Medición Espacial y Temporal Ca 2 + Las señales en plantas de Arabidopsis

Xiaohong Zhu; Aaron Taylor; Shenyu Zhang; Dayong Zhang; Ying Feng; Gaimei Liang; Jian-Kang Zhu

doi:10.3791/51945

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Medición Espacial y Temporal Ca^{2 +} Las señales en plantas de Arabidopsis

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DOI:

10.3791/51945

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2 de septiembre de 2014

Xiaohong Zhu¹ , Aaron Taylor² , Shenyu Zhang¹ , Dayong Zhang¹^,³ , Ying Feng¹^,⁴ , Gaimei Liang¹^,⁵ , Jian-Kang Zhu¹^,⁶

¹Department of Horticulture and Landscape Architecture, Purdue University, ²Bindley Bioscience Center, Purdue University, ³Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, ⁴College of Environmental & Resource Science, Zhejiang University, ⁵Dryland Agriculture Research Centre, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, ⁶Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

La señalización de Ca2 ⁺ regula diversos procesos biológicos en las plantas. Aquí presentamos los enfoques para el control de estrés abiótico inducida espacial y temporal Ca ^{2 +} señales en las células y tejidos que usan las codificados genéticamente Ca ^{2 +} indicadores Aequorina o Case12 Arabidopsis.

Resumen

Señales de desarrollo y ambientales inducen Ca ^{2 +} fluctuaciones en las células vegetales. Espacio-temporales de Ca ^{2 +-patrones} de estímulo específico son detectados por las proteínas de unión a Ca ^{2 +} celulares que inician Ca ^{2 +} cascadas de señalización. Sin embargo, todavía sabemos poco sobre cómo estímulo señales específicas Ca ^{2 +} se generan. La especificidad de una señal de Ca2 ⁺ puede atribuirse a la regulación sofisticada de las actividades de los canales y / o transportadores de Ca ^{2 +} en respuesta a un estímulo dado. Para identificar estos componentes celulares y entender sus funciones, es crucial usar sistemas que permiten una grabación sensible y robusta de señales de Ca ^{2 +,} tanto en el tejido y niveles celulares. Genéticamente codificados Ca ^{2 +} indicadores que están dirigidos a diferentes compartimentos celulares han proporcionado una plataforma para la célula viva imagen confocal de celulares Ca ^{2 +} señales. Aquí se describe la instruccións para el uso de dos sistemas de detección de Ca ^{2 +:} Aequorina basa FAS (adhesivo de película) plántulas luminiscencia Ca ^{2 +} de imágenes y basado case12 de fluorescencia confocal de células vivas Ca ^{2 +} de imágenes. De imágenes de luminiscencia usando el sistema FAS ofrece una detección simple, robusto y sensible de espaciales y temporales Ca ^{2 +} señales a nivel de los tejidos, mientras que la célula viva imagen confocal utilizando Case12 ofrece detección simultánea de citosólicas y nucleares Ca ^{2 +} señales con una resolución alta.

Introducción

La célula de la planta responde al medio ambiente a través de señalización que coordina las acciones celulares. Un evento de señalización temprana de la célula en respuesta a estímulos del medio ambiente es un aumento transitorio de Ca ^{2 +.} El patrón, o la firma de un aumento transitorio en la concentración de Ca2 ⁺ libre se caracteriza por su amplitud, frecuencia, y duración. Firmas Ca ^{2 +} espacio-temporales diferentes regulan diferentes actividades celulares ^1. Estímulos específicos, como el calor, el frío, la sal, la sequía, la luz o las hormonas vegetales, pueden afinar la actividad espacio-temporal de Ca ^{2 +} canales de membrana localizada y / o transportistas, lo que resulta en específicos de Ca ^{2 +} firmas. Aunque Ca ^{2 +} transportistas han sido bien caracterizado, se sabe poco sobre las identidades moleculares y las funciones de los canales de Ca ^{2 +} en las plantas ^1. Pantallas genéticos para mutantes con alteración de Ca ^{2 +} respuesta al estrés estímulos pueden ser un apr efectivaoach para la identificación de los componentes que componen las firmas de Ca ^{2 +.} Ca ^{2 +} sistemas de detección Recientemente basa varios Aequorina han sido desarrollados para facilitar las pantallas de genética para el Ca ^{2 +} señalización componentes en respuesta al ataque de patógenos y estrés abiótico ^2-4.

