Summary
مثقف organoids سرداب صغير في الأمعاء فيفو السابقين توفير نظام زراعة الأنسجة الذي يلخص نمو أقبية تعتمد على الخلايا الجذعية ومكانها المناسب. أنشأنا طريقة لفحص الملف الشخصى الأيض في الوقت الحقيقي في الماوس الأساسي organoids سرداب. وجدنا organoids الحفاظ على الخصائص الفسيولوجية التي يحددها مصدرها.
Abstract
الغشاء المخاطي في الأمعاء الصغيرة يسلك العمارة المتكررة تنظيمها في اثنين من الهياكل الأساسية: الزغب، وإسقاط في لمعة الأمعاء وتتألف من المعوية ناضجة، والخلايا الكأسية والخلايا enteroendocrine. والأقبية، ويقيم الأقرب إلى تحت المخاطية والعضلية، بإيواء الجذعية البالغة والخلايا الاولية والخلايا الناضجة بانيت، وكذلك انسجة والخلايا المناعية للالمكروية سرداب. حتى السنوات القليلة الماضية، في الدراسات المختبرية من الأمعاء الدقيقة اقتصر على خطوط الخلايا المشتقة من الأورام إما حميدة أو خبيثة، ولم تمثل فسيولوجيا الظهارة المعوية الطبيعية وتأثير المكروية التي يقيمون فيها. هنا، ونحن لشرح طريقة مقتبسة من ساتو وآخرون (2009) لزراعة organoids سرداب الماوس المعوية الأولية المستمدة من C57BL / 6 الفئران. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم استخدام الثقافات عضي سرداب لفحص الملف الشخصى الأيض سرداب في الوقت الحقيقي من خلال قياسمنة من استهلاك الأكسجين القاعدية، ومعدل حال السكر، وإنتاج ATP والقدرة التنفسية. Organoids الحفاظ على الخصائص التي حددها مصدرها والاحتفاظ جوانب التكيف الأيض الخاصة التي تعكسها معدلات استهلاك الأوكسجين وتحمض خارج الخلية. في الوقت الحقيقي الدراسات الأيضية في هذا سرداب عضي نظام الثقافة هي أداة قوية لدراسة سرداب استقلاب الطاقة عضوي الشكل، وكيف يمكن التضمين من قبل العوامل الغذائية والدوائية.
Introduction
سرطان القولون (CRC) هو ثالث سبب رئيسي لوفيات السرطان ذات الصلة في الولايات المتحدة. سرطان القولون متفرقة - أي أن تنشأ في وقت لاحق في الحياة (> 50 سنة من العمر) مع وجود عوامل وراثية واضحة المهيئة - حسابات ل~ 80٪ من جميع الحالات، مع حدوث يتأثر بقوة الأنماط الغذائية على المدى الطويل 1،2. هذه الأورام تظهر تحولا الأيض نحو الاعتماد على تحلل الأكسدة، والمعروفة باسم تأثير اربورغ، والتي قد تجعل جزء في تركيزات أعلى من اللبنات الخلوية والطاقة المتوفرة (من خلال glutaminolysis) للسماح وربما دفع معدلات عالية من انتشار الخلايا السرطانية 3-5 . دراسات الإصابة بسرطان القولون وكذلك سرطانات الجهاز الهضمي الأخرى بما في ذلك سرطانات الأمعاء الصغيرة توفر نظرة متبصرة في قضية تشكيل الورم. التحقيق في الخلافات بين الدول الأيض العادية، الموالية للمكون للأورام ومكون للأورام من نظم الجهاز الهضمي قد تساعد ديتermination من الخطر النسبي لتطور الورم، وكذلك الكشف المبكر عن الأورام. وعلاوة على ذلك، فإن فهم عملية الأيض الطاقة البيولوجية التي تنطوي على التنفس الميتوكوندريا وتحلل توفير البصيرة الأساسية في كيفية يشوش فسيولوجيا الخلايا والشيخوخة والمرض حالة توازن الأمعاء. الاستفادة من تكنولوجيا الطاقة الحيوية الفحص لتحليل تدفق خارج الخلية يمكن تقييم معدلات التنفس الميتوكوندريا وتحلل في وقت واحد في الخلايا نموا في الثقافة في الوقت الحقيقي 6،7.
