Aislamiento y cultivo de neuronas sensoriales disociadas De embriones de pollo

Resumen

Modelos de cultivo celular proporcionan un control detallado de las condiciones ambientales y por lo tanto constituyen una plataforma poderosa para dilucidar numerosos aspectos de la biología de las células neuronales. Se describe un método rápido, barato y fiable para aislar, disociar, y la cultura neuronas sensoriales de los embriones de pollo. También se proporcionan detalles de la preparación de sustratos y inmunocitoquímica.

Resumen

Las neuronas son las células multifacéticos que llevan la información esencial para una variedad de funciones incluyendo la sensación, el movimiento del motor, el aprendizaje y la memoria. El estudio de las neuronas in vivo puede ser un reto debido a su complejidad, sus variados y dinámicos ambientes, y las limitaciones técnicas. Por estas razones, el estudio de las neuronas in vitro puede resultar beneficioso para desentrañar los complejos misterios de neuronas. La naturaleza bien definida de modelos de cultivo celular ofrece un control detallado de las condiciones ambientales y variables. Aquí se describe cómo aislar, se disocian, y las neuronas de cultivo primario de embriones de pollo. Esta técnica es rápida, de bajo costo, y genera robustamente creciente neuronas sensoriales. El procedimiento produce consistentemente culturas que son altamente enriquecido para las neuronas y tiene muy pocas células no neuronales (menos de 5%). Neuronas primarias no se adhieren bien al vidrio sin tratar o de cultivo de plástico de tejido, por lo tanto, los procedimientos detallados para crear dos Distinct, sustratos que contiene laminina-bien definido para chapado neuronal se describen. Neuronas cultivadas son altamente susceptibles de múltiples técnicas celulares y moleculares, incluyendo co-inmunoprecipitación, imaginación de células vivas, RNAi, y inmunocitoquímica. Procedimientos para la doble inmunocitoquímica en estas neuronas cultivadas se han optimizado y descrito aquí.

Introducción

Las neuronas son las células complejas que llevan la información esencial para una variedad de funciones, incluyendo la sensibilidad, la visión, el movimiento del motor, el aprendizaje y la memoria. Único de otros tipos de células, las neuronas extienden procesos como brazos, llamadas axones, para formar carreteras neuronales esenciales para la comunicación. Durante compartimentos de desarrollo especializada ubicados en las puntas de los axones en crecimiento, llamada conos de crecimiento, navegar a través de un concierto de señales extracelulares para liderar el axón hasta su destino apropiado. Los mecanismos moleculares que subyacen a la navegación intrincados cono....

Protocolo

1. Cubreobjetos Preparación: Acid Wash y Hornear

1. Por lo menos 2 días antes de la disección (paso 2), comenzará los siguientes pasos para preparar cubreobjetos. Lleve a cabo el paso de lavado ácido para eliminar aceites y cubreobjetos limpiar a fondo.
2. Cubreobjetos de carga en el soporte de la porcelana que posiciona verticalmente cubreobjetos y evita que se toquen entre sí. Sumerja titular y cubreobjetos en un recipiente de vidrio lleno histología con ácido clorhídrico 2 M (HCl). Alternativamente, si soporte de porcelana no está disponible, se extendió ~ 20 cubreobjetos horizontalmente para cubrir la parte inferior de 100 mm de vidrio placa de Pet....

Resultados

El protocolo descrito aquí permite a los investigadores a la cultura una población enriquecida de neuronas sensoriales embrionarias disocian con muy pocas células (por ejemplo, <5%) no neuronales ^7,8,10,16. Numerosos GRD pueden ser obtenidos de la lumbosacra, regiones torácica y cervical. Dependiendo de las necesidades del investigador, los GRD de estas regiones anatómicas distintas se pueden aislar fácilmente. Por ejemplo, la Figura 1 muestra imágenes del embrión de pollo a travé.......

Discusión

Aquí presentamos protocolos detallados para el aislamiento y cultivo disociados neuronas sensoriales de un embrión de pollo. Este procedimiento genera una población enriquecida de neuronas robusto crecimiento in vitro ^7,8,10,16. Numerosas técnicas celulares y moleculares se pueden aplicar a estas neuronas cultivadas, incluyendo inmunocitoquímica, que se describe aquí. Este protocolo se utilizó recientemente para evaluar cuantitativamente la intensidad de las integrinas activadas inmunomarcadas en los.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo pequeñas estériles (35 mm)	Corning	430165
Placas de cultivo grandes estériles (100 mm)	Falcon	353003
Placas de Petri grandes estériles (100 mm)	VWR	89000-302
Placa de Petri de vidrio (100 mm)	VWR	D108962
Pinzas finas	Fine Science Tools	11251-10
Pinza estándar	Fine Science Tools	1100-12
Cubreobjetos (22 x 22 mm)	Fisher	12 518 105K	0,13-0,17 mm de grosor óptimo para la microscopía
Portacubreobjetos de porcelana	Thomas scientific	8542E40
Suero fetal bovino	Gibco	17502-048	uso 50 ml de alícuotas por cada 500 ml de medios de jamón F12
HCl	VWR	VW3204-1	uso a 2 M, se puede usar dos veces antes de desechar
NaCl	Sigma	S9888	use 5 M solución de NaCl para laminina-1 solución madre
Laminin-1	Invitrogen	23017-015	Agregue 72 µ l de NaCl estéril 5 M y alícuota en 50 µ l
15 ml Tubo cónico	de tratamiento	celular 229411
PBS CMF 10x	Gibco	14200	usado a 1x, diluido con agua filtrada Millipore estéril
PBS 10x	Gibco	14080	usado a 1x, diluido con agua filtrada Millipore estéril
Ham's F12	Lonza	12-615F
Albúmina sérica bovina fetal (BSA)	Gibco	10438	uso en F12HS20 al 10%
HEPES		Sigma H3375	hacer una solución estéril de 1 M en agua destilada, diluir en medios F12 para obtener una concentración final de 10 mM de
penicilina/estreptomicocina	Sigma	P0781	usar 5 ml en 500 ml de medios F12
NT3	Millipore	GF031	Añadir 1 ml de agua Millipore estéril, alícuota en condiciones estériles, almacenar a -20 °C; C, úselo a la concentración final de 10 ng/ml en medios F12H, manténgalo en -20 & deg; C congelador sin descongelación
NGF	RnD systems	256-GF	Añadir 1 ml de 1x PBS estéril con 0,1% de BSA, alícuota en condiciones estériles, almacenar a -20 ° C, utilizado a una concentración final de 10 ng/ml en medio F12H
L-Glutamina	Sigma	G7513	alícuota en condiciones estériles, almacenar a -20 °C; C, uso a la concentración final de 200 mM en medios F12H
Tripsina	Sigma	T4049	alícuota en condiciones estériles, almacenar a -20 & grados; C
Albúmina sérica bovina (BSA)	Gibco	15260
Otros artículos necesarios: instrumentos generales de disección, incluidas pipetas Pasteur de vidrio, huevos de gallina leghorn blancos fértiles, incubadora de huevos de control (humidificada, 37 & deg; C), cámara de incubación celular (humidificada, 37 ° C), campana de flujo laminar, visor
Immunocytochemistry Reagents Table
Sacarosa	Sigma	S9378	utilizada en solución fijadora (4% paraformaldehído, 30% sacarosa, 2x PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldehído	Sigma	P6148	utilizado en solución fijadora (4% paraformaldehído, 30% sacarosa, 2x PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Suero normal de cabra	Life technologies	PCN500
Portaobjetos de microscopio	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Anticuerpo contra NCAM	Millipore	AB5032	policlonal
contra activado y beta; 1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Secondary Antibody Table
Goat anti-ratón IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Cabra anti-conejo IgG Alexa 548	Life technologies	A11036

de disección de estereovisión binocular Anticuerpo