Artículo de método

Usando plusTipTracker Software a Medida microtúbulos dinámica en Xenopus laevis Conos de Crecimiento

DOI:

10.3791/52138

⸱

7 de septiembre de 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston College

En este artículo

Resumen

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El paquete de software basado en MATLAB código abierto, plusTipTracker, se puede utilizar para analizar series de imágenes de fluorescencia + Filtros marcado para cuantificar la dinámica de microtúbulos.

Resumen

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Microtúbulos (MT) plus de fin de seguimiento de las proteínas (+ consejos) localizar a las crecientes más-extremos de MTs y regulan la dinámica de MT 1,2. Uno de los consejos más conocidos y utilizados ampliamente + para el análisis de la dinámica de MT es la proteína, EB1 Fin de Unión, que une a todos los que crecen MT plus-extremos, y por lo tanto, es un marcador para la polimerización MT 1. Muchos estudios de comportamiento EB1 dentro conos de crecimiento se han utilizado mucho tiempo y, métodos tendenciosos mano de seguimiento con ayuda de computadora para analizar individuo MTs 1-3. Nuestro enfoque consiste en cuantificar los parámetros globales de la dinámica de MT utilizando el paquete de software, plusTipTracker 4, tras la adquisición de alta resolución, imágenes en directo de EB1 etiquetados en los conos de crecimiento embrionarias cultivadas 5. Este software es un código abierto, paquete basado en MATLAB, fácil de usar que combina la detección automática, el seguimiento, la visualización y el análisis de las películas de + Filtros marcadas con fluorescencia. A continuación, presentamos el protocolo para el uso de plusTipTracker para el análisis de los cometas TIP marcadas con fluorescencia + en los conos de crecimiento laevis cultivadas Xenopus. Sin embargo, este software también puede ser utilizado para caracterizar la dinámica de MT en diversos tipos celulares 6-8.

Introducción

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El objetivo de este método es la obtención de información cuantitativa respecto a los microtúbulos (MT) plus de fin de seguimiento de la dinámica en los conos de crecimiento que vive proteína (+ TIP). MT + consejos son un grupo de proteínas que se localizan en las plus-extremos de los MT 9,10. Llevan a cabo una serie de funciones para regular los parámetros de MT inestabilidad dinámica 11, como los porcentajes de polimerización, la catástrofe, y el rescate. Un método muy usado para el análisis de la dinámica de MT es realizar un seguimiento del comportamiento de la EB1 TIP +, que se une específicamente a la creciente MT plus-termina 1,12. EB1 es conocido por reclutar otras proteínas a la creciente MT plus-termina 13,14, y recientemente se ha establecido como un factor de maduración de MT 15, promoviendo tanto el crecimiento de MT y la frecuencia catástrofe 15,16.

Muchos estudios sobre la dinámica de MT en los conos de crecimiento se han utilizado métodos de la mano-de seguimiento para medir los cambios en la dinámica EB1-GFP en el tiempo 1-3, como localizati EB1a MT-más extremos pueden ser utilizados como un marcador para la polimerización de MT. Un beneficio clave para el examen de los cometas EB1-GFP como un proxy para el crecimiento MT es que la dinámica de MT se pueden medir incluso en las regiones de solapamiento significativo MT. Mientras que el método de los cometas EB1-GFP-tracking mano ha proporcionado información útil sobre MT comportamientos 1-3, es mucho tiempo y puede estar sesgado. Además, ya que el crecimiento aberrante comportamientos cono son probablemente el resultado de los cambios de hora en la dinámica del citoesqueleto, analizando sólo un pequeño subconjunto de los MT (suele ser necesario cuando la mano-seguimiento) puede perder información importante.

Por lo tanto, medimos los parámetros globales de dinámica MT utilizando el paquete de software, plusTipTracker 4, después de la adquisición de alta resolución, imágenes en directo de EB1 etiquetados en los conos de crecimiento embrionarias cultivadas 5. Este software, desarrollado en el Laboratorio de Danuser, se ha utilizado en varios estudios que caracterizan la dinámica de MT en diversos tipos de células 6-8. Es un código abierto, noser-amistoso, paquete basado en MATLAB que incluye la detección automática, el seguimiento, la visualización y el análisis de las películas de + Filtros marcadas con fluorescencia. Una larga lista de parámetros específicos de la dinámica de MT se calculan por este software (ver referencia 4 para más detalles), pero para el análisis de la dinámica de MT en los conos de crecimiento, los parámetros más útiles son MT velocidad senda del crecimiento (en micras / minuto), la senda del crecimiento curso de la vida (en segundos), y la longitud de la pista de crecimiento (en micras). El software se puede descargar directamente desde la página web Danuser Lab (en "Software"). Mientras que el Laboratorio Danuser actualmente soporta una nueva interfaz para el análisis de seguimiento + TIP, que se incorpora en un paquete de software llamado u-pista 2.0, el software original, independiente seguirá estando disponible. Los algoritmos subyacentes entre los dos programas son los mismos (por lo menos a partir de 2014), con sólo una diferencia de salidas de la interfaz y de análisis. Para el usuario principiante con poco MATLAB y / o análisis computacional expericia, plusTipTracker tiene más características fáciles de usar, incluyendo salidas de parámetros estadísticos automatizados.

