Para analizar los perfiles de expresión de genes cardiacos durante el desarrollo del corazón del pez cebra, el ARN total tiene que ser extraído de corazones aislados. A continuación, presentamos un protocolo de recogida funcionales corazones / batiendo por disección manual de rápida a partir de embriones de pez cebra para obtener ARNm específico del corazón.
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Artículo de método
A gran escala de pez cebra embrionario del corazón Disección de Análisis transcripcional
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Resumen
Resumen
El corazón embrionario de pez cebra se compone de sólo unos pocos cientos de células, lo que representa sólo una pequeña fracción de todo el embrión. Por lo tanto, para evitar que el transcriptoma cardiaca de ser enmascarada por el transcriptoma embrionario global, es necesario reunir un número suficiente de corazones para nuevos análisis. Además, como el desarrollo cardiaco pez cebra procede rápidamente, colección del corazón y los métodos de extracción de ARN tienen que ser rápida a fin de asegurar la homogeneidad de las muestras. A continuación, presentamos un protocolo rápido disección manual para recopilar funcionales corazones / golpeando a partir de embriones de pez cebra. Este es un requisito esencial para la posterior extracción de RNA específica del corazón para determinar los niveles de expresión de genes cardiacos específicos por análisis del transcriptoma, tales como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). El método se basa en propiedades adhesivas diferenciales del corazón embrionario de pez cebra en comparación con otros tejidos; esto permite la rápida physeparación de SICAL cardiaca a partir de tejido extracardíaca por una combinación de fuerza de cizallamiento de fluido interrupción, filtración por etapas y la recogida manual de los corazones transgénicos marcados con fluorescencia.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio) es ampliamente utilizado en biología del desarrollo para estudiar la organogénesis in vivo debido a su desarrollo embrionario rápido, transparente y extrauterino, combinado con el pequeño tamaño y la disponibilidad de líneas reportero transgénicas con expresión específica de tejido de proteínas fluorescentes. Este pequeño vertebrado es especialmente adecuado para estudiar el desarrollo del corazón debido a la oxigenación de los primeros embriones de pez cebra no se basa en los latidos del corazón y el flujo sanguíneo; estas características han permitido la caracterización de un gran número de mutantes cardiovasculares 1,2 y el pez cebra es ahora un organismo modelo ampliamente reconocido para estudiar enfermedades del corazón 3.
Para el estudio de la expresión génica durante el desarrollo embrionario, las transcripciones son comúnmente analizados por todo el montaje hibridación in situ (DESEOS) 4, RT-qPCR 5, 6, microarrays o secuenciación de próxima generación (RNA-Seq) 7. MientrasDESEO permite un análisis espacio-temporal de la expresión génica dentro de todo el embrión, los niveles de transcripción suelen ser evaluada por RT-qPCR, microarrays o enfoques de RNA-Seq. Sin embargo, estos métodos requieren el enriquecimiento de tejido para perfiles de expresión génica específica.
Puesto que el corazón embrionario de pez cebra representa una pequeña fracción de todo el embrión, los estudios transcriptoma durante el desarrollo cardiaco requieren un protocolo para la disección y el enriquecimiento de los corazones. Además, para obtener datos fisiológicamente relevantes, es importante mantener el tejido cardíaco totalmente funcional hasta la extracción de ARN. Aquí se describe un protocolo para aislar rápidamente fisiológicamente normal y el corazón palpitante de cientos de embriones de pez cebra para obtener de manera eficiente las muestras de ARN de alta calidad para análisis posteriores. El presente método se basa en el protocolo reportado por Burns y MacRae, 2006 8. Para el enriquecimiento del tejido cardiaco, ambos métodos utilizan una línea reportero infarto transgénicoy tomar ventaja de las propiedades de adherencia diferencial de los corazones de embriones de pez cebra en comparación con otros tejidos. En pocas palabras, con la pipeta muchos embriones arriba y abajo a través de una punta de pipeta estrecho, corazones son liberados al mismo tiempo de los órganos embrionarios y posteriormente separados de escombros embrionaria en dos etapas de filtración rápida; entonces los corazones etiqueta fluorescente se ordenan de forma manual desde la basura y los recogen para su posterior procesamiento.
