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Artículo de método

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico

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DOI:

10.3791/52136

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5 de enero de 2015

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1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El uso de fluoróforos para la obtención de imágenes in vivo puede verse muy limitado por la opsonización, el aclaramiento rápido, la baja sensibilidad de detección y los efectos citotóxicos en el huésped. La encapsulación de fluoróforos en liposomas mediante hidratación y extrusión de película conduce a la extinción y protección de la fluorescencia, lo que permite obtener imágenes in vivo con una alta sensibilidad de detección.

Resumen

La imagen óptica ofrece una amplia gama de modalidades de diagnóstico y ha atraído mucho interés como herramienta para la obtención de imágenes biomédicas. A pesar del enorme número de técnicas de imagen disponibles en la actualidad y de los avances en la instrumentación, sigue siendo necesario disponer de sondas altamente sensibles que sean adecuadas para la obtención de imágenes in vivo. Un problema típico de las sondas fluorescentes preclínicas disponibles es su rápido aclaramiento in vivo, lo que reduce su sensibilidad de imagen. Para evitar el aclaramiento rápido, aumentar el número de moléculas de colorante en el sitio objetivo y, por lo tanto, reducir la autofluorescencia de fondo, se realizó la encapsulación del colorante fluorescente de infrarrojo cercano, DY-676-COOH en liposomas y la verificación de su potencial para la obtención de imágenes in vivo de la inflamación. El DY-676 es conocido por su capacidad de autoenfriarse a altas concentraciones. Primero determinamos la concentración adecuada para el autoenfriamiento y luego encapsulamos esta concentración de enfriamiento en el interior acuoso de los liposomas pegilados. Para corroborar el potencial de enfriamiento y activación de los liposomas, utilizamos un método de congelación severo que conduce al daño de las membranas liposomales sin afectar el tinte encapsulado. Los liposomas caracterizados por un alto nivel de extinción por fluorescencia se denominaron Lip-Q. Demostramos mediante experimentos con diferentes líneas celulares que la captación de Lip-Q es predominantemente por fagocitosis, lo que a su vez permitió la caracterización de su potencial como herramienta para la obtención de imágenes in vivo de la inflamación en modelos de ratones. Además, utilizamos un modelo de edema inducido por zimosano en ratones para corroborar el potencial de Lip-Q en imágenes ópticas de inflamación in vivo. Teniendo en cuenta la posible absorción debido al efecto de mejora de la permeabilidad y retención (EPR) inducido por la inflamación, se comparó una formulación de liposomas siempre activa con una concentración baja y no apagada de DY-676-COOH (denominado Lip-dQ) y el DY-676-COOH libre con Lip-Q en ensayos con animales.

Introducción

Los liposomas se han investigado intensamente y servir como uno de los sistemas de administración de fármacos biomédicos más biocompatibles para aplicaciones clínicas 1,2. Ellos se componen principalmente de fosfolípidos y colesterol, ambos de los cuales son compuestos biocompatibles que imitan partes de las membranas celulares naturales. Considerando que las sustancias hidrófilas pueden ser atrapados en el interior acuoso, agentes lipófilos pueden incorporarse dentro de la bicapa fosfolipídica liposomal 3. La encapsulación de sustancias dentro del interior acuoso de los liposomas otorga protección contra la degradación in vivo y también evita que el sistema anfitrión de los efectos tóxicos de los fármacos citotóxicos utilizados para la terapia de enfermedades, por ejemplo agentes quimioterapéuticos destinados a destruir las células tumorales. La modificación de la superficie liposomal con polímeros como el polietilenglicol (PEGilación) se extiende aún más el tiempo de circulación de la sangre liposomal in vivo debido a la estabilización estérica 4. Moreover, los liposomas pueden secuestrar altas concentraciones de varias sustancias como proteínas 5,6, sustancias hidrófilas 7,8 y enzimas 9. Por lo tanto, sirven como herramientas terapéuticas y de diagnóstico clínico como fiables que merecen su aprobación para la entrega de fármacos citotóxicos tales como doxorrubicina para la terapia del cáncer 4. Debido a su flexibilidad, los liposomas también se pueden cargar con fluorocromos para fines de diagnóstico y quirúrgicos guiados por imagen.

