Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas

Resumen

Este protocolo implica procedimientos detallados para el aislamiento de células derivadas de la orina de pacientes con distrofia muscular; su reprogramación eficiente y rápida a través de la transducción del virus de Sendai.

Resumen

Cardiomiopatía distrófica es una consecuencia mal entendido de la distrofia muscular. Generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) de pacientes con distrofia muscular es una fuente inestimable para celular in vitro sistemas modelo de la enfermedad y puede ser utilizado para los estudios de detección de drogas. Células de orina derivados de los pacientes se han utilizado con éxito en la reprogramación de las células madre pluripotentes inducidas con el fin de modelar la miocardiopatía distrófica ^1. Abordar los problemas de seguridad de la integración de sistemas de vectores, se presenta un protocolo utilizando un vector de virus Sendai no integrador para la transducción de Yamanaka factores en las células de orina recogidas de pacientes con distrofia muscular. Este protocolo genera clones reprogramado completamente dentro de 2-3 semanas. Las células pluripotentes son libre de vectores mediante el paso-13. Estos iPSCs distróficos pueden diferenciarse en cardiomiocitos y se utilizan ya sea para estudiar mecanismos de la enfermedad o para la detección de drogas.

Introducción

La cardiomiopatía es la segunda causa principal de muerte en pacientes con distrofia muscular de Duchenne y de Becker (MD). Aunque las mutaciones en el gen de la distrofina ligada al cromosoma X se producen en 1: 3.500 nacimientos de varones, se sabe muy poco acerca de los eventos moleculares y celulares que conducen al daño del músculo cardíaco progresivo. Las células madre pluripotentes inducidas humanas derivadas de pacientes con distrofia muscular se han convertido en una nueva herramienta para estudiar los mecanismos subyacentes de la enfermedad y que se utilizará para la detección de drogas ^1,2.

La incomodidad anticipada de biopsias de piel o muestras de sangre puede disuadir a los pacientes jóvenes y / o sus tutores para dar su consentimiento para participar en el estudio. Las muestras de orina son una fuente no invasiva de células somáticas que son modificables a los métodos de reprogramación. Recientemente hemos demostrado que las células de orina recogidas de pacientes con distrofia muscular pueden ser cultivadas y eficiente reprogramado en iPSCs utilizando la transducción retroviral con los factores de Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-Myc; OSKM) ^1. La desventaja del suministro de genes retrovirales es la integración aleatoria de los genes de reprogramación en los cromosomas del huésped. Para superar esta limitación, hemos utilizado el virus Sendai no integrante de la reprogramación celular orina.

Este protocolo detalla la reprogramación de virus Sendai de células aisladas de orina de pacientes con distrofia muscular que a su vez pueden diferenciarse en cardiomiocitos u otros tipos de células para su posterior estudio. Este protocolo también se puede adaptar para otras enfermedades específicas del paciente.

Protocolo

NOTA: Los pacientes y / o sus tutores deben dar su consentimiento informado para participar en una Junta de Revisión Institucional aprobado estudio.

1. Los tampones y Preparaciones Medios

1. Tampón de lavado: Para preparar 100 ml de tampón de lavado, añadir 1 ml de la pluma de 100x / Solución estreptocócica (100 U / ml de penicilina + 100 g / ml de estreptomicina) a 99 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Urinario Progenitor Cell (UPC) Medio: Para preparar medio UPC, mezclar volúmenes iguales de queratinocitos sin suero (FCE) Medio + Progenitor medio celular.
   1. KSF Medio: Para preparar el medio de queratinocitos, añadir 5 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 50 ng / ml de extracto de pituitaria bovina (BPE), 30 ng / ml de toxina del cólera, y solución de penicilina / estreptomicina (100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina) a 500 ml de medio KSF.
   2. Medio Progenitor Cell: Añadir tres cuartas partes de DMEM con un cuarto de los medios de Ham-F12 y complementar con 10% de FBS, 0,4 mg / ml de hidrocortisona, 0,1nM toxina del cólera, 5 ng / ml de insulina, 1,8 x 10 ^-4 M adenina, 5 g / ml de transferrina, 2 x 10 ^-9 M tironina triyodo, 10 ng / ml de EGF, y pen / strep solución.
3. hES Medio: Añadir 20% de reemplazo KO-suero (K-SR), 1x MEM aminoácidos no esenciales, 2 mM L-glutamina, 100 mM β-mercaptoetanol, 20 ng / ml de bFGF y penicilina / estreptomicina a 400 ml de DMEM / medio F12.