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Protocolo
Este protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de la ley alemana y el estado de Berlín; manejo del pez cebra fue supervisado por la autoridad local para la protección de animales (LaGeSo, Berlin-Brandenburg).
1. La obtención de embriones de pez cebra para el Corazón de Extracción
- Cross pez cebra reportero cardiaca tales como la Tg (myl7: EGFP) twu34 línea transgénica 9 con el fin de obtener embriones con la expresión específica de GFP-corazón.
- Mantener los embriones en el agua de huevo a 28,5 ° C hasta la etapa embrionaria deseada 10,11. Asegúrese de que la población de embriones recogidos es homogénea tanto genética como por la etapa de desarrollo para limitar las variaciones en la expresión génica.
- Dechorionate los embriones manualmente.
2. Disección de pez cebra embrionarias Corazones
NOTA: Mantenga todas las soluciones en hielo. Si es posible, hacer el trabajo en equipo: una persona disecciona los corazones de la embryos mientras que otra persona ordena los corazones bajo el microscopio estereoscópico de fluorescencia. Esto permite que el procesamiento de varios cientos de embriones en unas pocas horas.
- Transferir unos 100 embriones en un tubo de 1,5 ml centrifugación. Anestesiar a los embriones con tricaína (0,16 mg / ml en medio de E3). Proceda una vez que los embriones son claramente anestesiados (que no nadan y los sedimentos en el fondo del tubo, pero sus corazones siguen latiendo).
- Eliminar la solución / E3 tricaína y lavar los embriones una vez con 1 ml L-15/10% de medio FBS y mantener en hielo.
NOTA: El medio FBS L-15/10% es importante para mantener los órganos y células vivas durante todo el procedimiento de disección hasta que los corazones se han transferido en RNAlater o Trizol. - Añadir 1 ml de L-15/10% de medio FBS a los embriones y la pipeta hacia arriba y abajo 5-8 veces con una Ronda Gel Cargando Consejo hasta que la yema esté completamente interrumpido. Pipeta los embriones gota a gota sobre la superficie de la solución, por lo que la caída va a estallar ylos embriones se rompen suavemente.
NOTA: Cómo vigorosamente y con qué frecuencia los embriones tienen que ser pipeta hacia arriba y abajo depende de la etapa de desarrollo de los embriones, se necesita decir más pipeteo en fases avanzadas (por ejemplo, a 56 HPF). - Para el primer lote de embriones disecados, evaluar la integridad de los embriones y la proporción de corazones disecados bajo un microscopio estereoscópico, ya que algunos corazones pueden permanecer unidos a los embriones si pipeteada demasiado suavemente. Ajuste el modo de pipeteo para las próximas rondas de disección en consecuencia.
NOTA: Utilice puntas de pipeta de retención baja y tubos de microcentrífuga para minimizar los corazones que se pegan al plástico. - Aplicar la muestra sobre un filtro de 100 micras colocado en un tubo de centrifugación de 50 ml; enjuagar el tubo de 1,5 ml con 1 ml de medio L-15/10% de FBS y luego aplicar esto a el filtro con el fin de minimizar la pérdida de la muestra (algunos corazones pueden estar pegadas a las paredes del tubo). Lavar el filtro dos veces con 1 ml L-15 / 10% de FBS. En este paso los corazones pasan a través del filtro y se recogen en el tubo de 50 ml.
- Aplicar el flujo a través sobre un filtro de 30 micras colocado sobre un tubo de centrifugación de 15 ml y enjuagar el filtro una vez con 1 ml L-15/10% de medio FBS. En esta segunda etapa de filtración, los corazones se retienen en el filtro y los residuos más pequeño se lava.
