El uso de MALDI-TOF espectrometría de masas y una base de datos personalizada para caracterizar bacterias indígenas a una cueva entorno único (Kartchner Cavernas, AZ, EE.UU.)

Resumen

Este trabajo detalla los procedimientos para la identificación rápida de bacterias utilizando MALDI-TOF MS. Los procedimientos de identificación incluyen la adquisición del espectro, la construcción de bases de datos y los análisis de seguimiento. Se presentan dos métodos de identificación, el basado en coeficientes de similitud y el método basado en biomarcadores.

Resumen

La espectrometría de masas MALDI-TOF ha demostrado ser una herramienta rápida y fiable para la identificación de bacterias en el género y la especie y, en algunos casos, a nivel de cepa. Se han desarrollado herramientas de software disponibles en el mercado y de código abierto para facilitar la identificación; Sin embargo, en la literatura no se ha descrito un canal de análisis de datos universal/estandarizado. Aquí, proporcionamos una demostración completa y detallada de los procedimientos de identificación bacteriana utilizando un espectrómetro de masas MALDI-TOF. Se recolectaron espectros de masas de 15 bacterias diversas aisladas de las cavernas de Kartchner, Arizona, EE. UU., y se identificaron mediante secuenciación de ADNr 16S. Las bases de datos se construyeron en BioNumerics 7.1. Se realizaron análisis de seguimiento de los espectros de masas, incluidos análisis de conglomerados, coincidencia de picos y análisis estadísticos. La identificación se realizó utilizando muestras codificadas a ciegas seleccionadas aleatoriamente de estas 15 bacterias. Se presentan dos métodos de identificación: el basado en coeficientes de similitud y el método basado en biomarcadores. Los resultados muestran que ambos métodos de identificación pueden identificar las bacterias a nivel de especie.

Introducción

La espectrometría de masas (MS) de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) ha demostrado ser una herramienta rápida y fiable para la identificación de bacterias en el género, la especie y, en algunos casos, los niveles de cepa^1-4. MALDI-TOF MS ioniza moléculas biológicas (típicamente proteínas) que se originan en superficies celulares, membranas intracelulares y ribosomas de células enteras bacterianas o extractos de proteínas^1,5. Los picos resultantes forman patrones característicos o "huellas dactilares" de las bacterias analizadas¹. La identificación de las bacterias se basa en estas "huellas dactilares" de masa a carga.

Dos de las estrategias de identificación más utilizadas son las basadas en bibliotecas y las estrategias basadas en bioinformática¹. Los enfoques basados en bibliotecas implican la comparación de los espectros de masas de las incógnitas con los espectros de masas previamente recopilados de bacterias conocidas en bases de datos/bibliotecas para su identificación. Los programas informáticos disponibles en el mercado, como los paquetes de software BioNumerics, Biotyper y SARAMIS, así como las herramientas de software de código abierto, como SpectraBank⁶, están disponibles para facilitar la comparación y cuantificación de la similitud entre los espectros de masas de las incógnitas y las bacterias de referencia. Los enfoques basados en la bioinformática generalmente se basan en genomas completamente secuenciados de bacterias para la identificación. A diferencia de los enfoques basados en bibliotecas, que no implican la identificación de la naturaleza biológica de picos particulares, los enfoques basados en la bioinformática implican la identificación de proteínas¹.

La mayoría de los estudios recientes basados en huellas dactilares de MALDI han utilizado enfoques basados en bibliotecas para identificar bacterias¹. Los enfoques basados en bibliotecas requieren la construcción de bases de datos y la comparación de la similitud entre los espectros de masas. Los estudios muestran que muchos procedimientos experimentales, como el medio^3,7, el tiempo de cultivo⁸, el método de preparación de la muestra³ y la matriz utilizada⁹, afectan los espectros de masas obtenidos. Además, algunas especies y cepas estrechamente relacionadas generan espectros con solo diferencias sutiles. Por lo tanto, los enfoques basados en bibliotecas requieren procedimientos rigurosamente estandarizados para generar espectros de masas altamente reproducibles entre réplicas. Pequeñas variaciones en los protocolos pueden comprometer la eficacia de la identificación, especialmente a nivel de subespecie y cepa^1,3,10. Sin embargo, ni las bases de datos de referencia proporcionadas por el fabricante ni las bases de datos personalizadas notificadas incluyen procedimientos visualmente documentados para la construcción de bases de datos y/o la aplicación de una canalización de análisis de datos. Por esta razón, el objetivo de este trabajo fue desarrollar, aplicar y demostrar un procedimiento completo y detallado para la identificación bacteriana basada en bibliotecas utilizando MALDI-TOF MS.