Imágenes de fluorescencia proporciona una solución rentable y no invasiva herramienta de diagnóstico in vivo que, sin embargo, exige algunos requisitos básicos en. Se pudo demostrar que fluorocromos que se adaptan mejor para formación de imágenes in vivo tienen una absorción característica y máximos de emisión en el rango donde dispersión de la luz y la dispersión, así como la autofluorescencia de tejidos de origen del agua y de la hemoglobina es baja. Por lo tanto, dichas sondas tienen sus máximos de abs / em entre 650 y 900 nm 10. Además de esto, la estabilidad de los fluorocromos tanto in vitro como in vivo es crítica, como la opsonización y eliminación rápida pueden limitar en gran medida su aplicación para las imágenes in vivo 11. Otros efectos como la mala estabilidad y baja sensibilidad o efectos citotóxicos en órganos diana como se ha visto con el verde de indocianina (ICG) 12-16, son no deseados y deben tenerse en cuenta al diseñar sondas para imágenes in vivo. Estas observaciones han conducido al desarrollo activo de varios fluorocromos NIR preclínicos, nanopartículas, así como nuevas técnicas para la formación de imágenes in vivo de procesos inflamatorios, cáncer y para la cirugía guiada por imagen 17-20. A pesar de la estabilidad de la mayoría (fluorescencia del infrarrojo cercano) NIRF preclínica colorantes in vitro, su rápida perfusión y el aclaramiento a través del hígado y el riñón impiden su uso en la formación de imágenes ópticas in vivo de enfermedades y procesos inflamatorios.

ntent "> Por lo tanto, presenta un protocolo para la encapsulación de fluorocromos como el bien caracterizado en el infrarrojo cercano tinte fluorescente DY-676-COOH, conocido por su tendencia a la auto-interferencia a concentraciones relativamente altas 21 en liposomas. En altas concentraciones H- la formación de dímero y / o pi-interacciones de apilamiento entre las moléculas fluoróforo situadas dentro de resultado de cada uno radio de Förster en Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre las moléculas de fluorocromo. A baja concentración el espacio entre las moléculas de fluoróforo se incrementa, impidiendo de este modo la interacción pi-apilado y -H formación de dímero y resultando en una alta emisión de fluorescencia. El interruptor entre alta y baja concentración y la extinción de la fluorescencia que acompaña y la activación es una estrategia prometedora que puede ser explotado para la formación de imágenes ópticas 22. A este respecto, la encapsulación de altas concentraciones del colorante NIRF DY-676-COOH en el interior acuoso de los liposomas es más favorable para formación de imágenes in vivo que el colorante libre. El desafío del método radica en primer lugar en la encapsulación correcta y en segundo lugar, en la validación de los beneficios resultantes de la encapsulación de altas concentraciones de colorante. La comparación de las propiedades de formación de imágenes de liposomas se inactivó con la del colorante libre y también con una formulación no liposómica se inactivó con bajas concentraciones del colorante es indispensable. Mostramos por un protocolo de hidratación de película y extrusión simple, pero muy eficaz combinado con congelación y descongelación ciclos alternos que la encapsulación de las concentraciones de extinción de DY-676-COOH en liposomas es factible. Otros métodos utilizados para preparar liposomas, tales como el método de evaporación de fase inversa 23, así como el método de inyección de etanol 24 permiten preparación de liposomas con altas eficiencias de encapsulación para muchas sustancias hidrófilas. Sin embargo, la naturaleza de la sustancia a encapsular puede influir en la eficiencia de encapsulación. En efecto,el protocolo de hidratación de película y extrusión que aquí se presenta reveló la más alta eficiencia de encapsulación de DY-676-COOH. Para ilustrar los beneficios de la encapsulación liposomal de DY-676-COOH, un modelo de edema inducido por zymosan, que permite el estudio de los procesos inflamatorios dentro de unas pocas horas, fue utilizado. Aquí, se demuestra que los liposomas con altas concentraciones del encapsulado DY-676-COOH son más adecuados para todo el cuerpo en imágenes ópticas vivo de los procesos inflamatorios que el colorante libre o la formulación liposomal no se inactivó con bajas concentraciones de colorante. Así, el protocolo subyacente proporciona un método sencillo y rápido para producir liposomas fluorescentes Templado y la validación de su potencial de activación y de formación de imágenes tanto in vitro como in vivo.