2. Muestra de orina Colección

1. Instruir a los pacientes a beber líquidos 30 minutos antes de la recolección de orina para asegurarse de que una cantidad adecuada (~ 30 a 40 ml) de orina se pueden recoger.
2. Dar a los pacientes y / o sus tutores un kit de recogida de orina que contiene los siguientes elementos: (1) las instrucciones escritas sobre cómo obtener la muestra de orina estéril o limpia, (2) toilettes antibacterianas húmedas, y (3) a 100 ml estéril taza de la recogida de muestras. Indique a los pacientes a tomar la muestra.
3. Coloque inmediatamente las muestras de orina en el hielo y la transferencia a la laboratoria en un refrigerador. Procesar la orina para el aislamiento de células inmediatamente. Si un retardo es inevitable, almacenar la muestra en hielo durante hasta 4 horas con una mínima pérdida de la viabilidad celular.

3. El aislamiento y la expansión de las células de orina

NOTA: Realice los pasos siguientes en condiciones estériles en una cabina de seguridad biológica BSL2.

1. El uso de pipetas estériles, las muestras de orina para la transferencia estéril tubos de centrífuga de 50 ml. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a TA.
2. Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en el tubo; tener cuidado de no perturbar el sedimento celular.
3. Resuspender y combinar los gránulos de múltiples tubos en 7 ml de tampón de lavado y repetir la centrifugación a 400 xg durante 10 min a TA.
4. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando el sedimento celular y ~ 0,2-0,5 ml de sobrenadante. Volver a suspender en 2-3 ml de orina de células progenitoras (UPC) a medio y transferir la suspensión en 4-6 pocillos de una ONUplaca de 24 pocillos recubierta.
5. Después de 72 horas, suplementar el cultivo con 0,5 ml de medio fresco UPC por pozo y cambiar de medio cada 2-3 días después. Los eritrocitos y células escamosas que no se adhieren a la placa se eliminarán con los cambios de medio.
6. Supervisar la cultura después de 4-6 días.
   NOTA: Las pequeñas colonias de células 2-4 comenzarán a aparecer. Las células serán redondeadas o alargadas que representan tipo I o II del epitelio renal (RE) células respectivamente ^3.
7. Cambie el medio cada 2-3 días desde que una vez que aparecen las células, se someterá a una fase de rápida expansión.
8. Una vez que las células alcanzan 80-90% de confluencia, alrededor de 9-15 días después de placas, disociar y el paso de las células (15,000-18,000 células / cm ²⁾ en 2-4 pocillos de placa de pocillos 24 para una mayor expansión. Marque esto como paso célula 1 (P1).
9. Caracterizar las células de orina para las especificaciones de linaje a través del análisis de citometría de flujo, immunohistochemtinción iCal o mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
10. Reprogramar células aisladas de orina (sección 4) o congelarlos en el medio de congelación (DMEM suplementado con 10% de suero y 10% DMSO) para almacenamiento criogénico a largo plazo.

4. La orina Reprogramación Celular Usando Sendai Virus

NOTA: El manejo adecuado y el uso de los EPI (equipos de protección individual) se recomienda durante la manipulación de los agentes de transfección. Realice los pasos siguientes en condiciones estériles en una cabina de seguridad biológica BSL2. Se recomienda la eliminación adecuada de la transfección de células de agentes y / o transfectadas para evitar el riesgo de peligros ambientales y de salud. Para la reprogramación celular orina, use un Reprogramación Kit Sendai con modificaciones al protocolo de alimentación dependiente del fabricante como se detalla a continuación.