En esta demostración, se recogieron espectros de masas de 15 bacterias aisladas de un entorno kárstico (Caverna Kartchner, AZ, EE.UU.) y se importaron a un software para construir una base de datos modelo. El procesamiento de datos y la canalización de análisis se detallaron utilizando la base de datos modelo. Por último, se recogieron de nuevo los espectros de masas de las bacterias codificadas a ciegas que se seleccionaron aleatoriamente de estas 15 bacterias y se compararon con los espectros de referencia de la base de datos modelo para su identificación. Los resultados muestran que las bacterias pueden identificarse correctamente en función de los coeficientes de similitud o de los posibles biomarcadores/clases de picos.

Protocolo

Precaución: las bacterias no identificados de cualquier entorno pueden ser patógenos y deben ser manejados con precaución el uso de protocolos de bioseguridad adecuadas. Trabaja con cultivos vivos debe realizarse en una cabina de seguridad biológica Clase II utilizando procedimientos de seguridad biológica de nivel 2 (BSL-2). Más información acerca de BSL-2 procedimientos está disponible en el manual CDC / NIH titulado, "Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos", páginas 33-38. El documento está disponible en línea en http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Equipos de protección personal (PPE), incluyendo batas de laboratorio / batas, gafas de seguridad y guantes de nitrilo o látex, se debe usar. Prácticas y precauciones análisis microbiológico de base deben seguir, y residuos biológicos peligrosos deben desecharse adecuadamente.

Las bacterias utilizadas en esta demostración se aislaron de las Cavernas Kartchner,AZ, EE.UU., a partir de cuatro ambientes, incluyendo espeleotema seco, piedra flujo, espeleotemas húmedo y goteo estalactita (Tabla 1). Todos los aislamientos fueron identificados por secuenciación de 16S rDNA y se mantuvieron a -80 ° C en 25% de glicerol-R medio ₂ B. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente.

Nota: Se recomienda utilizar el mismo método de preparación de muestras para adquirir espectros de masas para la construcción de bases de datos y los espectros de masas de incógnitas. Método de preparación de la muestra se ha demostrado previamente para afectar a la calidad del espectro y reproducibilidad ^3. Utilizando un método de preparación de la muestra diferente puede causar una incorrecta identificación de incógnitas, especialmente cuando mayor resolución taxonómica (por ejemplo, a nivel de cepa) que se desea.

1. Deposición en el Target MALDI

Precaución: Varios protocolos para obtener extractos de proteínas requieren el uso de ácidos y disolventes orgánicos que deben utilizarse de acuerdo con GUIDElines y la información contenida en sus respectivas Hojas de Datos de Seguridad de Materiales (MSDS). Apropiada PPE debe usar y puede variar en función del tipo y volumen de los productos químicos utilizados (por ejemplo, batas de laboratorio / batas, guantes, gafas de seguridad y de protección respiratoria deben ser usados ​​cuando se trabaja con cantidades significativas de disolventes inflamables, tóxicos, tales como acetonitrilo, y ácidos corrosivos, tales como ácidos fórmico y trifluoroacético).

1. Depósito 1 l extracto de proteína que no contiene células viables (obtenidos mediante su caso, los protocolos descritos anteriormente ^11-13) en una placa de MALDI objetivo acero inoxidable y permitir que se seque. Superposición del extracto de proteína seca con solución de matriz 1 l (α-ciano-4-hidroxi-cinámico solución de ácido), y deje que se seque.
2. Para cada biológica replicar, detectar un número apropiado de repeticiones técnica (de 5 a 20 repeticiones técnicos). Aquí, detectar 10 repeticiones técnica para cada biológica replicar y 3 repeticiones biológica were preparado.
   Nota: Se recomienda el uso de una placa de acero objetivo MALDI pulido cuando se utiliza el método de preparación de la muestra de extracción de proteínas. El uso de placas de puntería de acero de tierra puede causar la difusión y mezcla involuntaria de las diferentes muestras fuera de pocillos de muestras individuales.
3. Depósito 1 l estándar de calibrador en el plato blanco y deje que se seque. Superposición con solución de matriz 1 l y deje que se seque.
4. Depósito de solución de matriz 2 l en la placa del objetivo como un control negativo.