- Girar el filtro al revés y vaciar los corazones en el filtro en un agarosa recubiertas de placa de Petri 1% mediante la aplicación de tres lavados consecutivos con 1 ml de L-15/10% de FBS.
- Separar manualmente corazones GFP-positivas a partir de los restos de embriones no fluorescente (por ejemplo, lentes de ojo) con un par de pinzas bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia y se concentran en el centro del plato. Colecciónalos según la etapa 3.
NOTA: Si los embriones son mayores de 24 HPF, los corazones deben latir, lo que indica que los tejidos están todavía fisiológicamente normal.
3. Aislamiento de ARNm de disecciónted Corazones
- Recoge los corazones en el menor volumen posible (por ejemplo, 10 l) y pipeta en un tubo de 1,5 ml contiene 0,75 ml RNAlater (en hielo). Verifique que no haya corazones permanecen en la punta de la pipeta viéndolo bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia.
- Alternativamente, si una campana química está disponible en la vecindad inmediata del microscopio de fluorescencia, la transferencia de los corazones recogidos en Trizol (PRECAUCIÓN) bajo el capó química. Esto evita la posible pérdida de corazones de fricción en la punta de pipeta y también durante la centrifugación de los corazones (pasos 3.4, 3.5 y 3.7). Reúnase el corazón de varios ciclos de aislamiento en el mismo tubo con Trizol y vaya directamente al paso 3.8; el volumen final no debe superar el 10% del volumen original Trizol.
NOTA: Lea la Hoja de Seguridad Trizol (MSDS) antes de usar. Maneje reactivo Trizol bajo una campana y el desgaste recomendado Equipo de Protección Personal. Evite el contacto con la piel, ojos y clothing. Retirar todas las fuentes de ignición. - Agrupar los corazones de varias rondas de aislamiento en el mismo tubo con RNAlater (en hielo), como la eficiencia de aislamiento de ARN mejora con la cantidad de tejido recogido. Si el volumen total de la muestra supera el 10% del volumen RNAlater original, utilizar un tubo adicional con 0,75 ml RNAlater para el almacenamiento (en hielo).
- Centrifugar las muestras a 15.700 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar los corazones.
- Bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia, recoger cuidadosamente tanto sobrenadante como sea posible en un 1% de agarosa-placa de Petri recubierta que contiene 3 ml L-15/10% de medio FBS, pero no molestar los corazones sedimentadas en el fondo del tubo de centrifugación. Dado que hasta 15% de los corazones puede permanecer en el sobrenadante debido a la alta viscosidad de RNAlater, recuperarlos como se describe en el paso 3.7.
- Bajo una campana química, añadir 0,5 ml de Trizol al tubo que contiene los corazones sedimentadas y mantener en hielo.
- Bajo el microsco fluorescentepe, transferir los corazones (del paso 3.5) del plato de agarosa recubiertas de 1% FBS que contiene la solución RNAlater / L-15/10% en otro plato de agarosa recubiertas de 1% con 3 ml L-15/10% FBS para diluir el RNAlater. Recoge los corazones en el centro de la placa de Petri y transferirlos en un pequeño volumen en el tubo de corazones sedimentadas en Trizol bajo una campana química.
- Vortex el tubo de 1,5 ml que contiene los corazones en Trizol para interrumpir los corazones e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Bajo una campana química, añadir 100 l de cloroformo (ATENCIÓN), mezclar bien y pasar la solución / cloroformo Trizol en un 1,5 ml tubo de pre-hilado PLG (centrífuga 30 segundos a velocidad máxima antes de su uso). Incubar durante 3 min a temperatura ambiente.
NOTA: Lea las MSDS cloroformo antes de su uso. Maneje reactivo cloroformo bajo una campana y el desgaste recomendado Equipo de Protección Personal. Evite el contacto con la piel, ojos y ropa. Mantener alejado de materiales incompatibles tales como los metales, los álcalis. - Centrifuge la muestra a 15.700 xg durante 15 min a 4 ° C y transferir la fase acuosa a un nuevo tubo de 1,5 ml.
