tubulação (que pode ser um sinal de uma inserção pobres). Se o mouse não está sobre-ativo, monito constanteanel pode não ser necessário, mas verifique o mouse rotineiramente para garantir que o animal não se emaranhar na tubulação. Arreios e sistema de corda estão disponíveis comercialmente, mas seu uso está fora do âmbito deste protocolo.
- Recolha de amostras.
- Coletar amostras de sangue em intervalos regulares por sangramentos submandibular ou retro-orbital (Se o seu protocolo não faz uso de modelos de tumores mamários, considere coleta de sangue através de um cateter jugular inserido, ao mesmo tempo que o cateter carótida). Tenha cuidado para não puxar a linha de infusão. Se a coleta por hemorragias retro-orbital, levemente anestesiar o mouse com um anestésico inalatório (por exemplo methoxyflurane) para que um não precisa agarrar pelo pescoço para garantir o mouse.
- Girar o hematócrito no sangue em centrífuga para separar as células do sangue a partir do plasma. Use uma caneta arquivo ou diamante-ponta para marcar tubo em face de separação de fases. Quebre tubo e recolher plasma só, em, tubo congelador-safe pequeno. Guarde-o em -80 ° C até à análise.
NOTA: Se uma centrífuga de hematócrito não está disponível, transferir a amostra de sangue em tubo de micro-centrífuga, e giram em uma micro-centrifugadora a alta velocidade para separar as células do sangue a partir do plasma. Recolher o plasma para um segundo tubo, e armazenar a -80 ° C. - Euthanize rato por asfixia com CO2. Colete tecido (cerca de 20-50 mg) de órgãos de interesse e congelamento de flash em nitrogênio líquido. Armazenar a -80 ° C até análise.
Análise 4. Amostra
Observação: Todas as amostras para este protocolo foram analisados através de um laboratório externo por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC - MS / MS), que calculou as concentrações de paclitaxel como se segue:
- Extrair paclitaxel a partir de amostras. Homogeneizar amostra de tecido em ácido acético a 0,1%, 50% de metanol antes da extracção. Extrair o paclitaxel por extracção líquido / líquido, utilizando éter metil terc-butílico (MTBE) fortificado com um padrão analógico interno (docetaxel). Retirar amostras de MTBE e secos. Ressuspender em 50% de acetonitrilo, uma solução de ácido acético a 0,1%.
- Prepare padrões de calibração. Adicionar uma concentração conhecida de paclitaxel a matriz de C57BL / 6 apropriar-se para se obter uma gama definitiva de normas (de 1 a 20.000 ng / ml para as amostras de plasma, a partir de 0,1 a 5.000 ng / mL para amostras de tecidos). Extrair as normas em duplicado, utilizando o mesmo método que para as amostras de estudo acima. Medir pico paclitaxel em amostras por HPLC / MS / MS utilizando ionização por electropulverização.
- Calcular a concentração, utilizando o rácio de paclitaxel a área do padrão interno. Use padrões de calibração para criar uma curva padrão, e as amostras de estudo interpolados por encaixe na curva. Normalizar a concentração de amostras de estudo pelo peso inicial de amostra antes da homogeneização.
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Representative Results
O paclitaxel distribuição segue padrões previsíveis durante um regime de dosagem de 3 h de uma infusão de 15 minutos de alta velocidade, seguido de uma infusão de 165 minutos a baixa velocidade.
A Figura 1 mostra uma comparação entre a infusão venosa concentrações de paclitaxel plasma jugular e da artéria carótida-infusões. As concentrações de paclitaxel cair rapidamente nos primeiros 15 minutos após a infusão inicial de alto volume, e depois se estabilizar ao longo do próximo 150 min. Em comparação, os níveis de paclitaxel em uma infusão pobres começar relativamente baixo, e passe para cima e para baixo ao longo do ensaio. Isto foi provavelmente causado por um bloqueio na linha de início da infusão. Registos do ensaio mostram o rato tinha pouca ou nenhuma reacção externo para a infusão, confirmando a ideia de uma administração inferior de medicamento. A Figura 2 mostra os níveis relativos de paclitaxel no fígado e no tecido cerebral, bem como o plasma do sangue, no final do a infusão de 3 horas.
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Figura 1:. Níveis plasmáticos de paclitaxel durante carótida e jugular infusões curvas representam as concentrações plasmáticas de paclitaxel em ratos individuais. Cada rato recebeu uma infusão bifásico, constituído por uma alta velocidade inicial, 15 min de infusão de 0,42 mg / kg / min, imediatamente seguido por uma baixa velocidade, 165 min infusão de 0.021mg / kg / min. A área sob a curva (AUC) para perfusão carótida foi de aproximadamente 59 ug / ml ∙ minutos versus uma AUC para infusão jugular de aproximadamente 37 ug / ml ∙ min. A meia-vida de paclitaxel calculada a partir das curvas geradas para perfusão carótida era de 10 min e jugular para infusão foi de 11 min. Infusão carótida mostra cerca de níveis equivalentes de concentração do fármaco em comparação com a infusão jugular. Concentrações baixas contínuas, ou concentrações que ciclo cima e para baixo, muitas vezes represent uma perfusão pobre.
