Artículo de método

La inmunoterapia sublingual como alternativa para inducir protección contra las infecciones respiratorias agudas

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DOI:

10.3791/52036

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30 de agosto de 2014

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1Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Universidad de la República, 2Present Affiliation: Trinity Biomedical Science Institute, Trinity College Dublin

En este artículo

Resumen

El presente trabajo ilustra la conveniencia de utilizar la inmunoterapia sublingual para estimular la respuesta inmune innata en los pulmones y conferir protección contra la neumonía neumocócica aguda en ratones.

Resumen

La ruta sublingual se ha utilizado ampliamente para introducir pequeñas moléculas en el torrente sanguíneo y modular la respuesta inmunitaria en diferentes sitios. Se ha demostrado que induce eficazmente respuestas humorales y celulares en sitios sistémicos y mucosos, es decir, los pulmones y el tracto urogenital. La vacunación sublingual puede promover la protección contra las infecciones en el tracto respiratorio inferior y superior; También puede promover la tolerancia a los alérgenos y mejorar los síntomas del asma. La modulación de la respuesta inmunitaria pulmonar mediante inmunoterapia sublingual (SLIT) es más segura que la administración directa de formulaciones por vía intranasal porque no requiere la administración de moléculas potencialmente dañinas directamente en las vías respiratorias. A diferencia de la administración intranasal, los efectos secundarios que implican toxicidad cerebral o parálisis facial no son promovidos por la SLIT. Los mecanismos inmunitarios subyacentes a la SLIT siguen siendo difíciles de alcanzar y su uso para el tratamiento de las infecciones pulmonares agudas aún no se ha explorado. Por lo tanto, es necesario desarrollar modelos animales apropiados de SLIT para explorar más a fondo sus posibles ventajas.

Este trabajo muestra cómo realizar la administración sublingual de agentes terapéuticos en ratones para evaluar su capacidad de protección contra la neumonía neumocócica aguda. Se ilustran los aspectos técnicos de la manipulación del ratón durante la inoculación sublingual, la identificación precisa de la mucosa sublingual, el drenaje de los ganglios linfáticos y el aislamiento de tejidos, el lavado broncoalveolar y los pulmones. Se describen en detalle los protocolos para la preparación de suspensiones de una sola célula para el análisis FACS. Se discuten otras aplicaciones posteriores para el análisis de la respuesta inmune. También se explican los aspectos técnicos de la preparación del inóculo de Streptococcus pneumoniae y la provocación intranasal de ratones.

SLIT es una técnica sencilla que permite el cribado de moléculas candidatas para modular la respuesta inmunitaria de los pulmones. Los parámetros que afectan el éxito de SLIT están relacionados con el tamaño molecular, la susceptibilidad a la degradación y la estabilidad de las formulaciones altamente concentradas.

Introducción

El objetivo general de este trabajo es ilustrar los beneficios de la inmunoterapia sublingual para el tratamiento de las infecciones respiratorias agudas (IRA) y presentar las ventajas de esta vía de administración en comparación con otras vías de administración, a saber, la intranasal.

ARI causan millones de muertes cada año, especialmente en niños menores de cinco años. Streptococcus pneumoniae sigue siendo uno de los principales agentes etiológicos de la neumonía bacteriana en lactantes y ancianos1,2. En la actualidad, el principal tratamiento disponible se basa en el uso de antibióticos, pero continuamente surgen cepas resistentes3,4.

SLIT induce amplias respuestas a nivel sistémico y también a nivel de la mucosa, particularmente en el tracto respiratorio5. Tiene eficacia comprobada contra la infección por influenza, promoviendo la protección a largo plazo con la producción de respuestas humorales y celulares6,7. Además, se ha demostrado que el tratamiento profiláctico con lisados bacterianos administrados por vía sublingual redujo las exacerbaciones de la bronquitis obstructiva crónica en ancianos8 y previno infecciones respiratorias recurrentes en niños9. La SLIT ha sido ampliamente utilizada para el tratamiento de las alergias y el asma. Los estudios clínicos no solo han demostrado su eficacia para modular la respuesta inmune en las vías respiratorias, sino también su seguridad10. A pesar del creciente interés de las compañías farmacéuticas y los investigadores en SLIT, los mecanismos implicados en la inducción de respuestas inmunitarias de la mucosa después de la administración sublingual de compuestos siguen siendo oscuros. Recientemente, la atención se ha centrado en los mecanismos que promueven la tolerancia asociados con la desensibilización a los alérgenos. Se ha propuesto que las células residentes y reclutadas en la mucosa sublingual, como las células dendríticas y los macrófagos, pueden promover la tolerancia después de SLIT11-13. Las células dendríticas de la mucosa oral pueden promover las células T auxiliares productoras de IFN-gamma e IL-1011, así como recircular a la mucosa genital distal y promover las células T CD8+ 14. Sin embargo, se sabe poco sobre el impacto de SLIT en las células innatas o su capacidad para mejorar la eliminación de patógenos durante las infecciones respiratorias agudas.

El control natural de la infección neumocócica en los pulmones depende en gran medida de la activación eficiente y rápida de las defensas innatas locales. Anteriormente demostramos que la mejora de la inmunidad innata de los pulmones mediante una dosis intranasal única de flagelina (FliC), un agonista de TLR5 y NLRC4, protege al 75-100% de los ratones desafiados con una dosis letal de un aislado clínico de Streptococcus pneumoniae serotipo 1. Se demostró que esta protección depende del reclutamiento local de células GR1+ (probablemente neutrófilos polimorfonucleares, PMN) y no depende de anticuerpos, células B o T15.