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Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos son aprobados por el comité regional de los animales y de acuerdo con las directrices internacionales sobre el uso ético de los animales.

1. Preparación de los materiales e instrumentos

  1. Preparación de la dispersión de vesículas formada espontáneamente (SFV)
    1. Disolver y preparar soluciones madre de las siguientes fosfolípidos: 214 mg / ml de fosfatidilcolina de huevo (EPC), 134 mg / ml de colesterol, 122 mg / ml de 1,2-distearoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - [metoxi (polietileno glicol) -2000] (sal de amonio) (mPEG 2000 DSPE) y 2 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 il) (sal de amonio) (NBD-DOPE) en cloroformo y guardar en frascos de vidrio.
    2. Proporcionar aproximadamente 3 ml de cloroformo en un matraz de fondo redondo y transferir el volumen apropiado de solución madre de fosfolípidos en el matraz de fondo redondo para preparar liposomas compuestos de EPC: Chol: mPEG 2000 DSPE en una relación molar de 6,5: 3: 0,5. Para el marcaje doble fluorescencia de los liposomas añadir 0,3% en moles NBD-DOPE a la solución de los lípidos.
    3. Evaporar el cloroformo de la solución de fosfolípido orgánico bajo presión reducida (300 mbar) a 55 ° C usando un evaporador rotatorio.
    4. Después se forma una película homogénea de fosfolípidos, reducir la presión a 10 mbar durante 1-2 horas para eliminar el depósito de cloroformo residual.
    5. Mientras que el cloroformo se evapora, se disuelve DY-676-COOH (6,181 M) en 10 mM de tampón Tris pH 7,4 y llenar un recipiente Dewar con nitrógeno líquido. Encienda un baño de ultrasonidos y se fijará en 50 ° C.
    6. Transferir un volumen apropiado (0,5-1 ml) de solución al matraz de fondo redondo para hidratar la película de fosfolípidos seco y agitar vigorosamente hasta que una vesícula formada espontáneamente (SFV) formas de dispersión DY-676-COOH (6,181 M). Asegúrese de que todos los fosfolípidos se dispersan para evitar la pérdida de lípidos.
    7. Cuidadosamente transfer el matraz de fondo redondo que contiene la dispersión SFV en nitrógeno líquido y congelar la dispersión durante 3-5 min. Colocar el matraz de fondo redondo en un baño de ultrasonidos a 50 ° C para descongelar la dispersión luego agite la dispersión vigorosamente durante 1-2 minutos. Repita este procedimiento seis veces, haciendo un total de siete ciclos de congelación y descongelación.
  2. Extrusión de SFV para formar vesículas de liposomas homogéneos
    1. Transferir la dispersión de SFV en un 1 ml jeringa (jeringa a) y extruir la dispersión a través de una membrana de policarbonato de 100 nm utilizando un extrusor de LiposoFast básica en la jeringa-b.
    2. Extruir la dispersión de la jeringa-b, de nuevo en una jeringa, y luego repetir el ciclo de diez veces. Debido a la extrusión, la solución en los cambios de jeringa de un aspecto turbio a una dispersión clara con el tiempo. Después de diez ciclos (veinte pasos de extrusión individuales) retire la jeringa-b del dispositivo y extruir la dispersión por última vez desde una jeringa directamente en una estéril1,5 ml tubo de reacción.
  3. Purificación de encapsulado liposomal DY-676-COOH de colorante libre
    1. Preparar una columna de cromatografía de gel utilizando cuentas G25 empapados en 10 mM Tris pH 7,4 (columna de longitud 28 cm, diámetro 0,8 cm).
    2. Transferir 0,5 ml de dispersión vesicular extruido sobre la cama de gel y dejar que el drenaje de la muestra en la matriz de gel.
    3. La elución de los liposomas con 10 mM tampón Tris pH 7,4 (Figura 1A) y se lava la columna hasta los drenajes colorante libre completamente fuera de la columna. Si es necesario, recoger y reciclar el tinte libre por la desalación y la deshidratación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Concentrar los liposomas eluidas por ultracentrifugación (200.000 xg, 2 horas a 8 ° C) a continuación, dispersarlos en el volumen adecuado de pH estéril 10 mM de tampón Tris, 7,4.
  4. La cuantificación de la concentración de encapsulado DY-676-COOH
    1. Preparar una curva de calibración mediante la disolución de DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) en 10 mM de tampón Tris, pH 7,4 que contiene 0,1% de Triton X100.
    2. Disolver 2 l (100 nmol final de lípidos de un / L de stock 50 mmol) de los liposomas durante 5 min a temperatura ambiente en 100 l de tampón Tris que contiene 1% de Triton X100 para destruir las vesículas y suelte el colorante encapsulado. Luego diluir las muestras con 10 mM de tampón Tris, pH 7,4 a una concentración final de Triton-X100 de 0,1% (v / v) hacer un volumen total de 1 ml. Preparar todas las muestras por duplicado.
    3. Medir la absorción y emisión de todas las muestras (gratis DY-676-COOH y Triton-X100 tratada liposomas) a una excitación λ = 645 nm y una emisión λ = 700 nm. Establecer y utilizar una curva de calibración del tinte libre de determinar la concentración de colorante encapsulado.
  5. Caracterización de liposomas
    1. Determinar el tamaño y el potencial zeta de los liposomas mediante dispersión de luz dinámica. Diluir las muestras de liposomas con filtro esterilizado (0,2 micras) tampón 10 mM Tris pH 7,4 a aconcentración de 100-300 micras (lípidos). Transferir las muestras diluidas en una cubeta desechable de bajo volumen y medir la muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Caracterizar los liposomas por microscopía electrónica para sustanciar el tamaño, la integridad y la homogeneidad de las vesículas liposomales de acuerdo con protocolos estándar.