حتى وقت قريب، في الدراسات المختبرية من الأمعاء الدقيقة اقتصرت على خطوط الخلايا المشتقة من الأورام إما حميدة أو خبيثة 8،9 ولا تمثل فسيولوجيا الظهارة المعوية الطبيعية وتأثير المكروية التي يقيمون فيها. في عام 2009، قدم ساتو وآخرون. 10 وخارج الحي نظام الثقافة في النمو ثلاثي الأبعاد (3D) الماوس organoids الظهارية في الأمعاء، أو epithelial "مصغرة الشجاعة"، ومناسبة للالتحقيقات التجريبية والتشخيصية والعلاجية 10،11. وعلاوة على ذلك، الأقبية المعزولة من الفئران مقيدة بالوحدات الحرارية تحافظ على خصائص النمو المتغيرة كما organoids في مثل هذه الثقافات 12. بالمقارنة مع خطوط الخلايا تحولت والثقافات عضي سرداب يمكن استخدامها لتوليد البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية تقديم نموذج أفضل بكثير لفهم الدولة في الجسم الحي.
نحن تكييفها تكنولوجيا تحليل الطاقة الحيوية لفحص استقلاب الطاقة من organoids سرداب الأمعاء. كان الفأر organoids سرداب الأمعاء مثقف فيفو السابقين لتطوير الدراسات استقلاب الطاقة عضي سرداب المقدمة. تم قياس معدل استهلاك الأكسجين (OCR)، و سعر تحمض خارج الخلية (ECAR) من organoids سرداب في غياب وجود اثنين من مثبطات مختلفة الأيض (أوليغوميسين، روتينون) وحاملة أيون (الكربونيل السيانيد-P-trifluoromethoxyphenylhydrazone). وORGA سردابوقد عكست استجابة الأيض NOID لهذه المركبات الكيميائية بنجاح من خلال تغيير ECAR والقيم OCR.
ودراسات الطاقة البيولوجية الخلوية توضيح التفاعلات المتبادلة بين دولة الأيض ومخاطر المرض والنمط الظاهري في السرطان، والسمنة، والسكري، والاضطرابات الأيضية وأمراض الميتوكوندريا وتساعد أساليب الفحص مسبقة مع آثار مباشرة على الطب متعدية. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لعزل الأقبية الأمعاء الصغيرة وللثقافة organoids سرداب. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم طريقة جديدة لاستخدام الثقافات عضي سرداب لفحوصات الأيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاق للتجارب على الحيوانات في كلية ألبرت أينشتاين للطب.
1. القبو العزلة والثقافة
- عزل الأقبية من الأمعاء الدقيقة:
- عزل الأقبية الأمعاء من أي نموذج الفئران من الفائدة. الموت ببطء الفئران مع CO 2 تليها خلع عنق الرحم.
- فتح البطن طوليا وملء الأمعاء الدقيقة (SI) بمحلول ملحي بارد الجليد الفوسفات مخزنة، PBS (-Ca 2+، -Mg 2+) مع 2X للمضادات الحيوية مضاد فطري (مكافحة المضادة). بسرعة عزل الأمعاء الدقيقة.
- تشريح دقيق خال من الدهون المساريقي باستخدام مشرط. احرص على عدم خرم الأنسجة - في جميع الأوقات الحفاظ على الأنسجة رطبة مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. فتح الأسواق العالمية ضغطهاستاين طوليا ويغسل جيدا بالماء والثلج البرد PBS.
- قطع الأمعاء الدقيقة إلى قسمين وتتسطح بها باستخدام تلميح القطن مبللة، بلطف كشط الزوائد باستخدام شريحة تبريد مسبقا. يغسل بقوة في الجليد الباردة PBS عدة مرات.
- احتضان 3 دقائق في 20 مل 1X PBS في 3 ملي حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) /0.5 ملي dithiothreitol (DTT) لتفارق غير الأنزيمية للأنسجة.