1. Para garantizar una alta eficiencia de reprogramación con el virus Sendai, uso pasajes 1-5 de células de orina que son rápidasly dividiendo. Si las células no se replican bien o se vuelven senescentes, descartarlos ya que no se vuelva a programar de manera eficiente.
2. Seed 60.000 células por pocillo en dos pocillos de una placa de 6 pocillos. Marcar este como el Día de -2. Ajuste la densidad de siembra de células (5 x 04 al 09 ¹⁰ x 10 ⁴ células por pocillo) según sea necesario para llegar a un 80-90% de confluencia en el día 0.
3. En el Día 0 (48 h después de la siembra de las células), preparar los vectores de reprogramación Sendai (SeV) que contienen cada uno de los cuatro factores OSKM. Añadir cada uno de los vectores a 1 ml de medio UPC pre-calentado. Utilice una MOI de 1 a 1,5 (5-7,5 x 10 ⁵ CIU), que es suficiente para que las células de orina reprogramación. Aspirar el medio y agregue lentamente el 1 ml UPC + VSe a un pocillo de las células de orina. Utilice el segundo así como el control negativo de transducción.
4. En el Día 1, sustituir el medio UPC + VSe con medio UPC fresco. Algunos muerte celular es visto después de 24 h debido a la citotoxicidad vírica.
5. En función de la eficiencia de clon reprogramadae formaciones y la morfología compacta, siguen cambiando el medio diariamente hasta el día 6 o 7.
6. Un día antes de la disociación de las células transducidas (día 5 o 6), preparar placas de alimentación MEF en placas Mitomicina-C (10 mg / ml durante 3 horas) tratados con MEFs a una densidad de 5 x 10 ⁴ células / cm ^2, en 0,1 % de gelatina recubierta platos 100 mm ² de cultivo.
7. Al día siguiente (día 6 o 7), disociar las células con 0,25% de tripsina, resuspender las células en medio UPC y la placa 5 x 10 ⁴ - placa de alimentador de 2 x 10 ⁵ células / 100 mm ² MEF.
8. Al día siguiente, cambiar a medio hES y cambiar el medio todos los días. Observar las células bajo un microscopio para controlar las células transformadas.
   NOTA: Las células forman agregados clonales con morfología característica de adoquines y tener mayor núcleo al citoplasma (12-18 días después de transducción).
9. Dentro de dos o tres semanas después de la transducción, recoger colonias y traslado a las nuevas placas de clonexpansión al.
10. Realizar tinción de células vivas para la selección de clones IPSC mediante la incubación de las células con TRA-1-81 anticuerpo durante 1 hora a 37 ° C en incubadora de CO ₂ seguido por tinción con colorante fluorescente contador específico conjugado anticuerpo secundario durante 1 hora a 37 ° C en el incubador de _CO2.
11. Use un G 1½ pulgada aguja 26 a interrogar a eclosionar los grandes TRA-1-81 clones positivos IPSC en pequeños trozos de igual tamaño (4-6 piezas por clon).
12. Utilice una pipeta de punta estéril para recoger y transferencia 10-20 piezas rayadas de varios clones en cada pozo de Matrigel (10 g / ^cm2) presenta el revestimiento de placa de 24 pocillos con medio hES.
    NOTA: Las piezas de un solo clon chapado en forma individual en un solo pozo no se expanden o mantener la pluripotencia.
13. Cambie de hES a medio IPSC 24-48 horas después de que los clones reprogramadas están unidos a la superficie de Matrigel.
14. Durante el mantenimiento en placas recubiertas con Matrigel, SCRA manualmentePE-off ningún células diferenciadas o contaminantes células alimentadoras MEF utilizando una punta de pipeta para enriquecer IPSC (MD-IPSC) clones distróficos totalmente reprogramadas y pluripotentes.
15. Después de clones individuales han alcanzado ~ 100 micras de tamaño, ampliar los clones disociando con EDTA 0,48 mM (ácido etilendiaminotetraacético) solución durante 3 minutos y enchapado pequeños agregados celulares de MD-iPSCs suspendidas en medio de IPSC (suplementado con 5 mM Y27632, Rho-cinasa inhibidor ) en matrigel fresco (10 g / cm ²⁾ recubierto placa de 12 pocillos. Cambie medio IPSC diaria.
16. Reprogramación completa de cada clon se puede determinar por tanto el análisis de expresión génica de genes OSKM y tinción inmunohistoquímica de los marcadores de pluripotencia (Oct3 / 4 y TRA-1-81). Una evaluación rigurosa del potencial pluripotencia debe ser empleado para confirmar totalmente reprogramadas líneas IPSC pueden diferenciarse en tres capas germinales. Esto se puede lograr ya sea por el cuerpo embrioide (EB) formación y diferenciación de ensayo o un terensayo de formación atoma.