2. Los espectros de masas Adquisición

1. Utilice un espectrómetro de masas MALDI-TOF equipado con un láser de nitrógeno (λ = 337 nm) y operado utilizando software Bruker FlexControl.
2. Recoge cada espectro de masas en modo lineal positiva por acumulación de 500 disparos de láser en incrementos de 100 tiro. Ajuste el voltaje de la fuente de iones de 1 a 20 kV; fuente de iones 2 voltaje a 18.15 kV; y la tensión de la lente a 9.05 kV. Tenga en cuenta que estos parámetros son instrumento específic y podría requerir un ajuste en otros instrumentos para obtener resultados óptimos.
3. Ajuste el rango de masa-carga para la evaluación automatizada del espectro de 2 a 20 kDa por carga. Utilice el algoritmo de detección de pico centroide. Ajuste el umbral mínimo de resolución de 100 Da. Establecer la relación señal a ruido (S: N) umbral en 2. Establezca el umbral mínimo de intensidad a 100.

3. Base de datos de construcción

1. Diseño de base de datos
   1. Crear una nueva base de datos en BioNumerics 7.1 utilizando el "Asistente para nueva base de datos".
   2. Cree un tipo de experimento espectro, por ejemplo, Maldi, mediante los comandos del "Tipos de experimentos" del panel.
   3. Crear los niveles utilizando el "panel de diseño de base de datos". Añadir nuevos niveles utilizando el "Nivel> Añadir nuevo nivel ..." comando en el menú "Base de datos". Aquí, crear "especies" de nivel, el nivel de "réplica biológica" "y" técnica de reproducir "nivel, respectively.
2. Importación y procesamiento previo de los espectros de masa cruda
   1. Exportación de los espectros de masa cruda como archivos .txt utilizando FlexAnalysis haciendo clic en el "Exportar> Espectro de masas" comando en el menú "Archivo".
   2. Importar los espectros de masa cruda (archivos .txt) en la base de datos en el nivel de los técnicos repeticiones.
   3. Preproceso los espectros de masa cruda.
      1. Importación y volver a muestrear (utilizando un algoritmo de ajuste cuadrática).
      2. Realice una sustracción de línea de base (con un disco de rodadura con un tamaño de 50 puntos).
      3. Calcule el ruido [continua transformación Wavelet (CWT)], lisa (Kaiser ventana con un tamaño de ventana de 20 puntos y beta de 10 puntos), y llevar a cabo una segunda base de referencia resta (disco rodando con tamaño de 200 puntos).
      4. Detectar picos [CWT con un mínimo de señal a ruido (S: N) de 10].
   4. Después de preprocesamiento, guardar patrones característicos de cada espectro de masas, como las listas de pico que contienen picotamaños pico de intensidad, S: N, etc., en la base de datos.
3. Creación de los espectros de masas de material compuesto
   1. Crear espectros compuesto a partir de espectros previamente con el comando "Resumir ..." en el menú "Análisis". Elija la opción "réplica biológica" como nivel objetivo.
   2. Aquí, se combinan los espectros de masas de 10 repeticiones técnica de la misma colonia para producir un espectro de masas de material compuesto para esa colonia, resultando en tres espectros de masas de material compuesto para que aíslan en el nivel "biológica replicar".
   3. Aquí, un resumen de los tres espectros compuesto para crear un espectro compuesto para que aíslan a nivel "Especies".
      Nota: El espectro compuesto es el medio punto por punto de los técnicos repeticiones. Replica con una similitud (correlación de Pearson) con la media de inferior al 95% (ajuste predeterminado), se excluyen del compuesto. Picos en los espectros de material compuesto sólo se llaman si están presentes en el 75% (ajuste por defecto) de las réplicas incluidos. Para las réplicas biológicas, estos valores fueron 90 y 60%, respectivamente.