A continuación, describimos los pasos para el análisis de imágenes de la dinámica EB1-GFP en los conos de crecimiento laevis cultivadas Xenopus. Este protocolo se utilizó en un artículo reciente sobre la dinámica de MT 17. Ver también Lowery et al. 2012 5 para instrucciones detalladas de los conos de crecimiento del cultivo que expresan EB1-GFP. Si bien este documento se centró principalmente en el examen de la dinámica de EB1-GFP en los conos de crecimiento, el mismo protocolo se puede utilizar para otros tipos de células 17. Para todos los tipos de células, el intervalo de tiempo entre tramas debe estar entre 0,5-2 seg para el seguimiento óptimo + TIP. Un intervalo de tiempo de hasta 4 segundos entre tramas es posible, pero este aumento de los resultados de tiempo de intervalo en errores de seguimiento adicionales.

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Protocolo

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Este protocolo y el vídeo tienen el propósito de servir como un compañero al documento original que describe el paquete de software en más detalle 4, así como el informe técnico que acompaña la descarga del software en el sitio web Danuser Lab. Se anima a los lectores a revisar estos documentos cuidadosamente si hay preguntas adicionales con respecto al uso del software.

1. Antes de Análisis de Imágenes

  1. Convertir cada película de lapso de tiempo en una secuencia de TIFF (Tagged Image File Format) archivos de imagen. Si hay varios conos de crecimiento / células en una película dada, primera cosecha de cada cono de crecimiento / célula para crear su propia secuencia de imágenes.
    Nota: Esto no es necesario, como regiones-de-interés (ROI) individuales se pueden seleccionar dentro plusTipTracker. Sin embargo, utilizando dimensiones de imagen más pequeños aumenta la velocidad del procesamiento computacional, lo que se recomienda este paso si hay espacio en blanco significativo en la imagen.
  2. Guarde cada serie TIFF en su propiacarpeta llamada "imágenes" en un camino que MATLAB se establece en el acceso (tenga en cuenta que "las imágenes" es entre mayúsculas y minúsculas). Para agregar un nuevo camino, navegue hasta el directorio de archivos correspondiente en la ventana de "carpeta actual", haga clic derecho en el icono de directorio y seleccione "Agregar a Path - Seleccionado Carpetas y Sub-Carpetas". Es importante que se añadirá la carpeta del software plusTipTracker al Camino, también.

2. plusTipGetTracks

Nota: El primer paso en el análisis de imagen es detectar las cometas EB1-GFP, vincular las cometas en pistas, y determinar los parámetros de la dinámica de microtúbulos. Esto se logra con el comando "plusTipGetTracks" 4.