2. Validación de fluorescencia de enfriamiento rápido y activación de los liposomas preparados

  1. Análisis físico-químico de extinción de la fluorescencia y la activación
    1. Prepare dos tubos de 1,5 ml para el Lip-Q y 2 tubos para la libre DY-676-COOH. Transferencia de 100 nmol de lípidos totales (2,38 l de una solución / L Lip-Q Stock 42 mmol, que contienen 138 mg / ml del encapsulado DY-676-COOH) en los tubos correspondientes. Traslado gratuito DY-676-COOH equivalente al contenido de colorante de Lip-Q (0,38 g que se traduce, por ejemplo, de 138 g / l 1,000 x 2,38 l Lip-Q se utiliza). Incubar una bañerae de cada sonda a 4 ° C y congelar el segundo tubo a -80 ° C durante la noche (16 hr).
    2. Calentar un bloque de calentamiento a 30 ° C. Llenar una caja de enfriamiento con hielo triturado y equilibrar una alícuota de tampón Tris 10 mM pH 7,4 a temperatura ambiente.
    3. Retire las sondas de 4 ° C y se equilibren a temperatura ambiente (envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz) y rápidamente descongelar sondas de -80 ° C a 30 ° C durante 5 min. Enfríe las sondas descongelados en hielo durante 1 minuto antes de transferirlos a la temperatura ambiente (también envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz).
    4. Añadir 10 mM de tampón Tris (pH 7,4) a cada una de las sondas a 100 l de volumen final y equilibrar todas las sondas a temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Pipetear 80 l de cada sonda en una cubeta de vidrio de bajo volumen y medir la absorción de cada sonda 400 a 900 nm en un espectrómetro. Devuelva la sonda a sus correspondientes tubos.
    6. Transferir 80 l de cada sonda en una cubeta de vidrio adecuadoy medir la emisión de fluorescencia en un espectrofluorómetro por emocionantes las sondas a 674 nm y midiendo la fluorescencia de 694 a 800 nm.
  2. La captación celular y la activación de fluorescencia
    1. Obtener y la cultura las siguientes líneas de células en su medio de cultivo correspondiente de acuerdo con condiciones estándar (37 ° C, 5% de CO 2 y el 95% atmósfera húmeda). Aquí, utilice el J774A.1 murino línea celular de macrófagos (modificado de Dulbecco medio de Eagle suplementado con 10% (v / v) de suero de ternera fetal), la línea celular de glioblastoma humano, U-118 mg (MEM que contiene vitaminas esenciales y 10% (v / v) de suero de ternera fetal) y la línea celular de fibrosarcoma humano, HT-1080 (RPMI con 5% de FCS).
    2. Escudo de 8 pocillos cámara de diapositivas con poli-L-lisina (añada 100 l 0,001% de poli-L-lisina a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 10 minutos. Aspirar solución y deje que los portaobjetos de cámara se sequen durante al menos 4 hr a RT sobre un banco de trabajo estéril. Enjuague los portaobjetos de cámara 3veces con solución salina tamponada con 200 l de Hank luego sellar con parafina y papel de aluminio y se almacena a 4 ° C hasta que sea necesario.
    3. Mientras que los portaobjetos de cámara están secando, filtro-esterilizar los liposomas y solución de colorante y se almacena a 4 ° C hasta que sea necesario.
    4. Para el análisis de la absorción de la sonda con todo el cuerpo vivo sistema de imágenes de fluorescencia en NIR, preparar 5 matraces de cultivo pequeños para cada una de las 3 líneas celulares de ensayo (15 frascos en total). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg y células HT-1080 por matraz de cultivo con 5 ml de medio de cultivo respectivo (en quintuplica) y crecen durante 16-24 h. Paralelo a los frascos de cultivo, sembrar 30.000 células de cada línea celular (J774A.1 y HT-1080) o 20.000 células (T-118 mg) a 2 pocillos de la diapositiva cámara respectivamente y crecer en un medio de cultivo de 500 l de 16 a 24 h .
