Real Time Analys av Metabolic profil i Published: November 3, 2014 doi: 10.3791/52026

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Tuba Bas¹, Leonard H. Augenlicht^1,2

¹Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, ²Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine

Summary

Små intestinala crypt organoids odlade ex vivo tillhandahålla ett vävnadskultursystem som rekapitulerar tillväxten av kryptor beroende av stamceller och deras nisch. Vi etablerade en metod för att analysera den metaboliska profilen i realtid i primär mus crypt organoids. Vi hittade organoids upprätthålla fysiologiska egenskaper som definieras av deras källa.

Abstract

Tunntarmens slemhinna uppvisar en repetitiv arkitektur organiserad i två grundstrukturer: villi, som skjuter in i tarmlumen och består av mogna enterocyter, bägarceller och enteroendocrine celler; och kryptor, bor proximalt till submukosa och muscularis, hysande adulta stamceller och stamfaderceller och mogna Paneth-celler, liksom stromala och immunceller i kryptan mikromiljö. Tills de senaste åren, in vitro-studier av tunntarmen var begränsad till cellinjer härledda från antingen godartade eller elakartade tumörer, och inte representerar fysiologi normala tarm epitel och påverkan av mikromiljön där de är bosatta. Här visar vi en metod anpassad från Sato et al. (2009) för odling av primära mus intestinal crypt organoids härrörande från C57BL / 6-möss. Dessutom presenterar vi användning av crypt organoid kulturer för att analysera kryptan metaboliska profil i realtid per åtgärdlingen av basal syreförbrukning, glykolytiska takt, ATP-produktion och kapacitet i luftvägarna. Organoids bibehålla egenskaper som definieras genom sin källa och behålla delar av sin metaboliska anpassning reflekteras av syreförbrukning och extracellulära försurningspriser. Realtid metaboliska studier i denna krypta organoid odlingssystem är ett kraftfullt verktyg för att studera crypt organoid energimetabolism, och hur den kan moduleras av närings- och farmakologiska faktorer.

Introduction

Kolorektal cancer (CRC) är den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i USA. Sporadisk koloncancer - dvs den som uppkommer senare i livet (> 50 år) och med några tydliga predisponerar genetiska faktorer - står för ~ 80% av alla fall, med förekomst starkt influerad av långsiktiga kostvanor ^1,2. Dessa tumörer uppvisar en metabolisk övergång till beroende av oxidativ glykolys, känd som Warburg effekt, vilket delvis kan göra högre koncentrationer av cellulära byggstenar och energi som finns (genom glutaminolysis) för att tillåta och kanske köra höga tumörcelltillväxt ^3-5 . Studier av tjocktarmscancer och andra gastrointestinala cancerformer inklusive tunntarmscancer ger viktiga insikter om orsaken till tumörbildning. Undersöka de metaboliska skillnader mellan normala, pro-tumorigena och tumörframkallande tillstånd av gastrointestinala organsystem kan hjälpa DETermination av relativ risk för tumörutveckling samt tidig upptäckt av neoplasi. Dessutom kommer förstå bioenergetiska metabolism involverar mitokondrie andning och glykolys ge grundläggande insikt i hur cellfysiologi, åldrande och sjukdomstillstånd stör tarm homeostas. Utnyttjande av bioenergetik analysteknik för extracellulärt flödesanalys kan bedöma andelen mitokondrie andning och glykolys samtidigt i celler som växer i kultur i realtid ^6,7.

Fram till nyligen var in vitro-studier av tunntarmen begränsad till cellinjer härledda från antingen godartade eller elakartade tumörer ^8,9 och inte representerar fysiologi normala tarm epitel och påverkan av mikromiljön där de är bosatta. Under 2009 al. Sato et ¹⁰ införde en ex vivo kultur system att växa tredimensionella (3D) mus intestinala epitelceller organoids eller epithelial "mini-guts", lämplig för försök, diagnostiska och terapeutiska undersökningar ^10,11. Dessutom kryptor som isolerats från calorically restriktions möss bibehålla sina förändrade tillväxtegenskaper som organoids i sådana kulturer ^12. Jämfört med transformerade cellinjer kan crypt organoid kulturer användas för att alstra fysiologiskt relevanta data som utgör en mycket bättre modell för att förstå den in vivo-tillståndet.