La flagelina es el componente estructural del flagelo bacteriano. En su forma monomérica es reconocido por dos receptores de reconocimiento de patógenos (PRR), el TLR5 que detecta el FliC16 extracelular y el inflamasoma NLRC4/NAIP5 que detecta la flagelina intracelular17,18. Cuando los PRR detectan FliC, se desencadena una respuesta inflamatoria importante. Nosotros y otros hemos demostrado que la instilación de FliC purificado de Salmonella enterica serovar Typhimurium en los pulmones impulsa la producción rápida de quimiocinas y citocinas, especialmente cuando son reconocidas por el epitelio de los pulmones que a su vez orquestan el reclutamiento de células inmunitarias en las vías respiratorias, principalmente PMNs15,19-21. Aunque transitoria, la infiltración sustancial de neutrófilos que tiene lugar en las vías respiratorias después de la administración nasal de FliC podría ser una preocupación si se avanza hacia terapias clínicas para uso humano. La inflamación excesiva podría ser perjudicial para la función de los pulmones. Además, se ha demostrado que la administración intranasal de moléculas inmunoestimuladoras puede causar parálisis facial y/o toxicidad cerebral22-24.

La inmunoterapia sublingual ofrece una alternativa más segura para modular la respuesta inmunitaria en el tracto respiratorio en comparación con la vía intranasal. Es no invasivo, indoloro, sencillo y tiene un buen cumplimiento por parte del paciente25. Además, como se mencionó anteriormente, puede inducir respuestas protectoras en la mucosa respiratoria sin los riesgos asociados a la administración directa intranasal o intrapulmonar de formulaciones. La vía sublingual podría usarse alternativamente para administrar moléculas que tienen grandes efectos sobre el sistema inmunológico del pulmón, pero que se ha demostrado que son tóxicas o provocan una gran inflamación cuando se administran por vía intranasal. Además de estas ventajas, las formulaciones para la inmunoterapia sublingual tienen un menor costo de fabricación, ya que los productos no estériles se pueden administrar por esta vía y el choque endotóxico no es una preocupación para la SLIT. Por otro lado, vale la pena notar que son necesarias dosis más altas de los compuestos inmunoestimulantes en comparación con las utilizadas por vía intranasal o parenteral para inducir una respuesta inmune en los pulmones; también se necesitan soluciones altamente concentradas cuando se utiliza el modelo de ratón de SLIT, ya que el sitio anatómico donde se depositan las formulaciones es pequeño.

Basándonos en nuestros datos publicados anteriormente, desarrollamos un modelo de protección utilizando inmunoterapia sublingual con flagelina como inmunoestimulante modelo. Demostramos que una dosis única de flagelina indujo una supervivencia del 60% contra la neumonía neumocócica invasiva causada por la cepa del serotipo 1, mientras que todos los ratones del grupo de control murieron por infección en un plazo de 5 días. El análisis de citometría de flujo mostró que se recluta un mayor número de PMN en las vías respiratorias de los animales protegidos después del tratamiento sublingual con flagelina, lo que sugiere que estas células podrían estar involucradas en el mecanismo de protección inducido por la inmunoterapia sublingual.

Este video muestra en detalle cómo realizar inmunoterapia sublingual y también cómo recuperar tejido relevante de la mucosa sublingual, drenando los ganglios linfáticos, así como los pulmones y las vías respiratorias para realizar análisis adicionales. Además, ilustra la técnica general de preparación celular para el análisis de FACS y muestra brevemente cómo preparar suspensiones de Streptococcus pneumoniae y cómo realizar infecciones intranasales en ratones para configurar el modelo de infección aguda.

Protocolo

Procedimientos con animales se realizaron de conformidad con el N ° 071140-000821-12 protocolos y 08052010, aprobado por la Comisión Honoraria de Experimentación Animal y la Junta Directiva de la Escuela de Medicina de la Universidad de la República - Uruguay.

1. la administración sublingual del agente terapéutico

  1. Preparar la solución que contiene el agente terapéutico a ensayar. Ajustar la concentración de administrar un volumen máximo de 10 l por ratón.
    NOTA: Para flagelina purificada a partir de Salmonella enterica serovar Typhimurium la dosis óptima para inducir protección en el ratón infectado con la primera dosis letal de S. pneumoniae serotipo 1 E1586, causando una mortalidad del 100% es de 10 g / ratón. Flagelina solución debe calentarse a 65 ° C durante 5 min para asegurar la liberación de los monómeros. Para obtener más información acerca de la purificación flagelina véase la referencia 26.
    1. Varconcentración eficaz y de diferentes agentes inmunomoduladores de acuerdo a su tamaño molecular, la pureza, la susceptibilidad a la proteolisis y el uso de agentes mucoadhesivos. Ajustar la concentración óptima para cada compuesto a ensayar para maximizar sus efectos. Si se han realizado estudios previos por vía intranasal para un compuesto particular, utilizar una dosis inicial de 5 a 10 veces más alta para probar su eficacia por vía sublingual.
  2. Anestesiar a los ratones mediante la inyección de un cóctel que contiene 110 mg / kg de ketamina con 5,5 mg / kg Xylacine y dejar que los animales descansan durante 7 a 10 min.
  3. Confirme la anestesia adecuada presionando suavemente la almohadilla plantar de una de las patas traseras; si anestesiado adecuadamente el animal no se mueve en respuesta al estímulo.
  4. Extender una capa delgada de ungüento veterinario sobre los ojos de cada ratón para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
    NOTA: los anestésicos inhalatorios como isofluorano también se pueden utilizar en lugar de ketamina / Xylacine si un sistema equiparped con conos de cámara y de la nariz de inducción está disponible. Use la cámara de inducción para anestesiar a los animales y administrar el inmunoestimulante por vía sublingual. Conectar inmediatamente el animal a un cono de la nariz durante al menos 15 min para mantenerlo bajo anestesia, para evitar tragar y permitir la absorción del compuesto terapéutico.
  5. Pipetear la solución que contiene la solución inmunoestimulante o control del vehículo; usando el pulgar y el dedo índice de la mano no dominante tome el ratón y manténgalo en posición vertical.
  6. Usando el lugar mano dominante un par de pinzas cerradas bajo la lengua y mantenerla en su lugar usando los dedos medio y anular, abra las pinzas para levantar ligeramente la lengua.
  7. Tomar la pipeta y administrar la solución sobre el suelo de la boca y del lado dorsal de la lengua.
  8. Retire la pinza y dejar que el resto del ratón para 3 a 5 minutos antes de volver a ponerlo en la jaula. Para asegurar que se mantiene la normotermia en el micrófono anestesiadoe, conecte las jaulas a un sistema de calentador de jaula. Si tal sistema no está disponible, lugar ratones pertenecientes al mismo grupo de tratamiento de nuevo en la correspondiente jaula uno al lado del otro sobre la ropa de cama y cubren parcialmente con hojas de papel de seda limpias para ayudar a mantener la temperatura corporal.
  9. Recoger muestras de tejido en cualquier punto de tiempo después de la instilación del agente inmunomodulador para analizar los cambios en las poblaciones de células inducidas por el tratamiento.
    NOTA: En esta administración protocolo particular de flagelina se realizó 2 horas antes de la exposición. Determinar el tiempo óptimo entre el tratamiento y el desafío para cada agente terapéutico particular y el patógeno a ensayar.