    5. Al día siguiente, añadir 100 nmol (importe final de lípidos) de Lip-Q para 2 frascos por línea celular y a un pocillo de cada línea celular en la diapositiva cámara.Inmediatamente transferir matraz de 1 por cada línea celular a 4 ° C y el segundo matraz de nuevo a la incubadora.
      NOTA: El volumen de las sondas añadió a los matraces y los portaobjetos de cámara son los mismos, haciendo que la concentración en la cámara de diapositivas 10 veces mayor (5 ml es 500 l de medio de cultivo). Esto es necesario porque la detección microscópica es menos sensible que el sistema de imágenes de fluorescencia NIR donde se crean imágenes de sedimentos celulares de los matraces.
    6. Añadir la libre DY-676-COOH en una concentración equivalente al contenido de colorante de Lip-Q a las células en 2 matraces por línea celular y a un pocillo de cada línea celular en el portaobjetos de cámara, a continuación, transferir inmediatamente matraz de 1 por línea celular a 4 ° C (agotamiento de la energía) y el otro matraz junto con la corredera cámara posterior a la incubadora. Incubar todas las células durante 24 horas a las condiciones correspondientes. Las células en el matraz sin sonda servir como control sin tratar.
  3. NIRF imágenes y análisis semi-cuantitativo
    1. Después de 24 horas de duración de la incubación, recoger las células en frascos lavando las células 2 veces con solución salina tamponada Hanks (HBSS) luego raspar las células en 500 l HBSS y precipitado mediante centrifugación (5 min a 200 x g) en 500 tubos mL.
    2. Colocar los tubos con los gránulos de las células (y HBSS) en una cámara NIRF y de imágenes utilizando filtros de excitación (615-665 nm) y emisión (corte de> 700 nm).
    3. Deducir la autofluorescencia y evaluar la intensidad de la diana frente autofluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto dará a los niveles semi-cuantitativos de la intensidad de fluorescencia como media de la señal (recuentos de escalado / seg), que representa los niveles de recuento después de la escala de tiempo de exposición, ganancia de la cámara, binning y la profundidad de bits, de modo que las mediciones son comparables entre sí.
  4. Análisis microscópico confocal
    1. Después de 24 horas de incubación, recoger las células en la cámara de diapositivas mediante lavado 2 veces con 500 l HBSS.
    2. Fijar la ceLLS con 200 l de HBSS que contiene 3,7% (v / v) de formaldehído durante 30 min a TA.
    3. Mientras que la fijación está pasando, diluir la mancha de ADN, Hoechst-33258 1:50 con solución de montaje.
    4. Después de la fijación, se lavan las células 2 veces con HBSS luego se separan las cámaras de los portaobjetos de vidrio. Añadir solución de montaje 50 l que contiene el ADN de mancha en cada lugar correspondiente a los pocillos de los portaobjetos de cámara. Cubra las células con cubreobjetos de vidrio, sellar los bordes con esmalte de uñas transparente y durante 10 minutos de secado al aire a temperatura ambiente (oscuro).
    5. Células de imagen en un microscopio de fluorescencia adecuado o un microscopio confocal. Utilice los siguientes parámetros de excitación y emisión para la visualización de los componentes correspondientes: núcleos (Hoechst-33258: excitación 405 nm, emisión 420-480 nm). NBD-DOPE (liposomal de lípido: excitación 488 nm, emisión 530 nm). DY-676-COOH (NIR tinte fluorescente: excitación 633-645 nm, emisión 650-700 nm).
      NOTA: Asegúrese de que el microscopio de fluorescencia unvailable está equipado con filtros adecuados que permiten la excitación y emisión de longitudes de onda superiores a 630 nm.

