La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Resumen

El cribado de matrices de péptidos es un ensayo de alto rendimiento para identificar los sitios de interacción proteína-proteína. Esto permite mapear múltiples interacciones de una proteína diana y puede servir como método para identificar sitios para inhibidores que se dirigen a una proteína. Aquí describimos un protocolo para el cribado y análisis de matrices de péptidos.

Resumen

Interacciones proteína-proteína median la mayoría de los procesos en la célula y el control vivir homeostasis del organismo. Interacciones de proteínas con deficiencias pueden dar lugar a la enfermedad, por lo que las interacciones proteína objetivos importantes de drogas. Es por lo tanto muy importante entender estas interacciones a nivel molecular. Interacciones de proteínas se estudiaron usando una variedad de técnicas que van desde ensayos celulares y bioquímicos a ensayos biofísicos cuantitativos, y estos se pueden realizar ya sea con proteínas de longitud completa, con dominios de proteínas o con péptidos. Los péptidos sirven como excelentes herramientas para estudiar las interacciones de proteína ya que los péptidos pueden ser sintetizados fácilmente y permitir que el centrarse en los sitios específicos de interacción. Arrays de péptidos permiten la identificación de los sitios de interacción entre dos proteínas, así como la detección de los péptidos que se unen a la proteína diana con fines terapéuticos. También permiten alto rendimiento estudios SAR. Para la identificación de sitios de unión, un tipificaCal matriz péptido por lo general contiene en parte superpuestos 10-20 residuos de péptidos derivados de las secuencias completas de una o más proteínas asociadas de la proteína diana deseada. La detección de la matriz para la unión de la proteína diana revela los péptidos de unión, que corresponden a los sitios de unión en las proteínas asociadas, en un método fácil y rápido usando sólo una pequeña cantidad de proteína.

En este artículo se describe un protocolo para la detección de arrays de péptidos para el mapeo de los sitios de interacción entre una proteína diana y sus socios. La matriz de péptido está diseñado sobre la base de las secuencias de las proteínas asociadas, teniendo en cuenta sus estructuras secundarias. Las matrices utilizadas en este protocolo fueron Celluspots matrices preparadas por Intavis Bioanalíticos Instruments. La matriz está bloqueado para evitar la unión no específica y después se incubaron con la proteína estudiada. Detección usando un anticuerpo revela los péptidos de unión correspondientes a los sitios específicos de interacción entre las proteínas.

Introducción

Interacciones proteína-proteína median la mayoría de los procesos en la célula viva. Interacciones de proteínas con deficiencias pueden dar lugar a la enfermedad, por lo que las interacciones proteína objetivos importantes de drogas. Es por lo tanto muy importante entender estas interacciones a nivel molecular. Interacciones de proteínas se estudiaron usando una variedad de técnicas que van desde ensayos celulares y bioquímicos a ensayos biofísicos cuantitativos, y estos se pueden realizar ya sea con proteínas de longitud completa, con dominios de proteínas o con péptidos. Los péptidos sirven como excelentes herramientas para estudiar las interacciones proteína. Esto....

Protocolo

1. Diseño de una matriz de péptidos

1. Divida la secuencia de la proteína diana en parte, la superposición de 10-20 residuos de péptidos. Variar la cantidad de solapamiento en el experimento específico y los recursos del laboratorio que realiza, pero, en principio, cuanto mayor sea el solapamiento mejor. En el diseño de los péptidos tienen en cuenta los conocidos elementos de estructura secundaria de la proteína que pueden ser responsables de la interacción.
2. Ordene la matriz péptido diseñado a través de proveedores comerciales. Aquí, el uso de péptidos unidos covalentemente a la matriz a través de la C-terminal.

2. E....

Resultados

STIL es una proteína centrosomal altamente importante. Controla la división celular normal y la proliferación celular ^{13,15 - 19.} STIL interactúa con varias proteínas ^18,20,21, y la mayoría de las interacciones ocurren a través de su parte central, que es una región intrínsecamente desordenados (IDR) ^14. Hemos diseñado una matriz compuesta de péptidos derivados de la proteína de unión STIL CHFR. CHFR es un supresor de tumor que se induce en respuesta a estrés mitótico ^22. Dado.......

Discusión

Detección matriz péptido es una excelente herramienta para la identificación de los puntos de unión de una proteína diana en sus socios. Este ensayo es rápido y fácil de realizar y los resultados se pueden obtener en uno o dos días hábiles. Screening matriz péptido es versátil y se puede utilizar para muchos propósitos. Se puede utilizar para la caracterización de modificaciones posterior a la traducción tales como la fosforilación y la identificación de sustratos de quinasas. Por ejemplo: la quinasa FLT3, que está rela.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matriz de péptidos	INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe Anticuerpo (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit	Industrias biológicas	20-500-120
Leche descremada	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 camera	Película

FUJI