Resultados

La mayoría de las células progenitoras aisladas de orina humana son positivos para los marcadores progenitoras y de pericitos uroepithelial tales como CD44, CD73, y CD146 (97,37%, 97,09% y 97,3%, respectivamente; Figura 1A y 1B). Estas células también expresan otros marcadores mesenquimales tales como la actina alfa del músculo liso y vimentina (Figura 1B). Análisis de RT-PCR da evidencia de una población mixta de células en los cultivos en que hay una expresión débil d...

Discusión

Modelado de las enfermedades cardiovasculares mediante iPSCs se está convirtiendo en un enfoque común de entender la contribución genética ^4-6. Algunas dificultades no previstas de la obtención de muestras de células de los pacientes, especialmente los niños pequeños, se pueden evitar al ofrecer la opción de un método no invasivo, como una muestra de orina. En esta población joven paciente, a menudo es difícil recoger un volumen de orina suficiente para producir suficientes células de orina para la reprograma...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales
4 Oz. Vaso de Muestras con Tapa	STL Medical Supply	M9AMSAS340	para la Recolección de Muestras de Orina
15 ml Tubos BD-Falcon Fisher	Scientific	352097
50 ml Tubos BD-Falcon	Fisher Scientific	352098
Cubreobjetos de vidrio redondos	Fisher Scientific	12-545-81
Kit de reprogramación CytoTune-iPS Sendai Life Technologies		A1378-001
PBS, pH 7.4	Life Technologies	10010-023
Pen-Strep sin glutamina	Life Technologies	15140-122	Cálido en 37 ° C baño de agua antes de usar
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar B-27 Suplemento con insulina (50x)	Life Technologies	17504-044	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar B-27 Suplemento sin insulina (50x)	Life Technologies	0050129SA	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
DMEM/F12 (1:1)	Life Technologies	11330-032	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Versene, 1:5,000	Life Technologies	15040066	Warm en 37 ° C baño de agua antes de usar
bFGF (10 µ g)	Life Technologies	13256-029	Cálido en 37 ° C baño de agua antes
de usar Cell Counter Cartridges	Life Technologies	C10228
Knockout Serum (500  ml Botella)	Life Technologies	10828-028	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Recuperación Cultivo celular Medio de congelación	Life Technologies	12648-010
Queratinocitos-SFM (1x), Liquid	Life Technologies	17005-042	Calentar en 37 ° C baño de agua antes de usar
DMEM, Alta glucosa, Glutamax	Life Technologies	10566-016	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar Ham's F-12 Nutrient Mix	Life Technologies	11765-054	Cálido en 37 ° C baño de agua antes de usar
EGF Proteína humana recombinante, forma líquida	Life Technologies	PHG0311L	cálido en 37 ° C baño de agua antes de usar
Insulina, Recombinante Humana, Zinc Soln	Life Technologies	12585-014	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar TeSR-E8	Stem Cell Technologies	5940	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Selleck	S1049	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Matrigel	BD Biosciences	354277	hESC Qualified Matrix, LVED Free
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
iScript Kit de síntesis de ADNc	Bio-Rad	170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)	Thermo-Scientific	K1081
FBS-Qualified	Sigma Aldrich	F6178	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Adenina Biorreactivo	Sigma Aldrich	A2786-5G	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar Toxina del cólera de Vibrio cholerae	Sigma Aldrich	C8052-.5MG	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Hidrocortisona	Sigma Aldrich	H0888-1G	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar Holo-transferrina de Sigma	humano Aldrich	T0665-50MG	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar 3,3',5-Triyodo-L-tironina sal de sodio	Sigma Aldrich	T6397-100MG	Caliente en 37 ° C baño de agua antes de usar
DAPI	Santa Cruz Biotechnology	SC-3598
Fluoromount Aquous medio de montaje	Sigma Aldrich	F4680
16% Paraformaldehído	Alfa-Aesar	43368
Antibodies
Mouse anti CD44 - marcado con FITC	BD Biosciences	560977
Ratón anti CD146 - marcado con PE	BD Biosciences	561013
Ratón anti CD73 - marcado con PE	BD Biosciences	561014
Ratón anti-&alfa;-actina de músculo liso	Sigma Aldrich	A2547
Anti-Vimentina para ratones	Abcam	ab8978-100
Anti para ratones - TRA-1-81	Life Technologies	411100
Conejo anti Oct 3/4	Santa Cruz Biotechnology	SC-9081
Ratón Anti Distrofina	Leica Biosystems	NCL-DYSB