3. liposomas basados ​​en fluorescencia in vivo Imaging de Inflamación

  1. Preparación de los animales y materiales
    1. Casa 8-12 semanas de edad, los ratones NMRI macho que pesaban aproximadamente 36 g en condiciones estándar con comida y agua ad libitum.
    2. Siete días antes del inicio de los experimentos, dar a todos los ratones una dieta baja feofórbido a fin de reducir la autofluorescencia del tejido.
    3. Veinticuatro horas antes del comienzo de cada experimento, los ratones afeitarse en el área deseada (por ejemplo, zona de la espalda todo si se desea obtención de imágenes de edema pata trasera).
    4. Pesar los animales y calcular la cantidad de sonda para ser inyectada por ratón (Lip-Q y Lip-dQ a 10 mol (concentración de lípidos) por kg de peso y libre DY-676-COOH (equivalente a teñir contenido de Lip-Q utiliza) .
    5. Imagen de los animalesun cuerpo entero NIR de fluorescencia de imágenes con los mismos ajustes utilizados para los sedimentos celulares. Esta medida ofrece la autofluorescencia de los animales.
    6. Disolver 10 mg zymosan A en 1 ml de solución salina isotónica y almacenar durante la noche a 4 ° C.
  2. La inducción de la inflamación y la formación de imágenes in vivo NIRF
    1. Preparar 3 jeringas por ratón que contienen las siguientes soluciones. Llene una jeringa con 50 l zymosan Una solución (10 mg / ml) y la segunda jeringa con 50 l de solución salina isotónica. Llene la tercera jeringa con las sondas, por el que Lip-Lip-Q y dQ (10 mmol / kg de peso (lípido)) están designados para animales de prueba y gratis DY-676-COOH (concentración que en Lip-Q) para los animales de control. Asegúrese de que las sondas se diluyeron con HBSS estéril a 150 l de volumen final.
    2. Aplicar crema para los ojos en los ojos de los animales para evitar la sequedad y anestesiar a los animales con un 2% de isoflurano hasta que están profundamente dormidos y no reaccionan cuando se toca en las patas (esto toma alrededor de 2 minutos).
    3. Coloque el ratón sobre una estera caliente (todavía bajo anestesia) e inyectar el zymosan-A por vía subcutánea solución en la pata trasera derecha y la solución salina en la pata trasera izquierda. Inyectar inmediatamente la sonda intravenosa y la imagen del animal a partir de entonces a continuación, un tiempo récord de inyección / medición (como t = 0 h). Guarde las imágenes resultantes como cubos de imagen y repita los pasos anteriores para el resto de los animales y de las respectivas sondas.
    4. Imagen de los animales cada 2 h después de la inyección de 10 horas ya las 24 horas después de la inyección, asegurándose de que la etapa de la cámara de medición está caliente (por ejemplo, mediante la colocación de una alfombra cálida debajo), con el fin de evitar la hipotermia. Después de cada medición, colocar los animales en una jaula con comida y agua ad libitum y colocar la jaula en una cámara de animales templado. La eutanasia a los animales por primera anestesiante con isoflurano al 2% hasta los animales ya no reaccionan al tacto, a continuación, la eutanasia con dióxido de carbono durante 5-10 minutos, lo que haceasegurarse de que los animales dejan de respirar por completo y el rigor mortis se produce.
    5. Diseccionar los ratones de acuerdo con protocolos estándar, que pueden ser evaluados en línea (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) y la imagen de los órganos.
    6. Evaluar los resultados de medición de acuerdo con las instrucciones del fabricante por primera deducción de la fluorescencia general de los animales (desmezcla), entonces las regiones asignación de interés para la autofluorescencia (de izquierda pata trasera con solución salina) y el objetivo de fluorescencia del área inflamada (pata trasera derecha con zymosan-A).