  1. Para comenzar el análisis, la aplicación MATLAB abierta y escriba "plusTipGetTracks" en la ventana de comandos. Esto hará que un nuevo cuadro de diálogo que aparezca.
  2. Haga clic en "Set Up Nuevos Proyectos" y seleccionar uno (o more) de la anterior TIFF serie de imágenes mediante la selección de las "imágenes" apropiadas carpeta (o directorios que contienen "imágenes" carpetas). Una vez finalizado este paso, un directorio de archivos (roi_1) será creado (en la misma carpeta que contiene "imágenes") que contendrá los ficheros de datos futuras. Nota: el paso "Configurar Nuevos Proyectos" se puede completar antes de tiempo, durante una sesión separada.
  3. Una nueva ventana aparecerá: "Seleccione un polígono, haga clic derecho en este último punto, y hacer clic en" Crear máscara '". Haga clic en "Aceptar". A continuación, se muestra la primera imagen de la serie de imágenes seleccionadas. Usa el ratón para hacer clic y crear un polígono que abarca la totalidad del cono de crecimiento. Haga doble clic en el ratón para cerrar el polígono.
  4. Una vez que el polígono se ha cerrado, un cuadro de diálogo aparecerá: "¿Usted desea seleccionar otro ROI?" Si la imagen tiene otro cono de crecimiento para analizar, seleccionar "Sí"; s de lo contrarioelegidos "No".
  5. Seleccione los proyectos que serán analizadas inmediatamente. Haga clic en "Seleccionar Proyectos" y seleccione la carpeta (roi_X) para analizar.
  6. Aparecerá una pantalla listSelectGUI. Seleccione el proyecto (s) desde el lado izquierdo de la pantalla y moverlos hacia el lado derecho de la pantalla. Haga clic en "Aceptar". Elija una ubicación para guardar la lista de proyectos y haga clic en "Guardar".
  7. Seleccione "Detección", "Tracking" y "Post-proceso". Una vez realizadas estas selecciones, el lado derecho del cuadro de diálogo se convertirá configurable. Configure cada opción.
    1. Estos parámetros se utilizan para vincular los cometas detectados en pistas MT. Detalles para la elección de estos parámetros de control para el seguimiento se incluyen en las páginas 9 a 10 del Informe Técnico PDF que acompaña la descarga del paquete de software; leer este informe con cuidado si se encuentran problemas. Para los propósitos de seguimiento de cometas EB1-GFP en Xenopnos laevis conos de crecimiento, utilizan los ajustes de seguimiento siguientes: Radio de búsqueda Rango (píxeles) 5-12, Longitud mínima Sub-Track (frames) 3; Max longitud de hueco (frames) 8; Max Factor Contracción 0,8, ángulo delantero máximo 50, ángulo de Max hacia atrás 10, Fluctuación Radio 2.5. Estos valores se muestran en la Figura 1.

    Nota: Max Factor Contracción está configurado para reducir el número de "lagunas detectadas atrasadas", como "brechas hacia atrás" no son útiles para analizar en el contexto de los conos de crecimiento, dadas las condiciones de hacinamiento y los posibles errores en los vínculos de la pista. Además, tanto el ángulo delantero máximo, así como la fluctuación del radio se fijan relativamente alta, como MT cono de crecimiento exhiben pequeños desplazamientos frecuentes, además de crecimientos y contracciones, y el aumento de estos parámetros de control permite para este aumento en el movimiento durante la etapa de vinculación.
    1. Complete los ajustes post-procesamiento en función de los ajustes de adquisición de imágenes específicas deseadas.
  8. Una vez que los ajustes se han configurado, haga clic en "Iniciar". El software se ejecutará lo que los ajustes han sido seleccionados. Esto puede tomar minutos u horas, dependiendo del número de proyectos seleccionados y sus tamaños. La ventana de comandos muestra el tiempo restante estimado para cada función. Cuando se completa el paso plusTipGetTracks, la ventana de comandos mostrará "¡Ya está!"
    Nota: Una larga lista de parámetros específicos de la dinámica de MT ahora se han calculado por este software (ver referencia 4 para más detalles), pero para el análisis de la dinámica de MT en los conos de crecimiento, los parámetros más útiles para el estudio son MT velocidad senda del crecimiento (en micras / minuto), tiempo de vida senda del crecimiento (en segundos), y la longitud de la pista de crecimiento (en micras).

3. plusTipSeeTracks

Nota: Ahora que las pistas de los microtúbulos se han definido, la función "plustipSeeTracks" se utiliza para la pista de visualización 4. Esta funciónpueden proporcionar múltiples salidas para la visualización, incluyendo mapas de dinámica de MT espaciales y películas de velocidad, pero aquí, la atención se centra exclusivamente en el uso de "Películas Track" para mostrar pistas MT superpuestas sobre las imágenes de cono de crecimiento. Mientras plusTipGetTracks pueden analizar varias películas a la vez, plusTipSeeTracks sólo pueden analizar una película a la vez.

  1. Escriba "plusTipSeeTracks" en la ventana de comandos.
  2. Una vez cargado el cuadro de diálogo, haga clic en "Seleccionar proyecto". Seleccione el directorio principal que contiene el proyecto de visualizar y haga clic en "Seleccionar carpeta". Una nueva ventana aparecerá: "Seleccione el proyecto que desea visualizar". Elija el archivo para visualizar y haga clic en "Aceptar".
  3. A continuación, haga clic en "Select Guardados ROI". Navegue a la misma carpeta roi_X que la seleccionada en el paso anterior y seleccione el archivo con el nombre "roiYX".
  4. Haga clic en "Seleccionar Directorio de salida" para designar waquí MATLAB guardará los archivos de visualización de pista. Nota: Se recomienda el uso de la misma carpeta que contiene el resto de los datos.
  5. Seleccione "Crear pista de película", y aparecerá una pantalla que muestra todas las pistas plusTipGetTracks calculados a partir de los cometas TIP +. Este paso guarda la serie de tiempo seguido en un formato de película, en el archivo "allTracks_X_X_X". Hay una opción para guardar la película como AVI, de lo contrario el formato por defecto es como un archivo Quicktime.mov.

