En tiempo real Ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana

Resumen

El ensayo de citotoxicidad de sangre entera (WCA) es un ensayo de citotoxicidad desarrollado mediante la incorporación de alto rendimiento de la tecnología de posicionamiento celular con microscopía de fluorescencia y de procesamiento de imágenes automatizado. Aquí se describe cómo las células de linfoma tratados con un anticuerpo anti-CD20 se pueden analizar en tiempo real en toda la sangre humana para proporcionar un análisis de citotoxicidad celular cuantitativa.

Resumen

A sangre entera citotoxicidad ensayo basado en células en vivo (WCA) que permite el acceso a la información temporal de la citotoxicidad de las células en general se desarrolla con alto rendimiento de la tecnología de posicionamiento celular. Las poblaciones de células tumorales están dirigidas en primer lugar a la inmovilización preprogramados en un formato de matriz, y se marcaron con tintes verdes citosólicas fluorescentes. Después de la formación de conjunto de células, se añaden fármacos de anticuerpos en combinación con sangre humana entera. A continuación se añade yoduro de propidio (PI) para evaluar la muerte celular. El conjunto de células se analizaron con un sistema de imagen automático. Mientras tinte citosólica etiquetas de las poblaciones de células tumorales específicas, PI etiquetas de las poblaciones de células tumorales muertas. Por lo tanto, el porcentaje de muerte de células cancerosas diana se puede cuantificar mediante el cálculo del número de células supervivientes dirigidas al número de células diana muertas. Con este método, los investigadores son capaces de acceder dependiente del tiempo y la información de la citotoxicidad celular dependiente de la dosis. Sorprendentemente, ni radio peligrososse utilizan productos químicos. El WCA que aquí se presenta ha sido probado con el linfoma, la leucemia, y las líneas celulares de tumores sólidos. Por lo tanto, WCA permite a los investigadores para evaluar la eficacia del fármaco en una condición muy relevante ex vivo.

Introducción

Los avances recientes en la industria farmacéutica han llevado a un mayor interés en la realización de las identificaciones específicas de anticuerpos de células tumorales y los tratamientos de cáncer personalizadas; sin embargo, varios obstáculos se encuentran en el proceso. Sólo el 5% de los agentes que tienen actividad contra el cáncer en fase de desarrollo preclínico tienen licencia después de mostrar eficacia suficiente en fase de prueba II-III ^1,2. Las estrategias preclínicos (tanto in vitro como in vivo) son subóptimas como muchos ejemplos han demostrado que los fármacos antitumorales comportan de manera diferente en humanos y en animales d....

Protocolo

1. Preparación de la célula de destino

1. Mantener (por ejemplo, células de linfoma. Raji) células diana en medio de crecimiento (RPMI 1640 medio de cultivo, con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS), L-glutamina 4 nM, y 500 IU / ml de penicilina / estreptomicina) a ³⁷ ° C en un incubador de _CO2 al 5%.
2. Centrifugar la muestra para sedimentar las células diana en un tubo de 15 ml. Tiempo de centrifugación varía con los diferentes tipos de células; centrifugar durante 3 minutos a 468 xg para las células Raji.
3. Primera aspirar las burbujas formadas en la superficie del sobrenadante, y extraer todo e....

Resultados

Anti-CD20 anticuerpos y células de linfoma (células Raji y MC / CAR) fueron elegidos como un sistema modelo para demostrar el ensayo de citotoxicidad de sangre (WCA) ^7,8. Células Raji tenido alto número de copias de CD20 en la superficie celular, mientras que las células MC / CAR tenían bajo número de copias de CD20 en su membrana. Células diana se tiñeron primero verde con tintes verdes citosólicas fluorescencia y dispuestos en la placa de 96 pocillos. 10000 - 50000 células de linfoma diana se inmovilizan en.......

Discusión

WCA es una crítica en herramienta de detección anti-cáncer vitro con células sola resolución ^12/16, idealmente utilizado después de exámenes objetivos tradicionales, como los CDC y ensayos de ADCC ^11.09, y antes de los ensayos con animales preclínicos. Actualmente, los ensayos de cribado diana primaria tales como CDC o ensayos de ADCC se llevan a cabo todos en un medio simplificados o un sistema tampón. Sin embargo, los fármacos candidatos que muestran eficacia en estos sistema ta.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Accesorio de celda Kits de placas de 96 pocillos	Adheren	AP9601
Suspensión Matriz de celda única Corredera de cámara de 8 pocillos	Adheren	SS0801
Adherente Matriz de celda única Portaobjetos de 8 pocillos	Adheren	SS0802
Línea celular de linfoma CD20 +	ATCC	CCL-86	Células Raji
Línea celular de linfoma CD20-ATCC		CRL-8083	MC/CAR
RPMI 1640 con L-glutamina	Life Technologies	11875-119
Suero fetal bovino	Thermo	SH30070.01HI
Peni/Estreptococo	Life Technologies	15070063
Colorante citosólico	Life Technologies	C7025	Cell Tracker Green
Rituxan (Biosimilar)	Eureka Therapeutics
Sangre entera humana	Allcells	WB001
Yoduro de propidio	Sigma	P4170-10MG
Sistema automático de imágenes	Dispositivos moleculares	Contactar Proveedor	Cell Reporter
Programa de recuento celular	Dispositivos moleculares	Contactar Proveedor	Cell Reporter