- قطع الأنسجة الى قطع صغيرة (2-4 ملم) باستخدام شفرة حلاقة على شريحة تبريد مسبقا. نقل قطع في أنبوب 50 مل تحتوي على 20 مل PBS الباردة الجليد.
- ماصة بلطف صعودا ونزولا 10X باستخدام 10 مل ماصة معقمة المتاح. السماح شظايا الأنسجة الرواسب بفعل الجاذبية. إزالة طاف مع ماصة. كرر ثلاث مرات إضافية؛ التأكد من طاف هو واضح.
- إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني في 2 ملي EDTA. دوامة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع هزاز لطيف.
- ترك رواسب الأنسجة وتجاهل طاف. إضافة 15 مل PBS الجليد البارد وماصةصعودا وهبوطا 5X مع ماصة 10 مل. السماح للشظايا الأنسجة الرواسب وجمع طاف كما الكسر 1 (F1). تكرار جمع F2-F5، كل جزء على حدة المحافظة.
- إضافة 15 مل PBS الجليد الباردة وهذه المرة هزة بقوة باليد لمدة 15 ثانية. جمع F6 وتكرار لF7، F8. إذا قطع الأنسجة تبدأ تطفو، انقر لمساعدتهم على الاستقرار.
- تفقد قسامة من كل جزء تحت المجهر. بركة تلك الكسور التي تحتوي الأقبية.
- تمرير الكسور المجمعة خلال 70 ميكرون خلية النايلون مصفاة، وجمع الأقبية في أنبوب 50 مل.
- الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف و resuspend بيليه في 10 مل PBS الجليد الباردة مع 2X أقبية مكافحة معاداة ونقل إلى أنبوب 15 مل. تكرار غسل واحد لمزيد من الوقت.
- غسل الخبايا مرة واحدة مع 10 مل من الجليد البارد ADF، DMEM المتقدم / F-12 (Dulbecco "ليالي التعديل النسر متوسطة / هام" ليالي F-12) - 2X مكافحة المضادة.
- غسل الخبايا مرة واحدة مع 10 مل وDF - 1x أخرى مضادة للمكافحة.
- عد الخبايا باستخدام عدادة الكريات. ضبط مستوى الصوت حل سرداب ونقل إلى أنبوب 1.5 مل بحيث تركز سرداب النهائي عندما معلق سيكون 100-500 الأقبية في 50 ميكرولتر من مزيج هلامي البروتين (Matrigel). الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و resuspend الأقبية في خليط من البروتين هلامي.
- لوحة 50 ميكرولتر من سرداب - هلامي تعليق خليط من البروتين لكل بئر في لوحة 24-جيدا (منطقة النمو: 2 سم 2)، ووضع بعناية قطرة تعليق في وسط كل بئر. الحفاظ على لوحة في CO 2، 37 ° C حاضنة لل~ 30 دقيقة حتى يتصلب تعليق.
- إضافة 500 ميكرولتر وسائل الإعلام ثقافة الجليد الباردة كاملة (متقدم DMEM / F12 مع 1X المضادة - المعادي، 10 ملم 4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES)، 1X GlutaMAX، 1X B27 الملحق، الملحق 1X N2، 1 ملم N-أسيتيل-L-سيستين (NAC)، 50 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي)، و 100 نانوغرام / ملرأس، و 500 نانوغرام / مل R-Spondin).
- إعادة تشكيل عوامل النمو في 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) في برنامج تلفزيوني.
- سرداب عضي الثقافة والممر:
- مرور organoids سرداب 14-21 يوما بعد البذر (أو حسب الحاجة) على النحو التالي:
- تغيير وسائل الاعلام كل يوم جمعة والاثنين. يوم الأربعاء، استبدال نصف وسائل الإعلام مع وسائل الاعلام الطازج.
- إزالة مستنبت. غسل العينة مرتين مع 500 ميكرولتر PBS في فترات 5 دقائق.