2 Preparación de la suspensión bacteriana e intranasal Challenge con Streptococcus pneumoniae

NOTA: S. pneumoniae es un patógeno humano natural que puede causar enfermedades mortales como la neumonía invasiva, sepsisy meningitis. La transmisión puede ocurrir por inhalación o por contacto con la mucosa. Por lo tanto, todas las muestras que pueden haber estado en contacto con S. pneumoniae debe manejarse en una instalación adecuada Nivel de Bioseguridad II utilizando una cabina de bioseguridad clase II. Revise los procedimientos normalizados de trabajo de su institución en relación con el manejo de patógenos Tipo II para la ropa de protección, eliminación de residuos y las medidas de seguridad adicionales que resulten aplicables. Los animales infectados deben mantenerse en jaulas ventiladas individualmente en aisladores equipadas con filtros HEPA. Vacunas contra el neumococo y la terapia con antibióticos están disponibles. Para obtener más información, consulte las referencias 27 y 1.

  1. Descongelar una alícuota de una suspensión de trabajo de Streptococcus pneumoniae del conocido número CFU bacteriana preparada como se describe en el 15.
  2. Centrifugar durante 5 minutos a 2500 xg y RT.
  3. Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento bacteriano suspendiéndolo en 1 ml de stsolución salina erile. Use puntas con filtro en la preparación de diluciones bacterianas suspensión, o para el desafío animal.
  4. De nuevo como centrífuga descrito en el paso 2.2.
  5. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en el volumen apropiado de solución salina estéril para obtener una suspensión de 4x10 5 UFC / l 50. Esta dosis corresponde a la dosis bacteriana mínimo de S. pneumoniae serotipo 1 E1586 que causa 100% de mortalidad en ratones BALB / c de acuerdo con estudios previos 15.
    NOTA: Al establecer un modelo de neumonía neumocócica en ratones, la dosis mínima bacteriana que causa 100% de mortalidad se debe determinar para cada combinación particular de cepa bacteriana, serotipo y cepa de ratón.
  6. Homogeneizar la suspensión bacteriana mediante agitación o pipeteando arriba y abajo 5 veces.
  7. Cargar 50 l de la suspensión bacteriana usando una punta de filtro estéril e inculcar el volumen total en la nariz de un ratón anestesiado. Sostenga el UPRI ratónluchar durante 2 minutos y se deja reposar en posición dorsal durante 2 min más. Aplique un ungüento veterinario en los ojos y devolver los animales a la jaula; asegúrese de mantener la normotermia, mientras que bajo anestesia.
    NOTA: En este estudio la exposición bacteriana se realizó en un volumen de 50 l para asegurar la entrega de al menos 90% del total de CFU en los pulmones como se determinó previamente en 15,28. Para minimizar la angustia de los volúmenes más pequeños del animal (por ejemplo, 20 l) pueden ser utilizados. Sin embargo, la prestación eficiente de bacterias en los pulmones debe ser revisado; esto se puede hacer por la recolección de los pulmones 5 min después de la provocación y contando UFC en homogeneizado de pulmones mediante siembra de diluciones seriadas en placas de agar-sangre.
  8. Confirmar los números de UFC en la suspensión bacteriana utilizada para la infección en placas de diluciones en serie de 10 veces sobre las placas de agar sangre. Incubar O / N a 37 ° C con 5% de CO 2 y contar el número de colonias mucoides presentar una característica de halo verde de albacterias hemolíticas pha.