- Añadir 5-10 g de glucógeno y 250 l preenfriados (a -20 ° C) isopropanol; mezclar bien e incubar durante la noche a -20 ° C.
- Centrifugar la muestra a 15.700 xg durante 30 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
- Lavar el sedimento con 1 ml de etanol 75%, se centrifuga a 15.700 xg durante 15 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
- Se deja evaporar el etanol mediante secado de la pastilla a temperatura ambiente hasta que se convierte en blanco (por ejemplo, durante 10-15 min).
- Añadir 20 l RNasa libre de ddH 2 O al sedimento y se incuba durante 10-15 min a 55 ° C para disolver el ARN; a continuación, mantener en hielo.
- Evaluar la concentración de ARN y la pureza por medición de la absorbancia. Evaluar la integridad del ARN mediante la ejecución de la muestra en un gel de agarosa al 1%.
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Resultados
A continuación, describimos un representante experimento disección cardíaco usando el Tg pez cebra (myl7: GFP) twu34 línea transgénica 9, que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) exclusivamente dentro del miocardio (Fig. 1). Se recogieron tanto los corazones disecados y los embriones a partir de los cuales se derivaron para evaluar la pureza de la muestra del corazón. En pocas palabras, homocigotos Tg (myl7: GFP) pez cebra twu34 9 se outcrossed con el t...
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Discusión
Este protocolo permite el rápido enriquecimiento de tejido del corazón embrionario de pez cebra para la expresión génica análisis. La cantidad y la calidad de la muestra específica cardiaca ARN depende en gran medida de unos pocos pasos cruciales: en primer lugar, la cantidad de la muestra se mejora en gran medida si la pérdida de corazones se impide a cada paso del protocolo, ya que la purificación del ARN sólo funcionará con suficiente material de partida. En segundo lugar, la pureza de la muestra, que depende totalme...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a C. Burns, C. McRae por esbozar el principio básico de este protocolo de purificación, y a F. Priller por la implementación inicial de este método en nuestro laboratorio. S.A.-S. cuenta con el apoyo de una cátedra Heisenberg de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Este trabajo fue apoyado por la subvención DFG SE2016/7-1.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo para la cría de peces y la recolección de huevos | consulte el Pez cebra Libro11 para más detalles | ||
| Microscopio | |||
| estereoscópico de fluorescencia Microcentrífuga | |||
| Espectrofotómetro | UVp. ej. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| de electroforesis de ácidos nucleicosPlacas de Petri de 4 cm Ø, recubiertas con 1% de agarosa en medio | |||
| Micropipetas y puntas (P20, P100, P1000) | |||
| Tubos de centrifugación de 1,5 ml Tubos | |||
| centrifugación de 15 ml y 50 ml | |||
| Dumont #5ExactaCruz&comercio; Puntas de carga de gel redondas en estante estéril, 1-200μ l | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μ m filtro (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μ m filtro (Filtros de pre-separación-30 y micro; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Gel de bloqueo de fase, pesado, tubos de 1,5 ml | Prime | 2302810 | |
| Huevo agua medio | 60 μ g/ml Sales marinas oceánicas instantáneas en ddH2O, 0,00001% (p/v) de azul de metileno | ||
| E3 medio | 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 | ||
| Tricaína (3-aminoácidos ácido benzoicoetílico) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Solución madre de tricaína, pH 7 |
| 1% agarosa (en medio E3) | |||
| 1% gel de agarosa (en tampón TBE) | |||
| Leibovitz&agudo; s L-15 medio | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Suero fetal bovino) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µ g/µ l en agua libre de RNasa |
| cloroformo | |||
| isopropanol | |||
| 75% etanol (en DEPC-ddH2O) | |||
| Agua libre de nucleasa o DDH2O | |||
| Tampón | |||
| Tampón TBE (Tris/Borato/EDTA) para electroforesis |
Referencias
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