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Resultados

La encapsulación de altas concentraciones de colorantes fluorescentes tales como el colorante NIRF DY676-COOH utilizado aquí en el interior acuoso de los liposomas conduce a un alto nivel de extinción de la fluorescencia. Extinción de la fluorescencia, un fenómeno observado con muchos fluoróforos a alta concentración, puede ser explotado en varias en aplicaciones de formación de imágenes in vivo, donde se exigen una alta sensibilidad y detección fiable de la zona objetivo. El uso de liposomas también p...

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Discusión

Desde liposomas también pueden servir como sistemas de liberación para los tintes fluorescentes, que permiten imágenes de las enfermedades diana. La encapsulación de altas concentraciones de colorantes fluorescentes tales como el colorante NIRF, DY676-COOH se utiliza aquí, conduce a un alto nivel de extinción de fluorescencia del colorante atrapado. Extinción de fluorescencia, un fenómeno visto con muchos fluoróforos en alta concentración puede ser explotado en varias aplicaciones de imagen en vivo, donde se ex...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta labor fue apoyada por las subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 y RU-1652 / 1-1. Agradecemos Doreen mayo de asistencia técnica excelente y la compañía Dyomics GmbH, Jena por su amable apoyo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Materiales y equipos para la preparación de liposomas
>fosfatidilcolinaAvanti Lípidos Polares 840051PDisolver en cloroformo y almacenar en viales de vidrio (214 mg/ml)
colesterolSigmaC8667Disolver en cloroformo y almacenar en viales de vidrio (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio)Avanti Polar Lipids880120PDisolver en cloroformo y almacenar en viales de vidrio (122 mg/ml)
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-il) (sal de amonio)Avanti Polar Lipids810145PDisolver en cloroformo y almacenar en viales de vidrio (2 mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0,01 mg)Sartorius AGResearch RC 210 Putilizado para pesar los fosfolípidos
RotavaporBü chi Labortechnik AGR-114utilizado para la hidratación de la película de fosfolípidos
Baño de aguaBü chi Labortechnik AGR-481utilizado para la hidratación de la película de fosfolípidos
Vacuum ControllerBü chi Labortechnik AGB-720utilizado para la hidratación de la película de fosfolípidos
VacoboxBü chi Labortechnik AGB-177utilizado para la hidratación de la película de fosfolípidos
Enfriador de circulaciónLAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		WKL 230utilizado para la hidratación de la película de fosfolípidos
DY-676-COOHDyomics GmbH676-00Disolver en 10 mM Tris y almacenar existencias a -20°C; C
Tris-(hidroximetil)-aminometanoApplichemA1086tampón 10 mM, pH 7,4
triclormetanoCarl Roth GmbH + Co. KGY015.2utilizado para la preparación de liposomas
SonicatorMerck Eurolab GmbHUSR 170 Hutilizado para la preparación de liposomas