3. Tissue Recogida y preparación de muestras para Citometría (FACS) Análisis de Flujo

3.1) Colección de tejidos

  1. La eutanasia a los animales por dislocación cervical o el uso de una cámara de CO 2; abrir la cavidad torácica todo el camino hasta el cuello y hacer una incisión a lo largo de las patas delanteras para exponer el lado ventral del cuello y el área submandibular.
  2. Con las pinzas de punta curvada finas tirar suavemente hasta las glándulas salivales y el tejido blando adyacente para exponer el lado dorsal de la piso de la boca. Con unas pinzas de punta fina curvada, tomar la mandíbula y los ganglios linfáticos mandibulares accesorias tirando suavemente y colocarlos en un tubo que contiene RPMI completo (cRPMI, de 500 ml-10% suero bovino fetal, 5 ml de una solución que contiene 10.000 U / ml solución de penicilina y 10 mg / ml de estreptomicina y 5 ml de L-glutamina 200 mM) o solución conservante ácido nucleico de acuerdo con el procedimiento descendente que sellevarse a cabo más tarde.
  3. Para abrir la cavidad torácica hacer una incisión en el diafragma; usando un par de pinzas-rata dentada sujetar el cartílago xifoides del esternón y corta cuidadosamente las costillas en ambos lados dorsales a partir de las falsas costillas todo el camino hasta llegar al punto en el que las verdaderas costillas se unen al manubrio del esternón.
  4. Al mantener el cartílago xifoides del esternón con las pinzas, tire suavemente para exponer los órganos de la cavidad torácica.
  5. Retire las costillas completamente cortando las primeras costillas y la clavícula. El timo aparecerá como una estructura blanca de dos lóbulos situados en la parte anteroventral del tórax cerca de la base del corazón.
  6. Tome uno de los lóbulos de sujeción con un par de pinzas y usar un par de tijeras para quitar los ligamentos entre su cara inferior y el pericardio. Proceda a retirar el segundo lóbulo.
  7. Identificar la cavidad abdominal y abrir cortando a lo largo del eje medio de la mpared uscular para exponer los órganos. Con un par de pinzas de cortar la vena cava posterior y la aorta torácica; eliminar el exceso de sangre con un tejido absorbente.
  8. Para analizar los residentes e infiltrantes poblaciones de células de los alvéolos realizan el lavado broncoalveolar (BAL). Cortar los músculos en la parte ventral del cuello para exponer la tráquea y el esófago; para separarlos hacen incisiones en los lados laterales y dorsales de las estructuras.
  9. Levante la tráquea con las pinzas y hacer una pequeña incisión con un bisturí para introducir una pipeta de transferencia de punta fina llena con 1 ml de PBS sin Ca 2 + / Mg 2 + más EDTA 1 mM. Inculcar y aspirar el volumen total al menos tres veces; aspirar y transferir la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml estéril y colóquelo sobre hielo.
  10. Para analizar las poblaciones celulares presentes en el parénquima pulmonar, primero perfundir los pulmones mediante la inyección de 5 ml de PBS sin Ca2 + / Mg2 + más EDTA 1 mM en el ventrículo derechodel corazón.
    NOTA: Esto eliminará la mayor parte de las células rojas de la sangre y las células inmunes presentes en los vasos sanguíneos de los pulmones. Si la perfusión se realizó correctamente, los pulmones de color cambiará de color rosa a blanco.
  11. Aislar el corazón de los pulmones mediante la sujeción de la base del ventrículo izquierdo y delicadamente cortar los vasos sanguíneos con tijeras para quitar completamente. Tome los pulmones perfundidos y colocarlos en cRPMI o solución conservante ácido nucleico según el análisis de aguas abajo a realizar.
  12. Para el análisis de las poblaciones de células en la mucosa sublingual, aislar la cabeza del animal y quitar las glándulas salivales y el tejido blando adyacente si no se ha hecho en el paso 3.2.1.
  13. Hacer una incisión en cada lado de la boca hasta llegar a la articulación de la mandíbula y separar la mandíbula inferior con la lengua y el suelo de la boca, el uso de clavos fijan en el tablón de disección. Tire hacia arriba de la lengua; utilizando un bisturí hacer una incisión en el baSE de la lengua con el piso de la boca hasta llegar a los terceros molares para exponer la mucosa sublingual.
  14. Sacar la lengua por completo; tomar un punzón de biopsia de 0,5 mm y colocarlo al lado de los incisivos inferiores. Corte de la inserción del tejido gingival sublingual y presione suavemente hasta que el suelo de la boca ha sido cortada por completo.
  15. Repetir una vez más ahora colocar el punzón de biopsia cerca de los terceros molares para completar la eliminación del tejido sublingual. Colocar en un tubo limpio que contiene cRPMI o conservante ácido nucleico.

3.2) Preparación de la muestra para el análisis FACS.

  1. Transferencia de tejido de los pulmones aislados de cada ratón en una placa de 24 pocillos y picar con un par de tijeras limpias hasta obtener pequeños trozos de tejido de aproximadamente 2 mm. Añadir 1 ml por pocillo de medio de digestión que contiene 30 mg de colagenasa tipo II, 50 mg de ADNasa-I en 1 ml de RPMI sin FBS. Suavemente con la pipeta cinco veces e incubar a37 ° C y 5% de CO2 durante 40 min.
    1. Para el análisis de poblaciones celulares en el tejido sublingual, sustituir el medio digestión en 3.2.1 con una que contiene 2 unidades de dispasa, 30 mg de colagenasa de tipo II, 50 mg de DNAsa I en 1 ml de RPMI. Incubar el tejido recogido de un ratón en 500 l de medio de digestión durante 20 min a 37 ° C en un agitador orbital a 50 rpm.
  2. Después de la incubación, la pipeta hacia arriba y abajo hasta 10 veces o 30 segundos hasta que la mayor parte del tejido se ha interrumpido. Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras estéril y lavar con 5 ml de PBS suplementado con EDTA 5 mM.
    NOTA: La digestión completa de la matriz extracelular y el tejido fibroso no se logrará. Sin embargo, no se recomiendan tiempos de incubación más largos en presencia de colagenasa y / o dispasa o trituración agresivo ya que se traducirá en un aumento de la muerte y la destrucción de las proteínas extracelulares que afectan al resultado global de la F celularACS.
  3. Se centrifuga a 400 xg, 5 min, 4 ° C.
    1. Para el análisis de las poblaciones de células en el BAL, centrifugar las células a 400 xg, 5 min, a 4 ° C y continúe con el paso 3.2.4.
    2. Para el análisis de poblaciones celulares en los ganglios linfáticos, coloque un colador de 70 micras de células en una placa de Petri estéril y poner los ganglios linfáticos junto con 1 ml de cRPMI en el colador. Saque el paso de un 2 ml jeringa estéril y lo utilizan como una mano de mortero para aplastar a los ganglios linfáticos en contra de malla del tamiz. Enjuague el filtro de células con 1 ml de cRPMI fresco y transferir las células de la placa de Petri a un tubo estéril.
  4. Tomar una alícuota representativa de cada muestra y teñirla con azul de tripano para determinar el número de células viables.
  5. Resuspender las células en FACS-EDTA: PBS-EDTA 5 mM-1% de albúmina de suero bovino para formar una suspensión de 2x10 7 células / ml y añadir 50 l en un tubo de citómetro.
  6. Preparar una mezcla que contiene el anticuerpo 2X aproxopriate combinaciones de anticuerpos contra marcadores de superficie y fluorocromos de acuerdo con el instrumento FACS disponible. Añadir 50 l de la mezcla de anticuerpos 2X en cada tubo que contiene la suspensión celular.
    NOTA: Valorar cada anticuerpo marcado con fluorocromo para determinar la cantidad óptima a emplear, para un protocolo detallado véase la referencia 29.
  7. Incubar 30 minutos en hielo en la oscuridad.
  8. Lavar una vez con 3 ml de FACS-EDTA y centrifugar las células por centrifugación a 400 xg durante 5 min a 4 ° C, resuspender las células en 200 l del mismo tampón y analizar en un citómetro de flujo.
    NOTA: Si el manejo de un gran número de muestras, el protocolo de tinción para el análisis de FACS descrito anteriormente se puede realizar en placas de 96 pocillos de fondo en U en lugar de tubos de citómetro. Sin embargo, si se utiliza de 96 pocillos pasos placas de lavado se debe realizar mediante la adición de hasta 200 l de FACS-EDTA y repetir 4 veces desacelerándose las células a 400 xg durante 5 min a 4 ° C entre cada washipaso ng.
  9. En este punto, fijar las muestras para el análisis en el citómetro de flujo más tarde (hasta 72 h después de la fijación).
    1. Para fijar las células, después de marcar con los FACS-anticuerpos lavar las células en PBS sin Ca 2 + / Mg2 +, EDTA 1 mM sin ​​FBS. Suspender las células en 50 l del mismo tampón y añadir 50 l de una solución recién preparada de paraformaldehído al 4% en hipertónica (2X) PBS sin Ca 2 + / Mg 2 +.
    2. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente y lavar 3 veces en FACS-EDTA.
    3. Resuspender las células en 200 l de FACS-EDTA y se almacenan a 4 ° C y protegido de la luz durante un máximo de 72 h.
      NOTA: FSC-SSC puede verse afectada por la fijación. Si la fijación de las muestras, compruebe la compatibilidad de anticuerpos marcados con fluorescencia con el fabricante ya que los tintes tándem se pueden degradar en presencia de agentes de fijación. Si las muestras procedían de animales infectados fijación es muy recomendable para eliminar los agentes patógenos viables estarán presentes cuando Analycantar las muestras en la máquina FACS desde microaerosols se pueden generar durante la adquisición de la muestra.