Vi anpassade bioenergetik analysteknik för att analysera energiomsättningen av intestinala crypt organoids. Mus intestinal crypt organoids odlades ex vivo för att utveckla kryptan organoid energimetabolismstudier som presenteras. Syreförbrukningshastigheten (OCR) och den extracellulära försurning hastigheten (ECAR) av crypt organoids mättes i frånvaro och närvaro av två olika metaboliska hämmare (oligomycin, rotenon) och en jon bärare (karbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Kryptan organoid metaboliska svar på dessa kemiska föreningar framgångsrikt reflekteras genom att ändra ECAR och OCR-värden.

Cellular bioenergetiska studier kommer belysa de ömsesidiga samspelet mellan metaboliskt tillstånd och sjukdomsrisk och fenotyp i cancer, fetma, diabetes, ämnesomsättningsstörningar och mitokondriella sjukdomar och hjälpa förväg screeningmetoder med direkta konsekvenser för translationell medicin. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att isolera små tarm kryptor och kultur crypt organoids. Dessutom introducerar vi en ny metod för att använda crypt organoid kulturer för metabola analyser.

Protocol

Denna studie genomfördes i enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Protokollet godkändes av kommittén för etik djurförsök av Albert Einstein College of Medicine.

1. Crypt Isolering och kultur

1. Isolering av kryptor från tunntarmen:
   1. Isolera tarm kryptor från någon musmodell av intresse. Euthanize mössen med _CO2, följt av cervikal dislokation.
   2. Öppna upp buken på längden och fyll i tunntarmen (SI) med iskall fosfatbuffrad saltlösning, PBS (-CA ^2+, Mg ²⁺⁾ med 2x antibiotika-antimykotika (anti-anti). Snabbt isolera tunntarmen.
   3. Grundligt dissekera gratis mesenterisk fett med hjälp av en skalpell. Var noga med att inte perforera vävnaden - hela tiden hålla vävnaden fuktig med iskall PBS. Öppna upp integstine längdled och tvätta noga med iskall PBS.
   4. Skär tunntarmen in i två sektioner och plattas ut med användning av en våt bomullsspets, försiktigt skrapa bort villi med användning av en i förväg kyld slide. Tvätta kraftigt i iskall PBS flera gånger.
   5. Inkubera 3 min i 20 ml 1 x PBS per 3 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) /0.5 mM ditiotreitol (DTT) för icke-enzymatisk dissociation av vävnad.
   6. Skära vävnad i små stycken (2-4 mm) med användning av ett rakblad på en i förväg kyld slide. Överför de bitar i ett 50 ml rör innehållande 20 ml iskall PBS.
   7. Pipettera upp och ner försiktigt 10x med hjälp av en 10 ml steril engångs pipett. Låt vävnadsfragment sedimenterar genom gravitation. Avlägsna supernatanten med en pipett. Upprepa ytterligare tre gånger; se till supernatanten är klar.
   8. Tillsätt 20 ml PBS per 2 mM EDTA. Virvel och inkubera vid 4 ° C under 30 min med försiktig skakning.
   9. Låt vävnads sediment och kassera supernatanten. Tillsätt 15 ml iskall PBS och pipettupp och ned 5 gånger med en 10 ml pipett. Låt de vävnadsfragment sediment och samla supernatanten som Fraktion 1 (F1). Upprepa samla F2-F5, varje fraktion underhålls separat.
   10. Tillsätt 15 ml iskall PBS och denna gång skaka kraftigt för hand i 15 sekunder. Samla F6 och upprepa för F7, F8. Om vävnadsbitar börjar flyta, tryck på för att hjälpa dem att lösa.
   11. Inspektera en alikvot av varje fraktion under mikroskop. Samla de fraktioner som innehöll kryptor.
   12. Passera de sammanslagna fraktionerna genom en 70 ^ m nylon-cellfilter, samla kryptor i ett 50 ml rör.
