Este trabajo detalla los procedimientos para la identificación rápida de bacterias utilizando MALDI-TOF MS. Los procedimientos de identificación incluyen la adquisición del espectro, la construcción de bases de datos y los análisis de seguimiento. Se presentan dos métodos de identificación, el basado en coeficientes de similitud y el método basado en biomarcadores.
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Artículo de método
El uso de MALDI-TOF espectrometría de masas y una base de datos personalizada para caracterizar bacterias indígenas a una cueva entorno único (Kartchner Cavernas, AZ, EE.UU.)
En este artículo
Resumen
Resumen
La espectrometría de masas MALDI-TOF ha demostrado ser una herramienta rápida y fiable para la identificación de bacterias en el género y la especie y, en algunos casos, a nivel de cepa. Se han desarrollado herramientas de software disponibles en el mercado y de código abierto para facilitar la identificación; Sin embargo, en la literatura no se ha descrito un canal de análisis de datos universal/estandarizado. Aquí, proporcionamos una demostración completa y detallada de los procedimientos de identificación bacteriana utilizando un espectrómetro de masas MALDI-TOF. Se recolectaron espectros de masas de 15 bacterias diversas aisladas de las cavernas de Kartchner, Arizona, EE. UU., y se identificaron mediante secuenciación de ADNr 16S. Las bases de datos se construyeron en BioNumerics 7.1. Se realizaron análisis de seguimiento de los espectros de masas, incluidos análisis de conglomerados, coincidencia de picos y análisis estadísticos. La identificación se realizó utilizando muestras codificadas a ciegas seleccionadas aleatoriamente de estas 15 bacterias. Se presentan dos métodos de identificación: el basado en coeficientes de similitud y el método basado en biomarcadores. Los resultados muestran que ambos métodos de identificación pueden identificar las bacterias a nivel de especie.
Introducción
La espectrometría de masas (MS) de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) ha demostrado ser una herramienta rápida y fiable para la identificación de bacterias en el género, la especie y, en algunos casos, los niveles de cepa1-4. MALDI-TOF MS ioniza moléculas biológicas (típicamente proteínas) que se originan en superficies celulares, membranas intracelulares y ribosomas de células enteras bacterianas o extractos de proteínas1,5. Los picos resultantes forman patrones característicos o "huellas dactilares" de las bacterias analizadas1. La identificación de las bacterias se basa en estas "huellas da....
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Protocolo
Precaución: las bacterias no identificados de cualquier entorno pueden ser patógenos y deben ser manejados con precaución el uso de protocolos de bioseguridad adecuadas. Trabaja con cultivos vivos debe realizarse en una cabina de seguridad biológica Clase II utilizando procedimientos de seguridad biológica de nivel 2 (BSL-2). Más información acerca de BSL-2 procedimientos está disponible en el manual CDC / NIH titulado, "Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos", páginas 33-38. El documento está disponible en línea en http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BM....
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Resultados
Las bases de datos construidos en esta demostración tenían cuatro niveles, de mayor a menor nivel, incluyendo "Todos los niveles", "Especies", "réplica biológica" y "técnica de reproducir", respectivamente (Figura 1). La "técnica de reproducir" nivel contenía todos los espectros preprocesado de técnicos repeticiones. El "biológica replicar" y los niveles de "especies" contenían el compuesto (resumen) espectros. "Todos los niveles" contenían todos los espectros réplica técnica, así como todos los espectr.......
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Discusión
Esta demostración mostró procedimientos detallados de caracterización e identificación de bacterias usando MALDI-TOF MS y una base de datos personalizada. En comparación con los métodos moleculares tradicionales, por ejemplo, los métodos de secuenciación de 16S rDNA de huellas digitales, basados en MS MALDI-TOF facilitan más rápida identificación de diversas bacterias. Debido a su robustez, esta técnica se utiliza ampliamente para caracterizar las bacterias, los virus, los hongos y la levadura del medio ambiente y en .......
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Divulgaciones
Los autores Vranckx y Janssens son empleados de Applied Maths NV, el fabricante del software de análisis de datos utilizado en este video. Applied Maths NV proporcionó módulos de software seleccionados destacados en este video, así como una parte de los costos de publicación asociados con este video.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el New College of Interdisciplinary Arts and Sciences de la Universidad Estatal de Arizona, Applied Maths NV, y por la National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Todas las opiniones, hallazgos y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las del autor o autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la Fundación Nacional de Ciencias.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| &alfa;-ácido ciano-4-hidroxi-cinámico | ACROS Organics | 163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8 | |
| Bruker FlexControl software | Bruker Daltonics | versión 3.0 | |
| Bruker FlexAnalysis software | Bruker Daltonics | versión 3.0 | |
| Software bionumérico | Applied Maths | versión 7.1 |
Referencias
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Siegrist, T. J., et al.
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Reimpresiones y permisos
