La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Resumen

El cribado de matrices de péptidos es un ensayo de alto rendimiento para identificar los sitios de interacción proteína-proteína. Esto permite mapear múltiples interacciones de una proteína diana y puede servir como método para identificar sitios para inhibidores que se dirigen a una proteína. Aquí describimos un protocolo para el cribado y análisis de matrices de péptidos.

Resumen

Interacciones proteína-proteína median la mayoría de los procesos en la célula y el control vivir homeostasis del organismo. Interacciones de proteínas con deficiencias pueden dar lugar a la enfermedad, por lo que las interacciones proteína objetivos importantes de drogas. Es por lo tanto muy importante entender estas interacciones a nivel molecular. Interacciones de proteínas se estudiaron usando una variedad de técnicas que van desde ensayos celulares y bioquímicos a ensayos biofísicos cuantitativos, y estos se pueden realizar ya sea con proteínas de longitud completa, con dominios de proteínas o con péptidos. Los péptidos sirven como excelentes herramientas para estudiar las interacciones de proteína ya que los péptidos pueden ser sintetizados fácilmente y permitir que el centrarse en los sitios específicos de interacción. Arrays de péptidos permiten la identificación de los sitios de interacción entre dos proteínas, así como la detección de los péptidos que se unen a la proteína diana con fines terapéuticos. También permiten alto rendimiento estudios SAR. Para la identificación de sitios de unión, un tipificaCal matriz péptido por lo general contiene en parte superpuestos 10-20 residuos de péptidos derivados de las secuencias completas de una o más proteínas asociadas de la proteína diana deseada. La detección de la matriz para la unión de la proteína diana revela los péptidos de unión, que corresponden a los sitios de unión en las proteínas asociadas, en un método fácil y rápido usando sólo una pequeña cantidad de proteína.

En este artículo se describe un protocolo para la detección de arrays de péptidos para el mapeo de los sitios de interacción entre una proteína diana y sus socios. La matriz de péptido está diseñado sobre la base de las secuencias de las proteínas asociadas, teniendo en cuenta sus estructuras secundarias. Las matrices utilizadas en este protocolo fueron Celluspots matrices preparadas por Intavis Bioanalíticos Instruments. La matriz está bloqueado para evitar la unión no específica y después se incubaron con la proteína estudiada. Detección usando un anticuerpo revela los péptidos de unión correspondientes a los sitios específicos de interacción entre las proteínas.

Introducción

Interacciones proteína-proteína median la mayoría de los procesos en la célula viva. Interacciones de proteínas con deficiencias pueden dar lugar a la enfermedad, por lo que las interacciones proteína objetivos importantes de drogas. Es por lo tanto muy importante entender estas interacciones a nivel molecular. Interacciones de proteínas se estudiaron usando una variedad de técnicas que van desde ensayos celulares y bioquímicos a ensayos biofísicos cuantitativos, y estos se pueden realizar ya sea con proteínas de longitud completa, con dominios de proteínas o con péptidos. Los péptidos sirven como excelentes herramientas para estudiar las interacciones proteína. Esto es porque los péptidos pueden ser sintetizados fácilmente y permiten que el centrarse en un sitio de interacción específica por un lado y en múltiples dianas proteicas en un alto rendimiento en el otro lado ^1,2. Screening matriz péptido es un rápido, fácil de realizar método para obtener una gran cantidad de datos acerca de las interacciones de una proteína diana con numerosos asociados en un corto período de tiempo ³. A diferencia de otros métodos bioquímicos o biofísicos para detectar y analizar interacciones proteína-proteína, péptido matriz de cribado requiere una concentración muy baja de proteína y puede detectar una unión muy débil. Arrays de péptidos pueden utilizarse para muchas aplicaciones en las interacciones proteína-péptido como el mapeo de la proteína-proteína o sitios de interacción receptor-ligando ^4, interfaces de homo o hetero-oligomerización, los anticuerpos que caracterizan epítopos ^5, el estudio de las actividades enzimáticas ⁶ y de alto rendimiento estructura- relación actividad (SAR) estudia ^7. Para una revisión en profundidad acerca de la detección matriz péptido ver Katz et al. ⁴

Actualmente, existen diversos tipos de matrices de péptidos. Hay dos principales estrategias sintéticas para la fabricación de matrices de péptidos: síntesis de los péptidos antes de adjuntarlos al soporte sólido, o síntesis de péptidos directamente sobre el soporte sólido, principalmente utilizando la técnica de ^4,8 SPOT. Lalos péptidos se sintetizan en el soporte sólido por lo general por 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) química ^8. Entre los esquemas sintéticos comunes son el apego péptido a través del extremo N-terminal (por ejemplo, JPT matrices Pepstar ⁹⁾ y el apego péptido a través de la terminal C (por ejemplo, PEPSCAN matrices pepchip ^10, JPT matrices pepspot ⁹ y Intavis matrices celluspot ^{11) 4.} El soporte sólido puede variar y también lo hace la química del acoplamiento de péptidos a la misma. Péptidos terminados en Cys pueden estar unidos a portaobjetos de vidrio a través del grupo tiol ^12. El terminal N de un péptido puede estar unido covalentemente a un grupo hidroxilo en la membrana de celulosa a través de esterificación del ácido amino unido ^8.

