Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas

Resumen

Este protocolo implica procedimientos detallados para el aislamiento de células derivadas de la orina de pacientes con distrofia muscular; su reprogramación eficiente y rápida a través de la transducción del virus de Sendai.

Resumen

Cardiomiopatía distrófica es una consecuencia mal entendido de la distrofia muscular. Generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) de pacientes con distrofia muscular es una fuente inestimable para celular in vitro sistemas modelo de la enfermedad y puede ser utilizado para los estudios de detección de drogas. Células de orina derivados de los pacientes se han utilizado con éxito en la reprogramación de las células madre pluripotentes inducidas con el fin de modelar la miocardiopatía distrófica ^1. Abordar los problemas de seguridad de la integración de sistemas de vectores, se presenta un protocolo utilizando un vector de virus Sendai no integrador para la transducción de Yamanaka factores en las células de orina recogidas de pacientes con distrofia muscular. Este protocolo genera clones reprogramado completamente dentro de 2-3 semanas. Las células pluripotentes son libre de vectores mediante el paso-13. Estos iPSCs distróficos pueden diferenciarse en cardiomiocitos y se utilizan ya sea para estudiar mecanismos de la enfermedad o para la detección de drogas.

Introducción

La cardiomiopatía es la segunda causa principal de muerte en pacientes con distrofia muscular de Duchenne y de Becker (MD). Aunque las mutaciones en el gen de la distrofina ligada al cromosoma X se producen en 1: 3.500 nacimientos de varones, se sabe muy poco acerca de los eventos moleculares y celulares que conducen al daño del músculo cardíaco progresivo. Las células madre pluripotentes inducidas humanas derivadas de pacientes con distrofia muscular se han convertido en una nueva herramienta para estudiar los mecanismos subyacentes de la enfermedad y que se utilizará para la detección de drogas ^1,2.

La incomodidad anticipada ....

Protocolo

NOTA: Los pacientes y / o sus tutores deben dar su consentimiento informado para participar en una Junta de Revisión Institucional aprobado estudio.

1. Los tampones y Preparaciones Medios

1. Tampón de lavado: Para preparar 100 ml de tampón de lavado, añadir 1 ml de la pluma de 100x / Solución estreptocócica (100 U / ml de penicilina + 100 g / ml de estreptomicina) a 99 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Urinario Progenitor Cell (UPC) Medio: Para preparar medio UPC, mezclar volúmenes iguales de queratinocitos sin suero (FCE) Medio + Progenitor medio celular.
   1. KSF Medio: Para preparar el medio de qu....

Resultados

La mayoría de las células progenitoras aisladas de orina humana son positivos para los marcadores progenitoras y de pericitos uroepithelial tales como CD44, CD73, y CD146 (97,37%, 97,09% y 97,3%, respectivamente; Figura 1A y 1B). Estas células también expresan otros marcadores mesenquimales tales como la actina alfa del músculo liso y vimentina (Figura 1B). Análisis de RT-PCR da evidencia de una población mixta de células en los cultivos en que hay una expresión débil d.......

Discusión

Modelado de las enfermedades cardiovasculares mediante iPSCs se está convirtiendo en un enfoque común de entender la contribución genética ^4-6. Algunas dificultades no previstas de la obtención de muestras de células de los pacientes, especialmente los niños pequeños, se pueden evitar al ofrecer la opción de un método no invasivo, como una muestra de orina. En esta población joven paciente, a menudo es difícil recoger un volumen de orina suficiente para producir suficientes células de orina para la reprograma.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales
4 Oz. Vaso de Muestras con Tapa	STL Medical Supply	M9AMSAS340	para la Recolección de Muestras de Orina
15 ml Tubos BD-Falcon Fisher	Scientific	352097
50 ml Tubos BD-Falcon	Fisher Scientific	352098
Cubreobjetos de vidrio redondos	Fisher Scientific	12-545-81
Kit de reprogramación CytoTune-iPS Sendai Life Technologies		A1378-001
PBS, pH 7.4	Life Technologies	10010-023
Pen-Strep sin glutamina	Life Technologies	15140-122	Cálido en 37 ° C baño de agua antes de usar
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar B-27 Suplemento con insulina (50x)	Life Technologies	17504-044	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar B-27 Suplemento sin insulina (50x)	Life Technologies	0050129SA	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
DMEM/F12 (1:1)	Life Technologies	11330-032	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Versene, 1:5,000	Life Technologies	15040066	Warm en 37 ° C baño de agua antes de usar
bFGF (10 µ g)	Life Technologies	13256-029	Cálido en 37 ° C baño de agua antes
de usar Cell Counter Cartridges	Life Technologies	C10228
Knockout Serum (500  ml Botella)	Life Technologies	10828-028	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Recuperación Cultivo celular Medio de congelación	Life Technologies	12648-010
Queratinocitos-SFM (1x), Liquid	Life Technologies	17005-042	Calentar en 37 ° C baño de agua antes de usar
DMEM, Alta glucosa, Glutamax	Life Technologies	10566-016	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar Ham's F-12 Nutrient Mix	Life Technologies	11765-054	Cálido en 37 ° C baño de agua antes de usar
EGF Proteína humana recombinante, forma líquida	Life Technologies	PHG0311L	cálido en 37 ° C baño de agua antes de usar
Insulina, Recombinante Humana, Zinc Soln	Life Technologies	12585-014	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar TeSR-E8	Stem Cell Technologies	5940	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Selleck	S1049	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Matrigel	BD Biosciences	354277	hESC Qualified Matrix, LVED Free
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
iScript Kit de síntesis de ADNc	Bio-Rad	170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)	Thermo-Scientific	K1081
FBS-Qualified	Sigma Aldrich	F6178	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Adenina Biorreactivo	Sigma Aldrich	A2786-5G	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar Toxina del cólera de Vibrio cholerae	Sigma Aldrich	C8052-.5MG	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Hidrocortisona	Sigma Aldrich	H0888-1G	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar Holo-transferrina de Sigma	humano Aldrich	T0665-50MG	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar 3,3',5-Triyodo-L-tironina sal de sodio	Sigma Aldrich	T6397-100MG	Caliente en 37 ° C baño de agua antes de usar
DAPI	Santa Cruz Biotechnology	SC-3598
Fluoromount Aquous medio de montaje	Sigma Aldrich	F4680
16% Paraformaldehído	Alfa-Aesar	43368
Antibodies
Mouse anti CD44 - marcado con FITC	BD Biosciences	560977
Ratón anti CD146 - marcado con PE	BD Biosciences	561013
Ratón anti CD73 - marcado con PE	BD Biosciences	561014
Ratón anti-&alfa;-actina de músculo liso	Sigma Aldrich	A2547
Anti-Vimentina para ratones	Abcam	ab8978-100
Anti para ratones - TRA-1-81	Life Technologies	411100
Conejo anti Oct 3/4	Santa Cruz Biotechnology	SC-9081
Ratón Anti Distrofina	Leica Biosystems	NCL-DYSB