Figura 2:. Paclitaxel concentração por tecido Imediatamente após a infusão de paclitaxel 3 horas e coleta da última amostra de sangue, o rato foi sacrificado, e amostras de fígado e tecido cerebral foram coletadas. Níveis de concentração de paclitaxel no plasma e tecidos foram adquiridos por meio de análise de massa-spec. Estes dados representam amostras coletadas a partir da carótida Infusion-Rato na Figura 1.
Figura 3: parafernália cirúrgica. (A) Cateter Produção: Puxando os próprios cateteres continua para baixo as despesas materiais, permitindo a repesquisador para adequar o tamanho ea forma do cateter com a idade eo tamanho do mouse (B) Prepare antes da cirurgia.: Três (3) suturas de seda, aproximadamente 8 cm cada; Plugue porta estéril; Seringa Saline e chumbo; Cateter, ligado a heparina seringa.
Figura 4: Preparação da artéria carótida e a inserção do cateter. (A) Corte através da pele, afastar glândulas e utilize uma pinça para grosseiramente separado gordura para expor o músculo. (B) Use uma pinça para gentilmente muscular separado para expor lado direito da traquéia. Artéria carótida se tornará visível quanto maior, vasos de paredes espessas, paralela à traqueia. (C) fascia ruptura em torno da artéria. (D) do nervo vago separado de artéria carótida. (E) Continue removendo fáscia até Carotid está completamente isolada ao longo da cavidade. (F) Sutura nó permanente na extremidade anterior, e deslizamento nó na extremidade posterior. (G) Terceiro sutura é enfiado sob carótida e muito vagamente amarrado. (H) Artéria é cortado logo acima da sutura anterior. ( I) Inserir cateter na artéria no nick. Agarre sutura anterior com uma pinça para puxar para baixo ao longo da artéria cateter. (J) cateter seguro em artéria carótida com os três suturas.
Figura 5:.. Sutura colocação representação esquemática do local da cirurgia antes e após a instalação do cateter A corresponde com a fotografia Figura 4G, com a adição de um entalhe na artéria, como na Figura 4H.
Figura 6:. Esquemático de infusão set-up seringa está cheia de drogas, e tampado com uma agulha sem corte. A linha de polietileno atribui seringa ao cateter da carótida. Bomba comprime lentamente seringa, para entregar dosagem uniforme diretamente na corrente sanguínea.
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Discussion
Infusão da artéria carótida é uma técnica importante neste estudo de farmacocinética de paclitaxel. Perfusão da artéria carótida é um método para distribuir rapidamente drogas em todo o sistema circulatório 14. A infusão hr 3 é um mímico mais perto de administração clínica de drogas, como taxanos do que injeções em bolus. A cirurgia pode ser realizada de forma fiável por um único indivíduo, o tempo de cirurgia é relativamente curto, e as taxas de sucesso são> 75%. Após as amostras são coletadas, elas devem ser analisadas pelos métodos apropriados. Utilizou-se a espectrometria de massa para determinar a concentração de paclitaxel em amostras de plasma e tecido. Para validar ainda mais esta técnica, que enviou amostras de sangue e tecidos para um laboratório independente para análise. Estes dados foram representados como curvas individuais de concentração de plasma de paclitaxel para cada animal testado (Figura 1), e a distribuição de paclitaxel foi comparada em diferentes tecidos (Figura 2). Em cada caso, é importante considerar o melhor método para analisar a distribuição da droga e / ou o metabolismo, dependendo da droga e do sistema de interesse. Outras opções para a medição de diferentes drogas podem incluir HPLC-UV ou imunoensaios 2.
Dois principais fatores essenciais para o cateterismo da carótida de sucesso são bem cateteres moda e isolamento da artéria superior. Formando cateteres de acordo com o tamanho do modelo do rato é primordial. Se o diâmetro do cateter é demasiado espessa, a inserção para dentro da artéria irá ser excessivamente difícil, enquanto que um cateter muito fino será mais duro para proteger e susceptíveis de entupir antes ou durante a infusão. O ângulo e nitidez da ponta do cateter deve ser também em uma faixa moderada; uma dica que é muito afiada pode perfurar a parede da artéria, enquanto uma dica que é muito chato vai ser difícil de inserir na artéria. As medições aqui indicados foram obtidos usando dez semanas de idade C57BL / 6J, cerca de 20 g, como um modelo modelo. As medições devem ser escaladoscima ou para baixo de forma empírica para ajustar modelos individuais.