Análisis 4. Espectro de masas de datos

1. Seleccione las entradas de la base de datos y crear una comparación haciendo clic en el comando "Crear nueva comparación" en el "comparaciones" del panel.
2. En este caso, utilizar los espectros de masas en la "técnica de reproducir" y / o niveles "biológica replicar" para mostrar comparaciones y análisis.
3. Análisis cluster basado en la similitud y escalamiento multidimensional (MDS)
   1. Crear grupos con colores. Seleccione los tres biológica espectros de masas compuesto y haga clic en "Crear nuevo grupo de selección" comando en el menú "Grupos" para crear un grupo para el aislamiento correspondiente. Designar un color que se utiliza automáticamente para estos tres espectros de masas.
   2. Alternativamente, definir estados de campo con los colores correspondientes utilizando los comandos en el "Base de datos de entradas del panel "de tal manera que cualquier agrupación basado en este campo definido utiliza el mismo color definido para este grupo.
   3. Realizar análisis de conglomerados. Haga clic en el comando "Calcular el análisis cluster" en el menú "Clustering". En la configuración de página de comparación 1, seleccione la "correlación de Pearson" y dejar otros parámetros por defecto. En la página 2, seleccione "UPGMA". Luego haga clic en "Finalizar".
   4. Obtener una parcela MDS usando el "escalamiento multidimensional ..." comando en el menú "Estadísticas".
4. Juego Pico
   1. Haga clic en el tipo de espectro "Maldi" en el "experimentos" del panel. A continuación, seleccione "Diseño> Mostrar imagen". Los espectros se muestran como bandas de gel.
   2. Realizar juego pico con el comando "Haz coincidente pico" en el menú de "espectros".
5. Identificación de clases de pico
   1. Realizar un análisis de componentes principales (PCA). Resalta el "Maldi "tipo de experimento en el" Experimental "panel y utilizar el" Análisis de Componentes Principales ... "comando en el menú" Estadística "para realizar PCA.
   2. Realizar bidireccional agrupación. Haga clic en el "Estadísticas> minería Matrix" ... en la ventana "Comparación". La intensidad de los picos adaptados a las clases de pico se representa usando diferentes colores (mapa de calor).

5. Las bacterias de identificación con una base de datos personalizada

1. Método basado en el coeficiente de similitud
   1. Crear una comparación y generar un dendrograma basado en los espectros de masas a nivel de "réplica técnicos" como se describe en el paso 4.3.3. Guarde el dendrograma para la comparación de similitud.
   2. Seleccione un espectro de masa desconocida, y haga clic en el "Análisis> Identificar las entradas seleccionadas". Aparecerá el cuadro de diálogo de identificación.
   3. Seleccione el tipo de clasificador "en base de comparación" (o una classif almacenadaier) y haga clic en "Siguiente". En la página siguiente, elija el dendrograma guardado como una comparación de referencia y haga clic en "Siguiente".
   4. Elija la opción "similitud básica" como un método de identificación y luego haga clic en "Siguiente".
   5. Elija la opción "similitud máxima" como método de puntuación. Escriba los valores mínimos apropiados y valores mínimos de diferencia para cada parámetro y haga clic en "Siguiente".
   6. Una vez terminados los cálculos, aparecerá la ventana de identificación. En la "Resultados" del panel, se enumeran los miembros de la base de datos que mejor se adapten a lo desconocido.
   7. Guarde el proyecto de identificación y validación de la identificación mediante el comando "validación cruzada análisis" en el panel de "proyecto de identificación".
2. Método basado en el potencial biomarcador
   1. Definir las clases altas. En la ventana "Matrix Minería", seleccionar conjuntos de picos que comparten características comunes y definir estos picos como especíclases pico fic (biomarcadores potenciales) utilizando "Espectros> Administrar tipos de clase pico ..." en la "ventana de comparación".
   2. Aquí, definir clases pico específicas para cada aislamiento para todos los 15 aislamientos.
   3. Seleccionar los espectros de masas de incógnitas y combinar los picos de estos espectros a las clases Pico definido como se describe anteriormente.

Resultados

Las bases de datos construidos en esta demostración tenían cuatro niveles, de mayor a menor nivel, incluyendo "Todos los niveles", "Especies", "réplica biológica" y "técnica de reproducir", respectivamente (Figura 1). La "técnica de reproducir" nivel contenía todos los espectros preprocesado de técnicos repeticiones. El "biológica replicar" y los niveles de "especies" contenían el compuesto (resumen) espectros. "Todos los niveles" contenían todos los espectros réplica técnica, así como todos los espectr...

Discusión

Esta demostración mostró procedimientos detallados de caracterización e identificación de bacterias usando MALDI-TOF MS y una base de datos personalizada. En comparación con los métodos moleculares tradicionales, por ejemplo, los métodos de secuenciación de 16S rDNA de huellas digitales, basados ​​en MS MALDI-TOF facilitan más rápida identificación de diversas bacterias. Debido a su robustez, esta técnica se utiliza ampliamente para caracterizar las bacterias, los virus, los hongos y la levadura del medio ambiente y en ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
&alfa;-ácido ciano-4-hidroxi-cinámico	ACROS Organics		163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl software	Bruker Daltonics		versión 3.0
Bruker FlexAnalysis software	Bruker Daltonics		versión 3.0
Software bionumérico	Applied Maths		versión 7.1