Aquí presentamos un protocolo detallado para el cribado de arrays de péptidos como un método para el estudio de interacciones proteína-proteína. La matriz que utilizamos es la matriz Celluspots, que es un micro-array que contiene gran amount de manchas (duplicados de hasta 384 puntos) sobre una membrana de celulosa pequeña apoyados por un portaobjetos de vidrio. Esto permite trabajar con bajos volúmenes de proteína y anticuerpos y la obtención de cantidad significativa de datos por solo experimento. Esta matriz también contiene péptidos de alta densidad que permite la detección de baja afinidad de unión. La matriz se utilizó para el mapeo de la interacción STIL-CHFR, que es altamente importante para el control de la proliferación celular normal ^13. Interacción incontrolada entre las dos proteínas puede conducir al desarrollo de cáncer. Mediante la cartografía de esta interacción se encontró el sitio de unión específico y residuos ¹⁴ de unión. Esto allana el camino para el diseño de inhibidores racionales que inhiben esta interacción proteína-proteína.

Protocolo

1. Diseño de una matriz de péptidos

1. Divida la secuencia de la proteína diana en parte, la superposición de 10-20 residuos de péptidos. Variar la cantidad de solapamiento en el experimento específico y los recursos del laboratorio que realiza, pero, en principio, cuanto mayor sea el solapamiento mejor. En el diseño de los péptidos tienen en cuenta los conocidos elementos de estructura secundaria de la proteína que pueden ser responsables de la interacción.
2. Ordene la matriz péptido diseñado a través de proveedores comerciales. Aquí, el uso de péptidos unidos covalentemente a la matriz a través de la C-terminal.

2. El bloqueo de la unión no específica

1. Hacer una solución tampón de Tris 50 mM o fosfato que contiene 0,05% de Tween 20 (TBST / PBST) y ajustar al pH deseado con una cantidad medida de HCl o NaOH (con el fin de conocer la fuerza iónica precisa) y la fuerza iónica deseada con NaCl . Aquí, utilizar un pH de 7,5 y una fuerza iónica de 150 mM.
2. Haga una solución de bloqueo de2.5% (w / v) de leche desnatada en polvo en TBST / PBST.
3. Para evitar la unión no específica, sumerja la matriz en 5 ml de solución de bloqueo. Incubar la matriz durante 2-4 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ºC en un agitador.

3. La incubación con la proteína

1. Lavar la matriz primero con 5 ml de solución de bloqueo durante 30 seg y luego dos veces con 5 ml de TBST / PBST durante 5 min en un agitador a temperatura ambiente.
2. Incubar la matriz se lavó con 5 ml de marcado con his solución de proteína que contiene 2,5% (w / v) leche desnatada en polvo para evitar la unión no específica. Aquí, utilizar 4,5 M de solución de proteína (STIL 500-650) disuelto en la solución de bloqueo descrito.
   NOTA: Generalmente 5-10 proteína M se utilizan para la proyección, pero la concentración de proteínas puede ser incluso tan bajo como 2-3 M, dependiendo de la afinidad de unión y las concentraciones locales de los péptidos que se unían en la matriz (la eficiencia de la síntesis). El tampón en el que la proteínase disuelve puede variar, pero es común para diluir la proteína usando la misma solución de bloqueo descrito anteriormente.
3. Incubar la matriz en la solución de proteína durante 3-8 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ºC.

4. La incubación con el anticuerpo

1. Lavar la matriz tres veces con 5 ml de TBST / PBST. El primero de lavado es de 30 seg seguido por dos lavados de 5 min en un agitador a temperatura ambiente.
2. Incubar la matriz se lavó con 5 ml de anticuerpo conjugado con HRP diluido (1: 1500) en un tampón de incubación que contiene los mismos ingredientes en las mismas concentraciones que la solución de bloqueo, durante 1 hora en un agitador a temperatura ambiente. El anticuerpo se puede unir la proteína diana o en la etiqueta.
3. Realizar experimentos de control de comprobación de la interacción del anticuerpo con péptidos en la matriz, especialmente si la matriz contiene péptidos de la proteína diana (por ejemplo, para la oligomerización estudios) repitiendo el mismo protocolo sin step 3, la incubación con la proteína.
4. Lavar la matriz tres veces con 5 ml de TBST / PBST. El primero de lavado es de 30 seg seguido por dos lavados de 5 min en un agitador a temperatura ambiente.

5. Lectura de la matriz

1. Llevar a cabo el desarrollo de quimioluminiscencia con un kit de sustrato ECL Western Blot.
2. Realizar la detección con un analizador de imágenes luminiscente.
3. Analizar los resultados. Asegúrese de que los dos duplicados de la matriz muestran las mismas señales, por lo que los resultados son fiables. Si se conoce la estructura de la proteína de pareja, buscar en la estructura de los péptidos de unión y buscar los sitios de unión. Incluso los péptidos que son mucho en la secuencia pueden ser muy juntos en la estructura terciaria y crear un sitio de unión.

Resultados

STIL es una proteína centrosomal altamente importante. Controla la división celular normal y la proliferación celular ^{13,15 - 19.} STIL interactúa con varias proteínas ^18,20,21, y la mayoría de las interacciones ocurren a través de su parte central, que es una región intrínsecamente desordenados (IDR) ^14. Hemos diseñado una matriz compuesta de péptidos derivados de la proteína de unión STIL CHFR. CHFR es un supresor de tumor que se induce en respuesta a estrés mitótico ^22. Dado...

Discusión

Detección matriz péptido es una excelente herramienta para la identificación de los puntos de unión de una proteína diana en sus socios. Este ensayo es rápido y fácil de realizar y los resultados se pueden obtener en uno o dos días hábiles. Screening matriz péptido es versátil y se puede utilizar para muchos propósitos. Se puede utilizar para la caracterización de modificaciones posterior a la traducción tales como la fosforilación y la identificación de sustratos de quinasas. Por ejemplo: la quinasa FLT3, que está rela...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matriz de péptidos	INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe Anticuerpo (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit	Industrias biológicas	20-500-120
Leche descremada	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 camera	Película