4. total extracción de RNA, cDNA de síntesis y PCR en tiempo real.

4.1) La extracción de RNA y la síntesis de ADNc.

  1. Homogeneizar el tejido en la solución de conservante de ácido nucleico de elección por disrupción mecánica (por ejemplo, usando un homogeneizador rotor-estator, de alta velocidad de agitación tejido-ruptor y perlas, etc). Se centrifuga a 12.600 xg durante 15 min y 4 ° C para eliminar los restos de tejido. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
  2. Extraer el ARN con el método de elección, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    NOTA: El ARN es muy susceptible a la degradación, si no se va a utilizar inmediatamente después del aislamiento, hacer alícuotas y almacenarlas en RNAsa tubos libres a -80 ° C. Evite congelar y descongelar repetidamente. Los tubos deben ser manejados con guantes en todo momento. Después de descongelar las muestras de uniempre mantenerlos en hielo.
  3. Medir la absorbancia de ácidos nucleicos a 260 nm y calcular la concentración en g / l.
  4. Prepare DNasa-I mezcla por adición de (por ejemplo 1): 7.6 l de agua ultrapura, 1 l de tampón 10X DNasa I, 0,4 l de DNasa-I (grado de amplificación) stock 1 U / l, y añadir 8,4 l de la ADNasa-I de la mezcla a cada muestra que contiene 1 g de ARN total.
    1. Utilice ARN a una concentración de 1 g / l y realizar la reacción de retrotranscripción (RT-PCR) mediante la adición de 1 l de la ARN total como plantilla. Si las muestras son demasiado diluido y la concentración es más baja de lo esperado, añadir volúmenes más grandes de ARN total en lugar de agua. No exceda 20% del volumen final de reacción al añadir el ARN especialmente si el protocolo de extracción de ARN de elección involucrado mezcla de fenol-cloroformo ya que las trazas de fenol podrían afectar el rendimiento de la RT-PCR.
  5. Incubar 15 min a RT seguido por 10 min a 4 ° C o ice. (No exceda el tiempo de incubación !!)
  6. Añadir 1 l de EDTA 25 mM (grado biología molecular) a cada tubo y se incuba a 65 ° C durante 10 min para inactivar la DNasa-I.
  7. Preparar retrotranscripción (RT) de mezcla de la siguiente manera (para 1 reacción): 1 l cebadores hexámeros al azar Stock 0,2 mg / ml, 1 mu l de stock dNTPs 10 mM, 4 l de tampón 5X M-MLV RT-, 2 l de DTT 0,1 M, 1 l RNAse OUT de stock 40 U / l, y 1 l M-MLV retrotranscriptasa de stock 200 U / l.
  8. Añadir 10 l de RT-PCR se mezclan para el tubo de reacción 10 l de DNasa-I.
  9. Llevar a cabo la reacción de PCR en un termociclador de acuerdo con el siguiente programa:
    1X ciclo: 10 min, 25 ° C; 50 min, 37 ° C; 15 min, 70 ° C
  10. Diluir el ADNc 1: 5 mediante la adición de 80 l de agua ultrapura. Almacenar a -20 ° C.

4.2) PCR en tiempo real (qPCR).