- إزالة برنامج تلفزيوني وكسر بلطف صعودا وخليط من البروتين هلامي باستخدام ماصة معقمة P1000 الحافة الصغيرة.
- إضافة 1 مل كامل وسائل الإعلام ثقافة لبئر واحد و resuspend organoids في 1 مل سائل الإعلام.
- تعطيل بلطف organoids باستخدام P1000 pipetting صعودا وهبوطا 20-30x (فحص تحت المجهر للتفكك عضوي الشكل الصحيح مع تحقيق عائد جيد حتى سرداب تقنية متسقة تم تطويرها).
- نقل الخبايا لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل.الطرد المركزي في 100 x ج في 4 درجات مئوية، 5 دقائق.
- يغسل بيليه مرتين مع 1 مل كامل وسائل الإعلام الثقافة.
- انقسام في نسبة 1: 3 أو 1: 6 حسب الحاجة، أقبية إعادة التعليق في 50 ميكرولتر Matrigel لكل بئر. المضي قدما على النحو المبين أعلاه (القسم 1.1.16-18).
- مرور organoids سرداب 14-21 يوما بعد البذر (أو حسب الحاجة) على النحو التالي:
- سرداب تجميد عضي:
- إزالة مستنبت. غسل العينة في 500 ميكرولتر PBS.
- تفريق خليط من البروتين هلامي باستخدام طرف P1000 ماصة.
- إضافة 1 مل سائل الإعلام لبئر واحد و resuspend organoids في 1 مل سائل الإعلام.
- كسر بلطف حتى organoids باستخدام P1000 pipetting صعودا وهبوطا 20-30x.
- نقل organoids إلى أنبوب 1.5 مل. الطرد المركزي في 100 x ج في 4 درجات مئوية، 5 دقائق.
- يغسل بيليه مرتين مع 1 مل كامل وسائل الإعلام الثقافة.
- أقبية resuspend في 500 ميكرولتر تجميد وسائل الإعلام.
- أقبية نقل إلى cryotube، ووضع أنبوب في وعاء تجميدها وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية overniGHT.
- نقل إلى أقبية السائل N 2 خزان.
- استعادة organoids سرداب المجمدة من قبل ذوبان بسرعة في 37 ° C حمام الماء. يغسل مع 500 ميكرولتر كامل وسائل الإعلام ثقافة واحدة، الطرد المركزي في 100 x ج، 5 دقائق و resuspend في هلامي خليط من البروتين، والثقافة كما هو موضح أعلاه. لاستعادة أفضل، إضافة مثبط ROCK (Y-27632) لوسائل الإعلام التجميد.
2. القبو عضي الأيض الفحص
- 24-الآبار إعداد اللوحة:
- عزل الأقبية والاعتماد وفقا لبروتوكول (انظر القسم 1.1 لعزل سرداب والقسم 1.2 للسرداب مرور).
- resuspend في أقبية هلامي خليط من البروتين (100-200 الأقبية في 20 ميكرولتر).
- لوحة-سرداب هلامي خليط من البروتين تعليق في لوحة الفحص 24-جيدا (للتأكد من أن هناك على الأقل ثلاث نسخ لكل عينة) والسماح للتعليق على يصلب عند 37 درجة مئوية في CO 2حاضنة. ثم إضافة 500 ميكرولتر الكامل سائل الإعلام والثقافة.
- أقبية الثقافة (كما هو موضح في القسم 1.1) ونلاحظ تحت المجهر حتى تنمو في أقبية organoids تطويره بالكامل.
- خارج الخلية الجريان الفحص:
- خرطوشة هيدرات بين عشية وضحاها في 2 غير CO (0٪ CO 2)، 37 درجة مئوية الحاضنة.
- إزالة مستنبت وغسل organoids مرتين مع 500 DMEM ميكرولتر (بدون: الجلوكوز والجلوتامين L-، البيروفات الصوديوم وبيكربونات الصوديوم، ومع: أحمر الفينول). انتظر 5 دقائق.
- إضافة 675 ميكرولتر لكل المتوسطة الفحص جيدا (DMEM مع 2 مم L-الجلوتامين و 5 ملي مد الجلوكوز) إلى كل بئر.