   13. Centrifugera vid 100 xg under 5 minuter vid 4 ° C, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml iskall PBS med 2x antianti och överföra kryptor till en 15 ml tub. Upprepa tvätta en gång till.
   14. Tvätta kryptor gång med 10 ml iskall ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco "s Modified Eagle Medium / Ham" s F-12) - 2x anti-anti.
   15. Tvätta kryptor gång med 10 ml ADF - 1x anti-anti.
   16. Räkna kryptor med en hemocytometer. Justera kryptan lösningsvolymen och överför till en 1,5 ml tub så att den slutliga kryptan koncentrationen när suspenderas blir 100-500 kryptor per 50 fil gelatinös proteinblandning (Matrigel). Centrifugera vid 100 xg under 5 minuter vid 4 ° C och slamma kryptor i geléform proteinblandningen.
   17. Plate 50 pl av kryptan - gelatinös proteinblandning suspension per brunn i en 24-brunnars platta (tillväxtområde: 2 cm ^2), försiktigt placera suspensionen droppe i centrum av varje brunn. Bibehålla plattan i en _CO-2, 37 ° C inkubator under ~ 30 minuter till dess att suspensionen stelnar.
   18. Tillsätt 500 l iskall komplett odlingsmedia (Advanced DMEM / F12 med 1x anti - anti, 10 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 tillskott, 1x N2 Supplement, 1 mM N-acetyl-L-cystein (NAC), 50 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R-Spondin).
       1. Rekonstituera tillväxtfaktorer i 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS.
2. Crypt organoid kultur och Passage:
   1. Passage crypt organoids 14-21 dagar efter ympning (eller vid behov) på följande sätt:
      1. Ändra media varje fredag ​​och måndag. På onsdagar, byt halva media med färskt medium.
   2. Avlägsna odlingsmediet. Tvätta provet två gånger med 500 ^ il PBS vid 5 min intervaller.
   3. Ta bort PBS och försiktigt bryta upp gelatinliknande proteinblandning med en steril P1000 mikro pipettspetsen.
   4. Tillsätt 1 ml komplett odlingsmedium till en enda brunn och resuspendera organoids i 1 ml medium.
   5. Störa försiktigt organoids med en P1000 genom att pipettera upp och ned 20-30x (kolla under mikroskopet för korrekt organoid dissociation med en bra krypta avkastning tills en konsekvent teknik utvecklas).
   6. Överför kryptor till en 1,5 ml mikrocentrifugrör;Centrifugera vid 100 x g vid 4 ° C, 5 min.
   7. Tvätta pelleten två gånger med 1 ml komplett odlingsmedium.
   8. Split vid ett förhållande av 1: 3 eller 1: 6 som behövs, återsuspendering kryptor i 50 pl Matrigel per brunn. Fortsätt enligt beskrivningen ovan (avsnitt 1.1.16-18).
3. Crypt organoid Frysning:
   1. Avlägsna odlingsmediet. Tvätta provet i 500 l PBS.
   2. Dispergera gelatinös proteinblandning med hjälp av en P1000 pipettspets.
   3. Tillsätt 1 ml media till en enda brunn och resuspendera organoids i 1 ml medium.
   4. Bryta försiktigt upp organoids med en P1000 genom att pipettera upp och ned 20-30x.
   5. Överför de organoids till ett 1,5 ml rör. Centrifugera vid 100 x g vid 4 ° C, 5 min.
   6. Tvätta pelleten två gånger med 1 ml komplett odlingsmedium.
   7. Resuspendera kryptor i 500 l frysmedier.
   8. Överför kryptor till en cryotube, placera röret i en frysning behållare och förvara i en -80 ° C frys overniGHT.
   9. Överför kryptor till flytande _N2 tank.
      1. Recover frysta crypt organoids genom att snabbt tina i ett 37 ° C vattenbad. Tvätta med 500 | il komplett odlingsmedium en gång, centrifugera vid 100 x g, 5 min och återsuspendera i gelatinös proteinblandning, och kultur såsom beskrivits ovan. För bättre återhämtning, till ROCK-hämmare (Y-27632) till frysmedier.