Isolamento da artéria carótida deve ser um processo delicado, deliberada de evitar danos desnecessários ao tecido e para evitar o sangramento em grande escala. Subcutânea de gordura geralmente podem ser facilmente separados com baixa de uma pinça afiada médio. O tecido muscular ao longo da carótida devem ser separados com média a fina fórceps derrubadas ao longo do viés das fibras musculares. Se um intervalo mais amplo é necessário, o técnico deve ser extremamente cuidadoso para evitar a ruptura de pequenos vasos sanguíneos. Uma vez que a carótida é visível, ainda haverá uma boa quantidade de fáscia que precisa ser tweezed longe da artéria com uma pinça de ponta fina. Finalmente, o nervo vago devem ser separados a partir da artéria carótida, sem danos para qualquer um. Quando a carótida está devidamente isolado, deve ser possível inserir a pinça por baixo, com um espaço vazio em ambos os lados da artéria (ver Figura 4E).
Quando trouble tiro infusões pobres, começar por rever as instruções sobre a bomba para ter a certeza de que o pesquisador tem programado corretamente a bomba para entregar a dose esperada. Então, considere cuidadosamente a mudança do volume que será introduzir no animal de teste. A diluição da droga deve ser calculada de modo a que o volume de dosagem é adequada: o volume não deve ser demasiado grande para que o animal possa tolerar, e, idealmente, não irá afectar significativamente a pressão sanguínea; no entanto, o volume deve ser grande o suficiente para a bomba para entregar de forma confiável, e vai criar um fluxo constante para evitar obstruções nos cruzamentos. Se tamancos-se uma ocorrência regular, considerar a mudança para um menor calibre (diâmetro maior) agulha e tubos. Além disso, se o conteúdo de drogas plasma não atinge os níveis esperados, o pesquisador deve verificar os ratos post mortem para determinar se o cateter permanece bem colocado na artéria e de fluxo livre, e modificar a forma / tamanho do cateter, se necessário.
O usefulness deste método pode ser limitada por factores tais como o tamanho e estado geral de saúde do sujeito, e o comprimento pretendido do tempo da infusão. A cirurgia ea infusão pode sobrecarregar um assunto já angustiado. Mesmo num animal saudável, cateter na artéria carótida é apropriado apenas para as infusões de curta duração, geralmente várias horas a vários dias. Considere o que os métodos de alívio da dor será usado se camundongos mostram sinais de desconforto em resposta à infusão de drogas, tais como aplicações repetidas de anestesia tópica para feridas sites ou analgésicos sistêmicos de preferência. Será necessário ter todo o trabalho de animais aprovados pela organização reguladora animal local ou IACUC, para obter as permissões apropriadas para executar este procedimento. Se for necessário dispor de uma infusão mais longa, ou para ter o rato sobreviver a infusão durante um período de tempo prolongado, os métodos alternativos de infusão deve ser explorado.
Depois de ter dominado perfusões artérias carótidas no estudosobre a farmacocinética do paclitaxel, pretendemos usar esta técnica no futuro, para investigar os efeitos de outras drogas, e moduladores Abcc10 no C57BL / 6J e camundongos FVB, e outros modelos de mouse.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Nós gostaríamos de agradecer a Facilidade FCCC Laboratory Animal por seu apoio neste projeto. Agradecemos Wolfe Laboratories, Inc. por sua assistência na análise dos níveis de paclitaxel no plasma e tecidos. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede K01CA120091 para EHB e CA06927 a Fox Chase Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID | Braintree Scientific, Inc. | PE10 | |
| 3 Blunted needles (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | NB-30 | |
| Stainless steel port plug (28 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | PP-28 | Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal. |
| 2 Stainless steel connector plugs (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | C-30 | |
| Three 1 cc syringes | Becton, Dickinson and Co. | 309659 | |
| Sterile 0.9% Saline solution | Hospira | 0409-7984-37 | |
| Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution | Braintree Scientific, Inc. | HGS | |
| Silk suture | Braintree Scientific, Inc. | SUT-S 113 | |
| Vanna Scissors (micro-scissors) | World Precision Instruments | 14122 | This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well. |
| Hartman Mesquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501705 | |
| Betadine Swabsticks | Perdue Products L.P. | BSWS1S | |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1160-01 | May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia. |
| Paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Micro Capillary Tube Sealant | Fisher Scientific | 02-678 | |
| C57BL/6J mice | Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred | ||
| API 4000 Q-Trap mass spetrometer | Applied Biosystems |
References
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- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Determination of paclitaxel and metabolites in mouse plasma, tissues, urine and faeces by semi-automated reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 664, 383-391 (1995).
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