  1. Prepare la mezcla de reacción qPCR de la siguiente manera (para 1 reacción): mezcla maestra 5 l que contiene Taq ADN Polymerase, SYBR tinte verde, PCR Buffer, mezcla dNTP y MgCl2 (ver 4.2.2 más abajo); 0,9 l de una solución 10 mM de stock del cebador directo, 0,9 l de una solución 10 mM de stock del cebador inverso, 1,2 l de agua ultrapura, y 2 l de molde de ADNc previamente diluido como se indica en el paso 4.1.10.
    NOTA: concentración de reactivos y ciclismo protocolos utilizados en esta sección han sido optimizados para ser llevado a cabo específicamente con los reactivos e instrumentos descritos en la "Tabla de Materiales y Reactivos", otras marcas pueden ser utilizadas, pero los volúmenes de reacción, concentración de reactivos y protocolo de ciclos pueden variar. Compruebe las instrucciones de su fabricante antes de la realización de RT-qPCR.
  2. Instale el instrumento qPCR de la siguiente manera:
    1X ciclo: 15 min, 95 ° C
    40X ciclos: 15 seg, 95 ° C seguido de 1 min, 60 ° C (en este punto adquieren fluorescencia).
    NOTA: Para la cuantificación relativa de ARNm de acuerdo con el método de Ct 30 una reference gen debe ser seleccionado para la normalización de los valores de Ct. Gen de referencia de elección debe ser probado bajo condiciones de ensayo específicas como su expresión puede variar; Actb, Gapdh o 18S son algunos de los genes normalmente seleccionada como referencias.
  3. Establecer el valor de umbral y analizar los datos.

Resultados

La inmunoterapia sublingual puede ser utilizado con éxito para modular la respuesta inmune pulmones. Hemos demostrado que una sola dosis de flagelina, el agonista de TLR5 y NLRC4, puede inducir la regulación al alza significativa del ARNm que codifica el CXCL1 quimiocinas, CCL20 y la citoquina IL-6 en comparación con los controles tratados con solución salina. Dobla la inducción de los niveles de mRNA alcanzó un máximo de 8 horas después de la ITSL y volver a los niveles basales después de 20 horas (Figura 1). Sin embargo, cuando SLIT se realizó 2 horas antes de la infección intranasal con S. Pneumoniae, los niveles de CXCL1 e IL6 mRNA permanecieron significativamente upregulated incluso 24 horas después de SLIT comparación con los animales no tratados (Figura 2).

Análisis de las poblaciones de células en el BAL y tejido pulmonar por FACS reveló que los animales tratados con FliC por vía sublingual habían aumento del número de neutrófilos en las vías respiratorias, pero no en el tejido de los pulmones (Figura 3).

la Figura 4, la SLIT con flagelina promovió la protección y el aumento de la supervivencia contra la neumonía neumocócica aguda.

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Figura 1. Cinética de perfil transcripcional de los pulmones después de la inmunoterapia sublingual con flagelina. Ocho a 10 semanas de edad ratones BALB / c (n = 4) fueron tratados con 10 g de flagelina o solución salina por vía sublingual bajo anestesia. Los pulmones se recogieron en diferentes puntos de tiempo y se colocaron en conservante de ácido nucleico. Extracción de RNA total se realizó y se sintetizó ADNc. niveles de mRNA fueron evaluados por PCR en tiempo real utilizando los cebadores específicos enumerados en Table 1. cuantificación relativa se realizó de acuerdo? Ct método usando niveles Actb de ARNm para la normalización. Los resultados se muestran como veces mayor en comparación con el grupo de solución salina tratada como mediana ± SEM. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p <0,05), calculado de acuerdo con la prueba de Mann-Whitney. Los resultados son representativos de 2 experimentos independientes.

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Figura 2. perfil transcripcional pulmones durante la neumonía neumocócica después de la inmunoterapia sublingual con (n = grupo tratado para n = 4 para el grupo control y 7) flagelina. Ocho a 10 semanas de edad ratones BALB / c fueron tratados con 10 g de flagelina o solución salina por vía sublingual bajo anestesia. 2 horas más tarde los ratones se expusieron por vía intranasal con la dosis letal mínima (MLD), causando 100% de mortalidad de un aislamiento clínico de S. pneumoniae serotipo 1 E1585, correspondiente a 4x10 5 UFC / l 50. Se recogieron los pulmones 24 h después del desafío y se almacenan en conservante de ácido nucleico hasta la extracción de ARN y síntesis de ADNc se llevaron a cabo. PCR en tiempo real se llevó a cabo (Ver la lista de cebadores en la Tabla 1) y la cuantificación relativa se realizó de acuerdo? Ct método utilizando niveles de ARNm Actb para la normalización. Los resultados se muestran como veces mayor en comparación con el grupo de solución salina tratada como mediana ± SEM. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p <0,05), calculado de acuerdo con la prueba de Mann-Whitney.

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Figura 3 Análisis de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) el reclutamiento en el tejido de las vías respiratorias y pulmones después de la ITSL. Ocho a10 semanas de edad ratones BALB / c (n = 4) fueron tratados con 10 g de flagelina o solución salina por vía sublingual bajo anestesia. 2 horas más tarde los ratones se expusieron por vía intranasal con la MLD de S. pneumoniae serotipo 1 E1585. 24 horas después de la exposición, BAL se realizó y los pulmones se procesaron para el análisis FACS. PMN se identificaron como células CD11b Ly6G altas / alta / CD11c negativos y basado en el perfil FCS-SSC. Los resultados se expresan como porcentaje de PMN con respecto del número total de células en BAL o los pulmones. Las barras representan media ± SEM. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p <0,05), calculado de acuerdo con una sola vía de Mann-Whitney.

figure-results-4
Figura 4. SLIT con flagelina protege a los ratones contra la neumonía neumocócica aguda. S. pneumoniae serotipo 1 E1585. La supervivencia se evaluó sobre una base diaria. Las curvas de Kaplan-Meier se compararon según test de Log-rank (Mantel-Cox). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p <0,05) .Results son representativos de 2 experimentos independientes.