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)Scientific Industries Inc.SI-0256utilizado para la preparación de liposomas
Sephadex G25 medio GE Healthcare Europe GmbH17-0033-01utilizado para la purificación de liposomas
Triton X100Ferak Berlin GmbH505002utiliza para la destrucción de liposomas  para la cuantificación de colorantes
LiposoFast-BasicAvestin Inc.utilizado para la extrusión de liposomas Membrana filtrante de
policarbonato, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)VWRutilizado para la extrusión de liposomas a través de LiposoFast-Basic
Fluostar OptimaBMG Labtechutilizado para la cuantificación de colorantes
Zetasizer Nano ZSMalvernutilizado para la determinación del tamaño de los liposomas y el zetapotencial
Ultracentrífuga Beckmann Coulter GmbHXL 80utilizado para la concentración de las muestras
RotorBeckmann Coulter GmbHSW 55 TIutilizado para la concentración de las muestras
Materiales y equipos para la evaluación de liposomas e imágenes ópticas
Zymosan-A de Saccharomyces cereviciaeSigmaZ4250-250MGutilizado para la inducción de la inflamación
Solución salina isotónica (0,9%)Fresenius GmbHPZN-2159621utilizada para la dilución de Zymosan-A
Vaporizador de isofluranoOhmeda Isotec 4utilizado para anestesiar animales
IsofluranoActavis GmbH PZN-7253744anestesia
Thermo Mat Pro 20 WLucky Reptile61202-HTP-20utilizado para mantener calientes a los animales durante la anestesia
Omnican-F (inyección de 1 ml) BraunPZN-3115465utilizado para la aplicación subcutánea e intravenosa de sondas Crema para
ojos con pantenolJenapharmPZN-3524531utilizada para prevenir la sequedad de los ojos de los animales durante la anestesia
Solución salina tamponada HanksPAA Laboratories /Biochrom AGL2045sin Mg2+, Ca2+ y rojo fenol. Para la dilución de sondas y para el lavado de células
los portaobjetos de la cámara de 8 pocillosBD Biosciences354108utilizan para el cultivo celular seguido de microscopía 
Matraces de cultivo celularGreiner BioOne
Medios de cultivo celularGibco (life technologies GmbH)
Suero de ternero fetal Invitrogen
Solución de poli-L-lisina (0,01%, 50  ml)SigmaP4832utilizado para recubrir portaobjetos de cámara de cultivo celular
Mountant PermafluorThermoScientific S21022-3 Solución demontaje para microscopía
Hoechst-33258AppliChemTinción de ADN para microscopía
Hera-SafeHeraeus Instrumentsbanco de trabajo estéril utilizado para el cultivo celular
Célula HERAHeraeus InstrumentsIncubadora utilizada para el cultivo celular
LSM510-MetaZeissutilizado para microscopía
confocalSistema de imagen de fluorescencia in vivo Maestro-TMCRi, Woburnutilizado para la obtención de imágenes de fluorescencia de cuerpo entero de animales pequeños
Espectrofotómetro (Ultrospec 4300 pro UV)GE Healthcareutilizado para la medición de la absorción
Espectrofluorómetro (Jasco FP-6200)Jascoutilizado para la medición de la emisión
Animals
Ratones NMRI (8-12 semanas de edad, macho)Elevage Janvier, Franciautilizado para ensayos de inflamación
, de fluorescencia

Referencias

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