- تحقق سرداب organoids التشكل المجهري للتأكد من أن organoids وخليط من البروتين هلامي وسليمة بعد يغسل. احتضان 1 ساعة في غير ثاني 2، 37 درجة مئوية الحاضنة.
- إعداد 10 ميكرومتر المركبات عن طريق الحقن (أوليغوميسين، الكربونيل السيانيد-P-trifluoro-ميثوكسي فينيل هيدرازون (FCCP)، صotenone) في مقايسة المتوسطة.
- انشاء خرطوشة عن طريق تحميل 75 ميكرولتر من 10 ميكرومتر المركبات عن طريق الحقن في موانئ بالتتابع خرطوشة: ميناء A - أوليغوميسين. ميناء ب - FCCP. وميناء C - روتنون (تركيزات النهائية خلال الفحص سوف يكون 1 ميكرومتر).
- احتضان خرطوشة 30 دقيقة - 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 2-CO غير.
- في نفس الوقت، تشغيل محلل XF وخلق القالب بروتوكول الفحص.
- ضع خرطوشة والمرافق في لوحة XF محلل وتشغيل "معايرة" خرطوشة.
- تحقق organoids سرداب مجهريا للتأكد من أنها هي التي تعلق إلى خليط من البروتين هلامي.
- لوحة الثقافة خلية الحمل في بروتوكول أداة فحص وتشغيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إنشاء organoids سرداب من 8 أشهر من العمر C57BL / 6 الفئران التي غذيت تنقية القوارض الحمية المعهد الأمريكي للتغذية 76A (AIN76A). يمكن زراعتها organoids سرداب الأمعاء في الثقافة لفترات طويلة من سرداب واحد (الشكل 1A، السهم الأحمر واحد). Organoids تنمو خارج هياكل شبيهة سرداب في 18-20 أيام في الثقافة (الشكل 1B، السهام الحمراء). تم passaged أقبية كل 3 أسابيع وorganoids تعافى بشكل فعال بعد كل مرور.
فرس البحر أجهزة الطاقة الحيوية يمكن تقييم معدلات التنفس الميتوكوندريا وتحلل في وقت واحد في الخلايا نموا في الثقافة في الوقت الحقيقي. نحن تكيف هذه التكنولوجيا لفحص الأيض عضوي الشكل سرداب. مع organoids المستمدة من الفئران تتغذى AIN76A تنقية النظام الغذائي لمدة 8 أشهر، وقياس: 1 معدل استهلاك الأوكسجين، OCR هو مبين في الشكل 2A - الخط الأحمر يمثل معدل استهلاك الأوكسجين (بمول / دقيقة) في organoids سرداب والأزرق هو الآبار المراقبة الإلكترونية فقط مع Matrigel (خليط من البروتين هلامي)؛ 2. معدل تحمض خارج الخلية (ECAR) هو مبين في الشكل 2B - الخط الأحمر يمثل معدل تحمض خارج الخلية (ميل / دقيقة) في organoids سرداب والأزرق هو آبار المراقبة فقط مع خليط من البروتين هلامي.
الرقم 1: organoids قبو المستمدة من 8 الشهر القديمة C57BL / 6 الفئران الأقبية هي (A) 2-أيام أو (ب) 18 يوما في الثقافة. الحجم: 100 ميكرون.
الشكل 2: الطاقة الحيوية الفحص باستخدام organoids المستمدة من 8 الشهر القديمة C57BL / 6 الفئران. (A) معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) هو مبين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن اختبار معدل استهلاك الأوكسجين (OCR)، و سعر تحمض خارج الخلية (ECAR) من الأقبية المعزولة من الفئران البالغة 8 أشهر ونمت لتصبح organoids خارج الحي، وبعد قياس معدل القاعدية، تم تقييم الأيض سرداب بإضافة أوليغوميسين، الكربونيل السيانيد -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) وروتينون، بالتتابع.
