Para analizar los perfiles de expresión de genes cardiacos durante el desarrollo del corazón del pez cebra, el ARN total tiene que ser extraído de corazones aislados. A continuación, presentamos un protocolo de recogida funcionales corazones / batiendo por disección manual de rápida a partir de embriones de pez cebra para obtener ARNm específico del corazón.
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Artículo de método
A gran escala de pez cebra embrionario del corazón Disección de Análisis transcripcional
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Resumen
Resumen
El corazón embrionario de pez cebra se compone de sólo unos pocos cientos de células, lo que representa sólo una pequeña fracción de todo el embrión. Por lo tanto, para evitar que el transcriptoma cardiaca de ser enmascarada por el transcriptoma embrionario global, es necesario reunir un número suficiente de corazones para nuevos análisis. Además, como el desarrollo cardiaco pez cebra procede rápidamente, colección del corazón y los métodos de extracción de ARN tienen que ser rápida a fin de asegurar la homogeneidad de las muestras. A continuación, presentamos un protocolo rápido disección manual para recopilar funcionales corazones / golpeando a partir de embriones de pez cebra. Este es un requisito esencial para la posterior extracción de RNA específica del corazón para determinar los niveles de expresión de genes cardiacos específicos por análisis del transcriptoma, tales como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). El método se basa en propiedades adhesivas diferenciales del corazón embrionario de pez cebra en comparación con otros tejidos; esto permite la rápida physeparación de SICAL cardiaca a partir de tejido extracardíaca por una combinación de fuerza de cizallamiento de fluido interrupción, filtración por etapas y la recogida manual de los corazones transgénicos marcados con fluorescencia.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio) es ampliamente utilizado en biología del desarrollo para estudiar la organogénesis in vivo debido a su desarrollo embrionario rápido, transparente y extrauterino, combinado con el pequeño tamaño y la disponibilidad de líneas reportero transgénicas con expresión específica de tejido de proteínas fluorescentes. Este pequeño vertebrado es especialmente adecuado para estudiar el desarrollo del corazón debido a la oxigenación de los primeros embriones de pez cebra no se basa en los latidos del corazón y el flujo sanguíneo; estas características han permitido la caracterización de un gran número de mutantes cardiovasculares
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Protocolo
Este protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de la ley alemana y el estado de Berlín; manejo del pez cebra fue supervisado por la autoridad local para la protección de animales (LaGeSo, Berlin-Brandenburg).
1. La obtención de embriones de pez cebra para el Corazón de Extracción
- Cross pez cebra reportero cardiaca tales como la Tg (myl7: EGFP) twu34 línea transgénica 9 con el fin de obtener embriones con la expresión específica de GFP-corazón.
- Mantener los embriones en el agua de huevo a 28,5 ° C hasta la etapa embrionaria deseada 10,11. Asegúrese de que la población d....
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Resultados
A continuación, describimos un representante experimento disección cardíaco usando el Tg pez cebra (myl7: GFP) twu34 línea transgénica 9, que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) exclusivamente dentro del miocardio (Fig. 1). Se recogieron tanto los corazones disecados y los embriones a partir de los cuales se derivaron para evaluar la pureza de la muestra del corazón. En pocas palabras, homocigotos Tg (myl7: GFP) pez cebra twu34 9 se outcrossed con el t.......
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Discusión
Este protocolo permite el rápido enriquecimiento de tejido del corazón embrionario de pez cebra para la expresión génica análisis. La cantidad y la calidad de la muestra específica cardiaca ARN depende en gran medida de unos pocos pasos cruciales: en primer lugar, la cantidad de la muestra se mejora en gran medida si la pérdida de corazones se impide a cada paso del protocolo, ya que la purificación del ARN sólo funcionará con suficiente material de partida. En segundo lugar, la pureza de la muestra, que depende totalme.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a C. Burns, C. McRae por esbozar el principio básico de este protocolo de purificación, y a F. Priller por la implementación inicial de este método en nuestro laboratorio. S.A.-S. cuenta con el apoyo de una cátedra Heisenberg de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Este trabajo fue apoyado por la subvención DFG SE2016/7-1.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo para la cría de peces y la recolección de huevos | consulte el Pez cebra Libro11 para más detalles | ||
| Microscopio | |||
| estereoscópico de fluorescencia Microcentrífuga | |||
| Espectrofotómetro | UVp. ej. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| de electroforesis de ácidos nucleicosPlacas de Petri de 4 cm Ø, recubiertas con 1% de agarosa en medio | |||
| Micropipetas y puntas (P20, P100, P1000) | |||
| Tubos de centrifugación de 1,5 ml Tubos | |||
| centrifugación de 15 ml y 50 ml | |||
| Dumont #5ExactaCruz&comercio; Puntas de carga de gel redondas en estante estéril, 1-200μ l | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μ m filtro (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μ m filtro (Filtros de pre-separación-30 y micro; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Gel de bloqueo de fase, pesado, tubos de 1,5 ml | Prime | 2302810 | |
| Huevo agua medio | 60 μ g/ml Sales marinas oceánicas instantáneas en ddH2O, 0,00001% (p/v) de azul de metileno | ||
| E3 medio | 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 | ||
| Tricaína (3-aminoácidos ácido benzoicoetílico) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Solución madre de tricaína, pH 7 |
| 1% agarosa (en medio E3) | |||
| 1% gel de agarosa (en tampón TBE) | |||
| Leibovitz&agudo; s L-15 medio | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Suero fetal bovino) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µ g/µ l en agua libre de RNasa |
| cloroformo | |||
| isopropanol | |||
| 75% etanol (en DEPC-ddH2O) | |||
| Agua libre de nucleasa o DDH2O | |||
| Tampón | |||
| Tampón TBE (Tris/Borato/EDTA) para electroforesis |
Referencias
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular ....
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