Nombre Secuencia 5'-3 ' Longitud del producto de PCR (pb)
mB-actin_F GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT 68
mB-actin_R CGTCATCCATGGCGAACTG
mCCL20_F TTTTGGGATGGAATTGGACAC 69
mCCL20_R TGCAGGTGAAGCCTTCAACC
mCXCL1_F CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA 84
mCXCL1_R ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT
mIL-6_F GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA 78
mIL-6_R AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA
mTNFalpha_F CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA 63
mTNFalpha_R CCTCCACTTGGTGGTTTGCT
mCxcl2_F CCCTCAACGGAAGAACCAAA 72
mCxcl2_R CACATCAGGTACGATCCAGGC

Tabla 1 lista Primer utilizado para el análisis de PCR en tiempo real. Secuencias de cebadores específicos utilizados para el análisis qPCR. Adelante y cebadores para ACTB ratón revertir, Cccl20, CXCL1, Il6, TNFa y CXCL1 se presentan como secuencias 5'-3 'y la longitud de producto esperado se indica en pares de bases (pb).

Discusión

La administración sublingual de agentes terapéuticos ha demostrado como un medio útil para modular la respuesta inmune en el tracto respiratorio. La principal ventaja de SLIT para el tratamiento de afecciones respiratorias es que no implica la entrega directa de los compuestos en los pulmones o la nariz, siendo más seguro que los tratamientos basados ​​en la administración intranasal 31.

La inmunoterapia sublingual puede utilizarse para modular la respuesta inmune de diferentes maneras, ya sea para la inducción de respuestas reguladoras que pueden mejorar los síntomas de la inflamación alérgica y el asma o 32 para inducir la activación transitoria de mecanismos inmunes innatas para tratar infecciones pulmonares agudas como se muestra aquí.

El modelo de ratón se presenta en este vídeo es un método conveniente para la detección de diferentes compuestos como agentes terapéuticos para SLIT.

Este modelo animal ofrece un medio útil para determinar el impactode SLIT en la respuesta inmune de los pulmones, así como en otros órganos (por ejemplo., ganglios linfáticos de drenaje o de los sitios de la mucosa distales) que no puede ser imitado por el uso de modelos in vitro. Aunque hay varios artículos que describen los resultados obtenidos con la inmunoterapia sublingual, métodos de desarrollo para los procedimientos de administración sublingual no se han facilitado todavía. Además, el modelo se puede utilizar para la evaluación de las vacunas sublinguales con el objetivo de conferir protección sistémica así como local en el tracto respiratorio.

Como se muestra en el vídeo adjunto, la administración sublingual de los compuestos es un procedimiento simple que puede ser realizado fácilmente sin la necesidad de una amplia formación. Por lo general, una persona competente en el manejo de animales requerirá 1 hora para realizar la ITSL en un grupo de 10 ratones utilizando anestésicos inyectables como se describe en este protocolo. Si reto neumocócica se realiza, así, se requerirá 90 min adicional para prepararla suspensión bacteriana y realizar desafío intranasal de los animales.

Los protocolos de FACS presentados aquí permiten la caracterización adecuada de impacto de la ITSL en el sitio local de la administración, ganglios linfáticos de drenaje, así como sus efectos sobre la dinámica celular de los pulmones.

El análisis separado de la broncoalveolar parénquima pulmonar contenido y es importante para discriminar residente inmune de las vías respiratorias y de la infiltración de los tipos de células de las que quedan dentro del tejido. El análisis del contenido BAL permite el estudio de la facturación de los macrófagos alveolares, así como la dinámica de reclutamiento células en los espacios alveolares inducidas por diferentes tratamientos, por ejemplo., PMN, eosinófilos, monocitos. BAL también se puede utilizar para evaluar la presencia de citocinas y quimiocinas secretadas por el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o la detección de anticuerpos IgA secretados inducidos después de la vacunación sublingual. Estudio de los tejidos de los pulmonespermitirá caracterización de otros tipos de células, células dendríticas Clásicamente, las células T y células B.

Preparación de muestras de BAL y los ganglios linfáticos para el análisis FACS es simple. Después de la recogida de la muestra, se requieren normalmente de 60 minutos para completar el protocolo de tinción durante 10-20 muestras. En contraste, el aislamiento de las células de los pulmones o el tejido sublingual requerirá más tiempo ya que se requiere la digestión de la matriz extracelular. La absorción del agente terapéutico administrado por vía sublingual puede abordarse mediante el seguimiento de las moléculas con fluorescencia o marcadas radiactivamente utilizando en los sistemas de formación de imágenes in vivo.

La inmunoterapia sublingual es un método atractivo para inducir eficazmente las respuestas inmunes en el tracto respiratorio, así como sistémicamente que puede ser utilizado para tratar o prevenir enfermedades respiratorias. La elucidación de los mecanismos que determinan la activación vs tolerancia de la respuesta inmune en el tracto respiratorio después de SLIT ies crucial para permitir el diseño racional de nuevas estrategias terapéuticas que podrían ser utilizados solos o en combinación con tratamientos disponibles contra diferentes condiciones respiratorias.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Jean-Claude Sirard del Centro de Infección e Inmunidad de Lille, Instituto Pasteur de Lille-Francia, por proporcionar amablemente la flagelina purificada y a la Dra. Teresa Camou, Directora del Laboratorio Nacional de Referencia, Ministerio de Salud de Uruguay por proporcionar amablemente la cepa neumocócica.

Los autores desean expresar su reconocimiento a los Sres. Diego Acosta e Ignacio Turel de BichoFeo Producciones-Uruguay por su compromiso y arduo trabajo durante toda la producción y edición del video.