2. Crypt organoid Metabolism Assay

1. 24-brunnar Beredning:
   1. Isolera och räkna kryptor enligt protokollet (se avsnitt 1.1 för crypt isolering och avsnitt 1.2 för crypt passage).
   2. Resuspendera kryptor i geléform proteinblandning (100-200 Crypts per 20 l).
   3. Plansch crypt-gelatinös proteinblandning suspension i ett 24-brunnars analysplatta (se till att det finns åtminstone tre exemplar för varje prov) och tillåta suspensionen att stelna vid 37 ° C i en CO ₂inkubator; lägg sedan till 500 l komplett odlingsmedier.
   4. Kultur kryptor (som beskrivs i avsnitt 1.1) och observera i mikroskop tills kryptor växa till fullt utvecklade organoids.
2. Extracellulär Flux-analys:
   1. Hydrat kassetten över natt i ett icke-CO ₂ (0% _CO2), 37 ° C inkubator.
   2. Avlägsna odlingsmediet och tvätta organoids två gånger med 500 ^ il DMEM (utan: glukos, L-glutamin, natriumpyruvat och natriumbikarbonat, och med: fenolrött). Vänta 5 min.
   3. Addera 675 pl per brunn analysmedium (DMEM med 2 mM L-glutamin och 5 mM D-glukos) till varje brunn.
   4. Kontrollera crypt organoids mikroskopisk morfologi för att säkerställa att organoids och geléform proteinblandningen är intakta efter tvättar. Inkubera 1 h i en icke-CO _2, 37 ° C inkubator.
   5. Förbered 10 pM injicerbara föreningar (oligomycin, karbonyl cyanid-p-trifluoro-metoxi-fenyl-hydrazon (FCCP), rotenone) i analysmedium.
   6. Set-up patronen genom att ladda 75 ul 10 iM injicerbara föreningar till hamnarna i patron sekventiellt: Port A - oligomycinkänslig; Port B - FCCP; och Port C - rotenon (De slutliga koncentrationerna under analysen kommer att vara 1 ^ M).
   7. Inkubera patronen 30 min - 1 timme vid 37 ° C i en _{icke-CO2-inkubator.}
   8. Samtidigt, slå på XF Analyzer och skapa analysprotokollet mallen.
   9. Placera patronen och nytta plattan i XF Analyzer och kör "kalibrera" patron.
   10. Kontrollera crypt organoids mikroskopiskt för att se till att de är anslutna till gelatinös proteinblandningen.
   11. Lastcell odlingsplatta i instrumentet och kör analysprotokollet.

Representative Results

Crypt organoids etablerades från 8 månader gamla C57BL / 6 möss som utfodrats renat gnagardiet American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinal crypt organoids kan odlas i odling under långa perioder från en enda crypt (Figur 1A, enda röd pil). Organoids växa ut crypt liknande strukturer i 18-20 dagar i kultur (Figur 1B, röda pilar). Kryptor passerades var 3 veckor och organoids effektivt återvinns efter varje passage.

Seahorse bioenergetik instrumentering kan bedöma andelen mitokondrie andning och glykolys samtidigt i celler som växer i kultur i realtid. Vi anpassade denna teknik för att analysera krypta organoid metabolism. Med organoids härledda från möss som utfodrats AIN76A renad diet i 8 månader, uppmätt vi:. En syreförbrukningshastigheten, OCR visas i fig 2A - röd linje som representerar syreförbrukningshastigheten (pmol / min) i crypt organoids, är blå the kontrollbrunnar endast med Matrigel (den geléform proteinblandning); 2. cellulära försurning hastighet (ECAR) visas i figur 2B - röda linjen representerar extracellulär försurning hastighet (mph / min) i crypt organoids, blått är kontrollbrunnarna endast med geléform proteinblandningen.

Figur 1:. Crypt organoids härledda från 8-månader gamla C57BL / 6 möss Crypts är (A) 2-dagar eller (B) 18-dagars odling. Skala: 100 ^ m.

Figur 2: Bioenergetik analys med användning organoids härledda från åtta månader gamla C57BL / 6-möss. (A) Syre förbrukning (OCR) är visad;

Discussion

Vi testade syreförbrukningshastigheten (OCR) och den extracellulära försurning hastigheten (ECAR) av kryptor isolerade från 8 månader gamla möss och vuxit till organoids ex vivo. Efter mätning av basaldosen, var crypt ämnesomsättning utvärderades genom att lägga oligomycin, karbonyl cyanid -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) och rotenon, sekventiellt.

Basal OCR och basal ECAR registrerades 0-29 min (Figur 2A och 2B). Vid den ^{29: e} min, oligomycin (från porten A) in i varje brunn (n = 3, för både kryptor och kontrollbrunnar). Oligomycin är en ATP-syntes-hämmare. Det används för att förhindra tillstånd 3 (fosforylerande) andning. Således oligomycin injektion resulterade i en liten minskning av OCR, på grund av blockad av ATP-syntes i mitokondrierna, och kryptor bytte till glykolys att uppfylla deras krav på ATP leder till en ökning av ECAR. Vid ^{64: e} min, FCCP (from port B) injicerades i varje brunn. FCCP är en mobil jon bärare, som transporterar vätejoner över mitokondriemembranet, vilket leder till snabb förbrukning av energi utan behov av ATP generation. OCR ökade på grund av frånkoppling och ECAR ökat sedan kryptor bibehöll sin energibalans genom att anställa glykolys att generera ATP, vilket syntes och utsöndrar mjölksyra. Vid ^{99: e} min, rotenon (från port C) injiceras i varje brunn. Rotenon är en mitokondriell hämmare. Således ledde det tredje kapitaltillskottet till en minskning av OCR på grund av nedsatt mitokondriefunktion och skiftade kryptor till en mer glykolytiskt tillstånd att hålla ECAR värdena förhöjda.