سجلت القاعدية OCR وECAR القاعدية 0-29 دقائق (الشكل 2A و 2B). في ال 29 دقيقة، تم حقن أوليغوميسين (من ميناء A) في كل بئر (ن = 3، ولكل من أقبية وآبار المراقبة). أوليغوميسين هو المانع التوليف اعبي التنس المحترفين. فهو يستخدم لمنع الدولة 3 (phosphorylating) التنفس. وبالتالي، أدى أوليغوميسين حقن في انخفاض طفيف في التعرف الضوئي على الحروف، وذلك بسبب الحصار المفروض على تخليق ATP في الميتوكوندريا، والخبايا تحولت إلى تحلل لتلبية احتياجاتهما لاعبي التنس المحترفين مما أدى إلى زيادة في ECAR. في ال 64 دقيقة، FCCP (جيئة وذهاباتم حقن م ميناء B) في كل بئر. FCCP هو الناقل أيون المحمول، ونقل أيونات الهيدروجين عبر غشاء الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى استهلاك الطاقة سريع دون الحاجة لتوليد ATP. زيادة OCR بسبب فك ربط وزيادة ECAR منذ حافظت الخبايا توازن الطاقة لديها من خلال توظيف تحلل لتوليد ATP، وبالتالي تجميع وإفراز حمض اللبنيك. في ال 99 دقيقة، تم حقن روتينون (من ميناء C) في كل بئر. روتينون هو المانع من الميتوكوندريا. وبالتالي، أدى حقن الثالث إلى انخفاض في OCR بسبب ضعف وظيفة الميتوكوندريا تحول الخبايا إلى حالة أكثر حال السكر الحفاظ على القيم ECAR مرتفعة.
هناك نتيجتين رئيسيتين: 1) organoids سرداب من الفئران القديمة 8 أشهر وتم زرعها بنجاح من خلال ممرات متعددة؛ 2) organoids التي تم passaged في الثقافة لمدة 2 أشهر بعد تعرض الاشتقاق استجابة التمثيل الغذائي للأوليغوميسين، الكربونيل السيانيد-P-trifluoromethoxyphen ylhydrazone وروتينون. وبالتالي، كانت القدرة حال السكر من organoids مستقرة بعد 2 أشهر في الثقافة، بما يتفق مع التقرير الذي organoids من الفئران مقيدة نسبيا بالوحدات الحرارية وتكييفها بشكل دائم في نمو مختلف الظواهر والتمثيل الغذائي في الثقافة 12.
فإن الإجراءات التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول تكون ذات أهمية كبيرة في دراسات التمثيل الغذائي من أقبية المعوية. ويتم تكييف بروتوكول للسرداب بمعزل عن ساتو وآخرون. 10 بروتوكول لدراسة التمثيل الغذائي في سرداب المعوية الثقافات عضي سرداب الصغيرة باستخدام الطاقة الحيوية لم يتم الابلاغ عن تكنولوجيا التحليل. ويمكن تمديد الدراسات الأيض عضي سرداب إدخال المزيد من المتغيرات المختلفة لوسائل الإعلام والثقافة، والظروف الفحص، مثل مصادر الطاقة المختلفة، مثبطات ومنشطات من إشارات محددة والمسارات الأيضية، وظروف نقص الأوكسجين يمكن أن تعدل المسارات الأيضية.