Este trabajo fue apoyado por las becas PR_FCE_2009_1_2783 y BE_POS_2010_1_2544 de la Agencia Nacional de Investigación e Innovación, ANII de Uruguay, el Programa para el Desarrollo de las Ciencias Básicas, PEDECIBA de Uruguay y la Comisión Sectorial de Investigación Científica, CSIC-Universidad de la República, Uruguay.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de ketamina (50 mg/ml)Pharma Service, Uruguay
Solución de xilacina (2 %)Portinco S.A., Uruguay
Jeringa estéril de 1 mlModern, Uruguay
Aguja estéril de 27 gModern, Uruguay
RPMI 1640General Electric Health CareE15885
Suero Fetal BovinoATCC302020
Solución de penicilina/estreptomicinaSIGMAP4333
PBS estéril sin Ca2+/Mg2+PAAH21002
Colagenasa tipo ITechnologies/Gibco17100017
desoxirribonucleasa I (ADNasa-I)SIGMAD4513
DispasaLife Technologies/Gibco17105041
PerCP-Cy5.5 rata conjugada anti ratón IgG2b anti CD11bBD550993Clon M1/70
APC conjugado hámster anti ratón IgG1 anti CD11cBD550261Clon HL3 
APC-Cy7 rata conjugada anti ratón IgG2a anti Ly6GBD560600Clon 1A8
Solución salina estérilLaboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay
Agar de soja trípticoBD Difco, Francia236950
Sangre de oveja desfibrinadaBiokey, Uruguay
Placas de Petri EstérilesGreiner633180
p10 PipetaGilsonF144802
p20 PipetaEppendorf3120000097
p200 PipetaGilsonF123601
p200 PipetaCappC200
p200 PipetaEppendorf3120000054
p1000 PipetaEppendorf3120000062
Puntas de filtro estériles p10Greiner771288
Puntas de filtro estériles p200Greiner739288
Puntas de filtro estériles p1000Greiner750288
VortexBIOSANV1-plus
Pinzas de punta fina de acero inoxidable SIGMAZ168785/Z168777Curvas y rectas
Pinza de tejido de vendajeSIGMAF4392Longitud 8 pulgadas
Pinzas de microdisecciónSIGMAF4017Recta 
pinza de microdisecciónSIGMAF4142 curvo
Tijeras de mayoSIGMAZ265993 
BisturíSAKIRA MEDICAL
Biopsia estéril Punch & Oslash; 3mmStiefel Laboratories Ltd.2079Dde 5 mm de diámetro también se puede utilizar
Tubos estériles de 1,5 mlDeltalab200400P
Estériles de 15 ml TubosGreiner188271
Estériles de 50 ml TubosGreiner227261
Pipetas serológicas estériles 5 mlGreiner606160
Pipetas serológicas estériles 10 mlGreiner607160
Pipetas serológicas estériles 25 mlGreiner760180
Cabina de seguridad biológica, clase IISerie Thermo Scientific1300, microaislador tipo A2
  BastidorRAIR  IsoSystem 76144WSuper  Ratón  1800 AllerZone 
Microcentrífuga refrigeradaEppendorfLegend Micro 21R
MicrocentrífugaHeraeusBiofuge-pico
CentrífugaThermo ScientificSorval ST40R
CO2 Incubadora Modelo ThermoScientific  3111
Pipetas pasteur estériles de punta finaDeltalabD210022
Pipetas pasteur estérilesDeltalab200007
Placa estéril de 24 pocillosGreiner662160
Solución azul de tripano Life TechnologiesT10282
Contador automático de celdas - CountessLife TechnologiesC10227 
Portaobjetos de cámara de recuento de células CountessTechnologiesC10312
Tubos de citometría de flujoBD343675
Citómetro de flujo - FACS Canto-IIBD
Instrumento de PCR en tiempo real - Rotor Gene Q o ABI 7900Qiagen / Applied Biosystems
Reactivo TrizolLife Technologies15596-026Molecular Grado Biológico
DNAse-ILife Technologies18068-015Biología Molecular Grado
ADNasa-I Buffer 10XLife Technologies18068015Biología Molecular Grado
EDTA 25 mMLife Technologies18068015Grado de Biología Molecular
Agua ultrapuraTechnologies10977Biología Molecular Grado
RNAse OutLife Technologies100000840Grado de Biología Molecular Imprimadores
Hexámero AleatorioLife TechnologiesN8080127Biología Molecular Grado
M-MLV-RT TAMPÓNLife Technologies18057-018Biología Molecular Grado
M-MLV-RT enzimaLife Technologies28025-021Biología Molecular Grado
QuantiTect Syber Green PCR KitQiagen204143Biología Molecular Grado
Específico de Biología Molecular Grado de Biología Molecularde Life Technologies
Life Life Life de

Referencias

  1. Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012. Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).
  2. Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en (2013).
  3. Appelbaum, P. C., et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).
  4. Ramirez, J. A., Anzueto, A. R. Changing needs of community-acquired pneumonia. J Antimicrob Chemother. 66, 3-9 (2011).
  5. Cuburu, N., et al. Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice. Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).
  6. Pedersen, G. K., et al. Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP. PLoS One. 25, 1-12 (2011).
  7. Song, J. H., et al. Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).
  8. Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study. Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).
  9. Rosaschino, F., Cattaneo, L. Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL). Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).
  10. Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).
  11. Mascarell, L., et al. Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells. J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).
  12. Mascarell, L., et al. Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells. Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).
  13. Mascarell, L., et al. Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice. Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).
  14. Hervouet, C., et al. Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells. Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).
  15. Munoz, N., et al. Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection. Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).
  16. Hayashi, F., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 410, 1099-1103 (2001).
  17. Lightfield, K. L., et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).
  18. Lightfield, K. L., et al. Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome. Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).
  19. Honko, A. N., Mizel, S. B. Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung. Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).
  20. Janot, L., et al. Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin. Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).
  21. Van Maele, L., et al. TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa. J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).
  22. Lee, S. J., et al. Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children. Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).
  23. Lewis, D. J., et al. Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS One. 4, e6999(2009).
  24. Mutsch, M., et al. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).
  25. Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. Sublingual immunotherapy in children: an updated review. Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).
  26. Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).
  27. Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php (2011).
  28. Marques, J. M., et al. Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity. Immunobiology. 217, 420-429 (2012).
  29. Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. 4, Unit 4.1(2001).
  30. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).
  31. Pedersen, G., Cox, R. The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).
  32. Vitaliti, G., et al. Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).

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