Det finns två huvudsakliga slutsatser: 1) crypt organoids från 8 månader gamla möss odlade med framgång genom flera passager; 2) organoids som hade passe i odling under 2 månader efter härledning uppvisade en metabolisk reaktion på oligomycin, karbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphen ylhydrazone och rotenon. Således glykolytisk förmåga organoids var stabil efter 2 månader i kulturen, i enlighet med den rapport som organoids från calorically begränsade möss relativt permanent är anpassade till olika tillväxt och metabola fenotyper i kultur ^12.

De experimentella procedurer som beskrivs i detta protokoll kommer att vara av stor betydelse i metaboliska studier av tarm kryptor. Protokollet för kryptan isolering är anpassad från Sato et al. ¹⁰ Protokollet för att studera crypt metabolism i små intestinala crypt organoid kulturerna med bioenergetik analysteknik har inte rapporterats. Kryptan organoid metabolismstudier kan utökas ytterligare introducera olika variabler till odlingsmedia och analysförhållanden, såsom olika energikällor, hämmare och aktivatorer av specifika signalering och metaboliska vägar, och hypoxiska förhållanden som kan modulera metaboliska vägar.

INNEHÅLL "> Det finns tekniska frågor som kräver särskild uppmärksamhet vid tillämpningen av dessa protokoll. Crypt nummer och tillväxt effektivitet crypt organoid kulturer kan variera beroende på kryptan källan, t.ex. kryptor från genetiskt förändrade jämfört vildtypsmöss. Således crypt såddtäthet kan justeras för experiment genom att köra en rättegång. Dessutom kryptor och organids har en stark tendens att fastna på ytor. För bättre avkastning, alla rör (1,5 ml, 15 ml och 50 ml rör), kan pipetter och pipettspetsar vara belagd med ett% fetalt bovint serum i fosfatbuffrad saltlösning vid 4 ° C över natten. Resultaten kan normaliseras till total proteinkoncentration med användning av bicinkoninsyra (BCA) analys. Efter den metaboliska analysen, den 24-brunnars platta hålls på is till dess att BCA-analys. För den BCA-analys, är kryptor tvättas försiktigt i 500 | il kall PBS tre gånger och lyserades i 75 | j, l 0,1 N NaOH i PBS följt av kraftig skakning under 1 h vid rumstemperatur. En P1000 pipett kananvändas för att bryta den gelartade proteinblandningen och pipettera upp och ned främjar lys. Efter crypt lys, kan standard BCA analysprotokoll för celler följas. Det är viktigt att ha "bara Matrigel" kontrollbrunnar i hela bioenergetik analys för bestämning av bakgrundsproteinkoncentrationen i dessa brunnar och således att bedöma kryptan proteinkoncentrationen noggrant genom BCA-analys.

Crypt organoid metabolismstudier som presenteras kan appliceras på normal och patient härrör epiteliala mini modet att utforska verktyg för tidig utvärdering av relativ risk och strategier som kan modulera metabola fenotyp och därigenom minska sjukdomsrisk. De metaboliska analyser som beskrivs här införa nya strategier för eventuell utvärdering av relativ risk för sjukdomsutveckling och för tidig upptäckt av sjukdomstillstånd, dess biokemiska och molekylära dissekering och potentiella modulation. I sammanfattning, beskriver vi ett detaljerat protokoll för att isolera små intestinal kryptor och kultur crypt organoids. Dessutom introducerar vi en ny metod för att använda krypta organoid kultur för bestämning av extracellulära försurning och syreförbrukning för att studera crypt organoid energiomsättning. Ex vivo krypta organoid kultur metabolisk profilering studier kommer att definiera nya strategier för att förstå intestinal biologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final concentration 10 μM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final concentration 1 μM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience