El ensayo de formación de colonias en agar blando

Resumen

El ensayo de formación de colonias de agar blando es un método utilizado para confirmar el crecimiento independiente del anclaje celular in vitro. El objetivo de este protocolo es ilustrar un método estricto para la detección del potencial tumorigénico de las células transformadas y los efectos supresores de tumores de las proteínas en las células transformadas.

Resumen

El crecimiento independiente del anclaje es la capacidad de las células transformadas para crecer independientemente de una superficie sólida, y es un sello distintivo de la carcinogénesis. El ensayo de formación de colonias de agar blando es un método bien establecido para caracterizar esta capacidad in vitro y se considera una de las pruebas más estrictas para la transformación maligna en las células. Este ensayo también permite la evaluación semicuantitativa de esta capacidad en respuesta a diversas condiciones de tratamiento. Aquí, demostraremos el ensayo de formación de colonias de agar blando utilizando una línea celular de carcinoma de pulmón murino, CMT167, para demostrar los efectos supresores tumorales de dos miembros de la vía de señalización Wnt, Wnt7A y Frizzled-9 (Fzd-9). La sobreexpresión concurrente de Wnt7a y Fzd-9 causó una inhibición de la formación de colonias en las células CMT167. Esto demuestra que la expresión del ligando Wnt7a y su receptor Frizzled-9 es suficiente para suprimir el crecimiento tumoral en un modelo de carcinoma de pulmón murino.

Introducción

El ensayo de formación de colonias en agar blando es una técnica ampliamente utilizada para evaluar la transformación celular in vitro. Históricamente, se utilizó otro ensayo, el ensayo clonogénico, descrito por Puck et al. En 1956 para evaluar la capacidad de las células para formar colonias ^1. En esta técnica, las células se dispersaron en una placa de cultivo y se cultivaron en la presencia de células alimentadoras '' o medio acondicionado para proporcionar factores de crecimiento necesarios. La limitación de esta técnica es que sólo se proporciona información con respecto a la formación de colonias. Las células normales se imp....

Protocolo

1. Preparación de Materiales y Reactivos

1. Etiquetar cada pocillo de un cultivo de tejido tratado placa de 6 pocillos adecuada para cada línea celular o condición objeto de la investigación.
2. Preparar medio de cultivo celular 2x disolviendo 1 g de medio en polvo y 0,2 g de bicarbonato de sodio en agua desionizada hasta un volumen final de 50 ml.
3. Pasar este medio a través de un filtro de 0,2 micras para esterilizar.
4. Añadir componentes adicionales necesarios para el cultivo normal de la línea celular de interés. Por ejemplo, crecer CMT línea 167 de células en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina / estrepto....

Resultados

La expresión de Wnt7a y Fzd9 en CMT167 células es eficaz en la supresión de tumores, como se ilustra por nuestro ensayo de formación de colonias en agar blando. Preliminarmente, se utilizó Q-PCR para demostrar que Wnt7a y Fzd9 ARNm se expresan en niveles bajos en CMT167 células. CMT167 células mostraron bajos niveles de endógeno Wnt7a y Fzd9 cuando se compara con MLE-12 células, un murino línea de células epiteliales de pulmón transformada con SV40 (Figura 1). A continuación, las células transfectadas C.......

Discusión

En confirmación vitro de la función supresora de tumor de las proteínas de señalización es difícil. Uno de los ensayos más rigurosos disponibles para investigar esta propiedad es el ensayo de formación de colonias en agar blando. Aquí, hemos ilustrado el ensayo de formación de colonias en agar suave utilizando una línea celular de carcinoma de pulmón murino de forma estable y que sobreexpresan Wnt7a Fzd9 comparación con su padres línea celular CMT167.

Hay varios puntos impo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea celular de cáncer de interés	Sigma-Aldrich	10032302	células CMT-167
en polvo RPMI 1640 Medio	Gibco	31800-089	Se utiliza para preparar 2 veces el medio de cultivo celular.
Líquido RPMI 1650 Medio	Cellgro	10-040-CV	Referido como 1x medio de cultivo celular.
Suero Fetal Bovino	HyClone	SH30910.03	Se utiliza para complementar el medio de cultivo celular.
Penicilina/Estreptomicina	CellGro	30-002-Cl	Utilizada en medio de cultivo celular.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Se utiliza para preparar agar al 1,0% y al 0,6%.
Bicarbonato de sodio	Fisher	BP-328-1	Utilizado en 2x medio de cultivo celular.
Tripsina	Cellgro	25-050-Cl
Filtros estériles con tapa de botella	Fisher	09-761-126	Se utiliza para filtrar estéril 2x medio.
Reactivo de lipofectamina	Invitrogen	18324-020	Utilizado en el ensayo de luciferasa PPAR-RE.
Placas de 6 pocillos tratados con cultivo de tejidos 37
° C/5% CO2 Incubadora
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Se utiliza para tomar fotografías de colonias.
Cantidad Un software	Bio-Rad		Se utiliza para contar las colonias de células.
15 ml Tubos Cónicos 50
ml Tubos Cónicos 250
ml Matraces
Microondas
5 ml Pipetas serológicas
Pipeta Aid
Microscopio
Centrífuga
Guantes
Cubitera
Saran Wrap

Erlenmeyer Micropipeta Hemacitómetro con tapa Puntas de pipeta deslizantes de luz invertidaresistentes al calor