Describimos un protocolo para aislar y cultivar células epiteliales de amnios humano (hAECs) utilizando reactivos libres de productos animales de acuerdo con las directrices actuales de buenas prácticas de fabricación (cGMP).
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Artículo de método
El aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales Amnion Humanos para Aplicaciones clínicas
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células epiteliales de amnios humanos (hAECs) derivadas de membranas de amnios a término o pretérmino han atraído la atención de investigadores y clínicos como una fuente potencial de células para la medicina regenerativa. La razón de este interés es la evidencia de que estas células tienen una capacidad de diferenciación altamente multipotente, baja inmunogenicidad y funciones antiinflamatorias. Estas propiedades han llevado a los investigadores a investigar el potencial de las hAEC para ser utilizadas para tratar una variedad de enfermedades y trastornos en estudios preclínicos con animales con mucho éxito.
hAEC han encontrado una amplia aplicación para el tratamiento de una serie de enfermedades y trastornos. Las posibles aplicaciones clínicas de los hAEC incluyen el tratamiento del accidente cerebrovascular, la esclerosis múltiple, la enfermedad hepática, la diabetes y las enfermedades pulmonares crónicas y agudas. Pasar de los estudios preclínicos en animales a los ensayos clínicos requiere un mayor nivel de control de calidad y seguridad para los productos de terapia celular. Por consideraciones de seguridad y control de calidad, es preferible que los protocolos de aislamiento celular utilicen reactivos libres de productos animales.
Hemos desarrollado protocolos para permitir a los investigadores aislar, criopreservar y cultivar hAECs utilizando reactivos libres de productos animales. La ventaja de este método es que estas células pueden aislarse, caracterizarse, criopreservarse y cultivarse sin el riesgo de entregar patógenos animales potencialmente dañinos a los humanos, al tiempo que se mantienen los rendimientos celulares, la viabilidad y el potencial de crecimiento adecuados. Para los investigadores que pasan de los estudios preclínicos en animales a los ensayos clínicos, estas metodologías acelerarán en gran medida la aprobación regulatoria, disminuirán los riesgos y mejorarán la calidad de su población de células terapéuticas.
Introducción
Las células derivadas de fuentes perinatales, como la placenta, membranas de la placenta, el cordón umbilical y el líquido amniótico han atraído la atención de investigadores y clínicos como una fuente potencial de células para la medicina regenerativa 1,2. La razón de este interés es que todos estos tipos de células poseen un cierto grado de plasticidad y capacidad inmunomoduladora 3, propiedades que son fundamentales para sus aplicaciones terapéuticas potenciales.
HAECs son una población heterogénea epitelial que se puede derivar de plazo o pre-término membrana amnios 4, proporcionando una abundante fuen....
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Protocolo
NOTA: placentario debe recogerse de embarazos saludables simples, con una preferencia por las cesáreas electivas plazo. Escrito, el consentimiento informado debe darse para la recogida de su placenta. Su comité de ética de investigación en humanos pertinentes deberían homologación toda la colección y el uso de tejidos humanos.
1. Aislamiento de células epiteliales Amnion
- Coloque la placenta sobre una superficie estéril dentro de una cabina de seguridad biológica de clase II.
- Uso de madejas estériles solución salina equilibrada (HBSS), lavar tanta sangre como sea posible de la superficie de p....
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Resultados
Cuando este procedimiento se sigue correctamente, se debe esperar un rendimiento promedio de 120 millones de HAECs, con un rango típico de 80 hasta 160 millones de células. A partir de estos rendimientos, una viabilidad media de 83 ± 4% se puede esperar. El aumento de rendimiento medio y la viabilidad ligeramente inferior en el método clínico puede ser debido a la mayor actividad de la tripsina que el producto derivado de un animal, y quizás también debido a la falta de proteínas séricas. HAECs aisladas tienen un perfil.......
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Discusión
Hay varios parámetros críticos que pueden tener un impacto significativo en el éxito de esta metodología. El almacenamiento de la placenta o el amnios para hasta 3 horas antes del aislamiento de HAECs puede ser deseable para fines logísticos o de programación, sin embargo se recomienda que el tejido se procesa tan pronto como sea posible. Si el tejido se va a almacenar, se recomienda que se realice el almacenamiento después de la disección y el lavado de la membrana amnios. Amnion se puede almacenar en HBSS que contiene.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen el apoyo financiero del Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno de Victoria.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de Colección | |||
| de pelado | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Pinza de vendaje Liberty, puntiaguda 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Tijeras - Afiladas/Romas Rectas | Fisher Scientific NC0562592 | ||
| Guantes de látex estériles | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Ropa | |||
| Ropa de protección (bata) | U-line | S-15374-M | |
| Batas de aislamiento | U-line | S-15374-M | |
| Guantes de látex estériles | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| mascarilla de uso general | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Fundas para zapatos | U-line | S-7873W | |
| Medios y reactivos | |||
| Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | sin calcio ni magnesio |
| TrypZean (producto animal– tripsina recombinante libre) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Inhibidor de la tripsina de soja 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Reactivo de azul de tripano | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotipo control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-control de isotipo | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| control de isotipo APC | BD Pharmingen | 340754 | |
| Colágeno Tipo VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumibles | |||
| Pipeta graduada de 50 ml | BD/Falcon | 356550 | |
| Pipeta graduada de 10 ml | BD/Falcon | 356551 | |
| Pipeta graduada de 5 ml | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml tubos de halcón | BD/Falcon | 352070 | |
| Tubos de halcón de 15 ml | BD/Falcon | 352096 | |
| Placas de Petri de 15 cm | Corning | 351058 | |
| 70 μ m filtros | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μ m filtros | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Puntas de pipeta | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μ l Puntas de pipeta | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Jeringa | BD/Medical | 309661 | |
| Espátula de plástico | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Barco de pesaje de plástico | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Viales criogénicos | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Gabinete |
Referencias
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med.
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Reimpresiones y permisos
