El ensayo de citotoxicidad de sangre entera (WCA) es un ensayo de citotoxicidad desarrollado mediante la incorporación de alto rendimiento de la tecnología de posicionamiento celular con microscopía de fluorescencia y de procesamiento de imágenes automatizado. Aquí se describe cómo las células de linfoma tratados con un anticuerpo anti-CD20 se pueden analizar en tiempo real en toda la sangre humana para proporcionar un análisis de citotoxicidad celular cuantitativa.
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Artículo de método
En tiempo real Ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana
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Resumen
Resumen
A sangre entera citotoxicidad ensayo basado en células en vivo (WCA) que permite el acceso a la información temporal de la citotoxicidad de las células en general se desarrolla con alto rendimiento de la tecnología de posicionamiento celular. Las poblaciones de células tumorales están dirigidas en primer lugar a la inmovilización preprogramados en un formato de matriz, y se marcaron con tintes verdes citosólicas fluorescentes. Después de la formación de conjunto de células, se añaden fármacos de anticuerpos en combinación con sangre humana entera. A continuación se añade yoduro de propidio (PI) para evaluar la muerte celular. El conjunto de células se analizaron con un sistema de imagen automático. Mientras tinte citosólica etiquetas de las poblaciones de células tumorales específicas, PI etiquetas de las poblaciones de células tumorales muertas. Por lo tanto, el porcentaje de muerte de células cancerosas diana se puede cuantificar mediante el cálculo del número de células supervivientes dirigidas al número de células diana muertas. Con este método, los investigadores son capaces de acceder dependiente del tiempo y la información de la citotoxicidad celular dependiente de la dosis. Sorprendentemente, ni radio peligrososse utilizan productos químicos. El WCA que aquí se presenta ha sido probado con el linfoma, la leucemia, y las líneas celulares de tumores sólidos. Por lo tanto, WCA permite a los investigadores para evaluar la eficacia del fármaco en una condición muy relevante ex vivo.
Introducción
Los avances recientes en la industria farmacéutica han llevado a un mayor interés en la realización de las identificaciones específicas de anticuerpos de células tumorales y los tratamientos de cáncer personalizadas; sin embargo, varios obstáculos se encuentran en el proceso. Sólo el 5% de los agentes que tienen actividad contra el cáncer en fase de desarrollo preclínico tienen licencia después de mostrar eficacia suficiente en fase de prueba II-III 1,2. Las estrategias preclínicos (tanto in vitro como in vivo) son subóptimas como muchos ejemplos han demostrado que los fármacos antitumorales comportan de manera diferente en humanos y en animales de laboratorio, principalmente debido a sus diferentes componentes de la sangre 3-5.
Para hacer frente a la necesidad de una plataforma de cribado de fármacos antitumorales y para proporcionar un punto de control antes de los experimentos costosa animales y ensayos clínicos, se propone un ensayo de citotoxicidad de sangre entera humana (WCA) para evaluar la eficacia del fármaco antitumoral en un entorno biológico más relevante. Laensayo de citotoxicidad de sangre entera se puede utilizar para evaluar la respuesta de las células individuales a los anticuerpos y otros candidatos a fármacos en sangre completa humana.
El WCA es desarrollado por la incorporación de la tecnología de alto rendimiento de posicionamiento celular con alto rendimiento y alto contenido de imágenes 6. Mediante la utilización de un sistema de imagen automático, el número de ambas células vivas y muertas se puede determinar con un alto grado de precisión. Debido al hecho de que las células diana se inmovilizan en el mismo plano focal, WCA es capaz de proporcionar análisis de citotoxicidad cuantitativa en tiempo real sin la eliminación de las células rojas de la sangre. Por otra parte, el sistema de imagen automática ofrece varias ventajas, tales como que sólo las células diana que han alcanzado los criterios especificados (por ejemplo., Células marcadas con fluorescencia, y la morfología celular) están cerradas y procesados. Además, permite la producción de 144 placas por día. En consecuencia, esta capacidad de imagen y rendimiento permite correr de alta contenido y experimentos de alto rendimiento al mismo tiempo. Mediante la combinación de WCA y el sistema de formación de imágenes automatizado, de alto rendimiento análisis de la citotoxicidad de células cuantitativa puede lograrse en un entorno más biológica relevante.
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Protocolo
1. Preparación de la célula de destino
- Mantener (por ejemplo, células de linfoma. Raji) células diana en medio de crecimiento (RPMI 1640 medio de cultivo, con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS), L-glutamina 4 nM, y 500 IU / ml de penicilina / estreptomicina) a 37 ° C en un incubador de CO2 al 5%.
- Centrifugar la muestra para sedimentar las células diana en un tubo de 15 ml. Tiempo de centrifugación varía con los diferentes tipos de células; centrifugar durante 3 minutos a 468 xg para las células Raji.
- Primera aspirar las burbujas formadas en la superficie del sobrenadante, y extraer todo el sobrenadante.
- Añadir 10 ml de PBS al tubo. Vuelva a suspender las células pipeteando la solución hacia arriba y abajo varias veces para romper el grupo de células.
- Centrifugar la muestra durante 3 min a 468 x g.