Aequorina fue utilizado por primera vez para detectar Ca ^{2 +} señales en plantas a principios de 1990 ^5. Desde entonces, la Aequorina se ha dirigido a diferentes compartimentos celulares, tales como el citoplasma ^5, el núcleo ^{6, 7} cloroplastos, tonoplasto ^{8, 9} mitocondrias, y el estroma ^10, así como a diferentes tipos de células en la raíz para supervisar celda específica Ca ^{2 +} señales ^11. Mediciones de Ca ^{2 +} basado Aequorina revelan la espacial y temporal Ca ^{2 +} respuesta de una población de células para estresar estímulos. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las respuestas de la Ca ^{2 +} de las células individuales son unsynchronizado en el tejido de responder ^4. Por lo tanto, la grabación Aequorina Ca ^{2 +} no informa necesariamente la señal de Ca ^{2 +} en las células individuales. En los últimos años, la proteína fluorescente codificada genéticamente (FP) a base de Ca ^{2 +} indicadores, como cameleon amarilla (YCs) ¹² y CASEs12 ¹³ se han utilizado para estudiar Ca ^{2 +} señalización con alta resolución subcelular. YCs son la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) a base de Ca ^{2 +} indicadores, que contiene PPC y YFP variantes vínculo del Ca ^{2 + vinculante} calmodulina proteína y péptido de unión a calmodulina-M13. La calmodulina sufre un cambio conformacional ya que se une a Ca ^{2 +,} con lo que trae PPC y YFP más cerca juntos, resultando en una mayor transferencia de energía (FRET mejorada). El nivel de FRET con el tiempo, más o menos calculado como la relación de las intensidades de señal de YFP PPC, refleja la dinámica intracelular de Ca ^{2 +.} Varias versiones TA se han utilizado en las plantas. YC3.6 era targeted al citosol ^14,15, el núcleo ^{16, 17} mitocondrias y membrana plasmática ^18, y YC4.6 y D4ER fueron atacados a Urgencias ^15,19, y D3cpv fue dirigido a los peroxisomas ^20. Las plantas transgénicas que expresan YCs permiten la formación de imágenes en vivo de células de Ca ^{2 +} dinámica dentro de los diferentes compartimentos celulares de diferentes tipos de células. Casos (presumiblemente Ca lcium sí Nsor) son proteínas individuales circularmente permutados fluorescentes (CPFPS) albergan una calmodulina y el péptido de unión a calmodulina-M13. Tras la unión a Ca ^{2 +,} CASEs sufren cambios conformacionales, llevando a un aumento de la intensidad de fluorescencia. La correlación entre la respuesta de fluorescencia del CASE y concentración de Ca2 ⁺ intracelular ^de Ca ^{2 +} permite la dinámica que se deben medir cuantitativamente. La variante Case12 ha 12 veces mayor fluorescencia en la Ca ^{2 +} formas saturados. N. plantas benthiminana transitoriamente expresser Case12 o plantas de Arabidopsis que expresan establemente caso 12 se utilizaron para estudiar Ca ^{2 +} señalización en defensa y abióticos de estrés ^4,21. Asíncrono espacial y temporal de Ca ^{2 +} oscilaciones en células que responden al ataque de patógenos, o al estrés deshidratación han sido reveladas con basado Case12 Ca ^{2 +} de imágenes.

A continuación, presentamos las instrucciones detalladas para Aequorina imágenes luminiscencia basada de tejidos y estímulos específicos de Ca ^{2 +} en la dinámica de plántulas de Arabidopsis, y de imagen confocal de citosólicas y Ca ^{2 +} dinámica nuclear en células de la raíz de Arabidopsis que expresan Caso 12. luminiscencia imágenes de FAS podría ser adaptado para analizar el estrés inducido por la dinámica de Ca2 ⁺ en las plantas o tejidos que no se describen aquí intactos, o para cribar poblaciones de plantas de Arabidopsis mutagenizadas para mutantes con el estrés alterada inducida por Ca ^{2 +} señales. La configuración de imágenes de células vivas Ca2 ⁺ podría adaptarse para analizar Ca2 + dinámicas dentro de diferentes compartimentos subcelular o en diferentes tipos de células utilizando otros indicadores de Ca ^{2 +.}