4. plusTipGroupAnalysis

Nota: Esta función final se utiliza para crear grupos de películas para el análisis y la comparación de sus parámetros de pista MT.

  1. Escriba "plusTipGroupAnalysis" en la ventana de comandos. Para seleccionar manualmente los grupos para comparar, primero de-seleccionar "Auto grupo de jerarquía". A continuación, haga clic en "Seleccionar proyectos". Vaya a los directorios padre que contienen todas las carpetas roi_Xpara analizar.
  2. Aparecerá una pantalla listSelectGUI. Seleccione todos los proyectos a incluir en los grupos de la parte izquierda de la pantalla y moverlos hacia el lado derecho de la pantalla. Haga clic en "Aceptar". Elija una ubicación para guardar la lista de proyectos y haga clic en "Guardar".
  3. Una ventana aparecerá: "Por favor, seleccione primer grupo de la lista". Haga clic en "Aceptar". La ventana listSelectGUI mostrará de nuevo. Esta vez, seleccionar sólo los archivos que corresponden al primer grupo que deben ser agrupados juntos. Haga clic en "Aceptar".
  4. A continuación, introduzca el nombre del grupo y haga clic en "Aceptar". Una ventana aparecerá: "Seleccione otro grupo?" Respuesta en consecuencia y continuará la selección de grupos. Una ventana aparecerá: "Seleccione una ubicación para guardar la lista de grupos". Vaya a la ubicación y haga clic en "Guardar".
  5. Haga clic en "Select Output Directory" para elegir dónde las carpetas de salida seráalmacenado.
  6. Seleccione el tipo de análisis de grupo para llevar a cabo - si las pistas MT deben agruparse para cada grupo o por el análisis de células se debe realizar. Las pruebas estadísticas recomendadas ya están designados. Para incluir todas las pistas en el análisis, de-seleccionar "Eliminar pistas al inicio / final de la película". De lo contrario, teniendo este cuadro seleccionado elimina cualquier pista de crecimiento MT que están en proceso como la película comienza o termina.
  7. Una vez realizada la selección Grupo de Análisis, seleccione "Búsqueda de grupos".

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Resultados

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El uso de este software aquí descrito ofrecer varios archivos de información que cuantifican + dinámica TIP en las células vivas.

Los plusTipGetTracks función identifica las pistas (utilizando la configuración de ejemplo que se muestran en la Figura 1) y, a continuación, proporciona parámetros respecto a las pistas TIP +. Para ver la información que el software ha obtenido, vaya al directorio roi_X que se creó en el paso 2.2. La carpeta "hazaña" contiene "overlayImages", que...

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Discusión

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PlusTipTracker proporciona una interfaz de usuario sencilla, gráfica para detectar de forma rápida y automática prácticamente todos los cometas visibles EB1-GFP en un cono o el crecimiento celular, vincular las cometas en pistas, y calcular los parámetros de MT. Otras publicaciones han informado el diseño de tipos similares de software (por ejemplo, Marx et al. También utilizó el análisis cuantitativo de la dinámica de EB1 marcadas en los conos de crecimiento 18). Pero, este programa parece ser único...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Agradecemos al Dr. Gaudenz Danuser y a los miembros de su laboratorio por crear el software plusTipTracker y por la útil discusión sobre el uso del software, en particular a Maria Bagonis y Sebastien Besson. Agradecemos especialmente al Centro de Medios de Boston College por su asistencia y apoyo en la creación y edición del video. También agradecemos a los miembros del Lowery Lab por sus útiles discusiones y críticas constructivas, y a Abigail Antoine por la revisión del manuscrito. Este trabajo fue financiado por un premio de MH095768 R00 de los NIH a LAL.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
plusTipTracker softwareDanuser Labhttp://lccb.hms.harvard.edu/software.htmlEste software puede estar alojado en otro sitio web en el futuro.  Si el sitio listado no existe, busque "Danuser Lab Software" en un motor de búsqueda web para encontrar el sitio.
Software de MATLABMathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/

Referencias

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