- Aspirar las burbujas formadas en la superficie del sobrenadante, y extraer todo el sobrenadante.
2. Preparación de células microarrays
- Ola unión de células btain 96 kits de placa así o diapositivas individuales conjunto de células 8 cámara así (véase la tabla de materiales / reactivos).
- Aplicar 1,2 l de la Activador al reactivo de ADN del kit. Tapar el frasco, invertirlo, y agitar suavemente para mezclar la solución.
- Deje que la solución para reaccionar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Aplicar la solución mixta al sedimento de células diana (en el tubo de 15 ml).
- Añadir colorantes verdes citosólicas de fluorescencia a una concentración final de 500 nM.
- Se incuban las células diana con la solución mezclada y el colorante durante 30 min a TA en un agitador orbital.
- Lavar las células dos veces con 5 ml de PBS, y resuspender las células en 10 ml de medios de crecimiento.
- Aplicar 100 l de la solución de la etapa 2.7 a cada pocillo. Contar el número de células utilizando un hemocitómetro. Hacer seguro que el número de células oscilan entre 5 × 10 4 a 1 x 10 6 células por pocillo.
- Después de 10-15 minutos de incubación a temperatura ambiente, lavar suavemente las muestras dos veces con 200-300 medios de crecimiento mu l para eliminar cualquier célula no unidas.
NOTA: Alrededor de 5-10 l medio de crecimiento permanece en cada pocillo después del lavado.
3. Sangre Total Ensayos de citotoxicidad
- Añadir 180 l de sangre entera humana a cada pocillo de muestra.
- Obtener solución de anticuerpo anti-CD20 a 5 mg / ml, y llevar a cabo una dilución en serie para hacer 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 mg / ml de solución de anticuerpo anti-CD20 en tubos de 1,5 ml. Añadir 20 l de cada concentración de anticuerpo anti-CD20 a cada pocillo de muestra haciendo triplicado.
- Añadir yoduro de propidio a una concentración final de 500 nM a cada pocillo.
- Incubar la placa resultante a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 16 horas.
- Imagen de las células en las diapositivas o placas de 96 pocillos con un sistema de imagen automática con magnificación de 8X.
- Utilice el programa de conteo de células del sistema de imagen automática para cuantificar los resultados.
NOTA: El software del sistema de imagen automática ofrece sencillapaso a paso las operaciones para el recuento celular. El protocolo de uso de este software se puede encontrar en el sitio web del proveedor. - Seleccione [Revisión de los resultados] en la página principal del software.
- Seleccione [el archivo guardado para las muestras].
- Primera puerta FITC intensidad media> 50, entonces la puerta TxRed intensidad media> 20.
- Seleccione [Información general Plate].
- Seleccione [Tablas de exportación].
NOTA: La fórmula muerte celular porcentaje del programa se muestra a continuación:
Asesinato% célula diana = (# de células teñidas tanto verde y rojo / # de células teñidas en verde) * 100%
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Resultados
Anti-CD20 anticuerpos y células de linfoma (células Raji y MC / CAR) fueron elegidos como un sistema modelo para demostrar el ensayo de citotoxicidad de sangre (WCA) 7,8. Células Raji tenido alto número de copias de CD20 en la superficie celular, mientras que las células MC / CAR tenían bajo número de copias de CD20 en su membrana. Células diana se tiñeron primero verde con tintes verdes citosólicas fluorescencia y dispuestos en la placa de 96 pocillos. 10000 - 50000 células de linfoma diana se inmovilizan en...
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Discusión
WCA es una crítica en herramienta de detección anti-cáncer vitro con células sola resolución 12/16, idealmente utilizado después de exámenes objetivos tradicionales, como los CDC y ensayos de ADCC 11.09, y antes de los ensayos con animales preclínicos. Actualmente, los ensayos de cribado diana primaria tales como CDC o ensayos de ADCC se llevan a cabo todos en un medio simplificados o un sistema tampón. Sin embargo, los fármacos candidatos que muestran eficacia en estos sistema ta...
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Divulgaciones
Autores no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos programa IMAT Instituto Nacional del Cáncer del NIH para la financiación de este trabajo [R33 CA174616-01A1].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Accesorio de celda Kits de placas de 96 pocillos | Adheren | AP9601 | |
| Suspensión Matriz de celda única Corredera de cámara de 8 pocillos | Adheren | SS0801 | |
| Adherente Matriz de celda única Portaobjetos de 8 pocillos | Adheren | SS0802 | |
| Línea celular de linfoma CD20 + | ATCC | CCL-86 | Células Raji |
| Línea celular de linfoma CD20-ATCC | CRL-8083 | MC/CAR | |
| RPMI 1640 con L-glutamina | Life Technologies | 11875-119 | |
| Suero fetal bovino | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Estreptococo | Life Technologies | 15070063 | |
| Colorante citosólico | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Sangre entera humana | Allcells | WB001 | |
| Yoduro de propidio | Sigma | P4170-10MG | |
| Sistema automático de imágenes | Dispositivos moleculares | Contactar Proveedor | Cell Reporter |
| Programa de recuento celular | Dispositivos moleculares | Contactar Proveedor | Cell Reporter |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