ontent "> هناك قضايا التقنية التي تتطلب اهتماما خاصا عند تطبيق هذه البروتوكولات. قد تختلف عدد قبو وكفاءة نمو الثقافات عضي سرداب اعتمادا على مصدر سرداب، مثل أقبية من الفئران المعدلة وراثيا مقابل نوع البرية. وهكذا، كثافة البذر سرداب يمكن تعديلها لإجراء التجارب عن طريق تشغيل محاكمة. وبالإضافة إلى ذلك، أقبية وorganids لديهم ميل قوي إلى التمسك السطوح. لعائدات أفضل، كل أنابيب (1.5 مل، 15 مل، و 50 مل أنابيب)، الماصات ونصائح ماصة يمكن أن يكون المغلفة مع 1٪ مصل بقري جنيني في الفوسفات مخزنة المالحة في 4 درجات مئوية خلال الليل. نتائج يمكن تطبيع للتركيز البروتين الكلي باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) فحص، وبعد الفحص الأيضي، تحفظ كل لوحة 24-جيدا على الجليد حتى BCA الفحص. وبالنسبة للفحص BCA، يتم غسلها برفق في أقبية 500 ميكرولتر PBS الباردة ثلاث مرات و lysed في 75 ميكرولتر هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N في برنامج تلفزيوني تليها قوية تهز لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ويمكن للماصة P1000أن تستخدم لكسر خليط من البروتين هلامي وpipetting صعودا إلى أسفل يعزز تحلل. بعد تحلل سرداب، وBCA معيار بروتوكول فحص لخلايا يمكن اتباعها. فمن المهم أن يكون "فقط Matrigel" آبار المراقبة في جميع أنحاء تحليل الطاقة الحيوية لقياس تركيز البروتين في خلفية هذه الآبار وبالتالي لتقييم تركيز البروتين سرداب بدقة عن طريق فحص BCA.دراسات التمثيل الغذائي عضوي الشكل سرداب عرض يمكن تطبيقها على الظهارية مصغرة الشجاعة العادية والمريض المستمدة لاستكشاف فائدة لتقييم مبكر لخطر المرض النسبي والنهج التي يمكن أن تعدل النمط الظاهري الأيض وبالتالي تقليل المخاطر. المقايسات الأيض الموصوفة هنا إدخال استراتيجيات جديدة لتقييم احتمال الخطر النسبي لتطور المرض وللكشف المبكر عن حالة المرض، في تشريح والكيمياء الحيوية والجزيئية والتحوير المحتملة. باختصار، نحن تصف بروتوكول مفصلة لعزل intestina صغيرأقبية لتر وorganoids الثقافة سرداب. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم طريقة جديدة لاستخدام سرداب عضي الثقافة لتحديد تحمض ومعدلات استهلاك الأوكسجين خارج الخلية لدراسة استقلاب الطاقة سرداب عضي. فيفو السابقين سرداب عضي ثقافة التنميط الأيضية الدراسات وتحديد استراتيجيات جديدة لفهم البيولوجيا الأمعاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا توجد الإفصاحات.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من المنح RO1 CA 135561، R01 CA151494، R01 CA174432 وP3013330 من المعاهد الوطنية للصحة.
نود أن نشكر ميشيل هيوستن، ايلينا Dhima والدكتورة آنا Velcich للتعليقات القيمة في تطوير بروتوكول سرداب العزلة.
كما نشكر التدريب مركز السكري والأبحاث في كلية ألبرت أينشتاين للطب بدعم من المعاهد الوطنية للصحة P60DK20541، والدكتور مايكل والدكتور براونلي شيويه ليانغ دو، الذين يوجهون وتشغيل المرفق فرس البحر، على التوالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1x) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml | Life Technologies | 15240-062 | Final concentration 1x or 2x |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final concentration 1x |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final concentration 1x |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final concentration 10 mM |
| N-acetyl-L-cysteine, 25 g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final concentration 1 mM |
| 100x N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final concentration 1x |
| 50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final concentration 1x |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final concentration 500 ng/ml |
| Recombinant Murine EGF, 100 μg | Peprotech | 315-09 | Final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant Murine Noggin, 20 μg | Peprotech | 250-38 | Final concentration 100 ng/ml |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final concentration 2 mM |
| Gibco® glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT (dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1% in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1% in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final concentration 10 μM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final concentration 1 μM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final concentration 1 μM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final concentration 1 μM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
References
- Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O.
- Coles, N. W., Johnstone, R. M. Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells. Biochem J. 83, 284-291 (1962).
- Medina, M. A., Castro I, N. unezde Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells. Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).
- Anso, E., et al. Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC. Cancer Metab. 1, 7 (2013).
- Malmgren, S., et al. Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity. J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).
- Whitehead, R. H., et al. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
- Roig, A. I., et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).
- Sato, T., et al. Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
