Artículo de método

Usando plusTipTracker Software a Medida microtúbulos dinámica en Xenopus laevis Conos de Crecimiento

DOI:

10.3791/52138

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7 de septiembre de 2014

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1Department of Biology, Boston College

En este artículo

Resumen

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El paquete de software basado en MATLAB código abierto, plusTipTracker, se puede utilizar para analizar series de imágenes de fluorescencia + Filtros marcado para cuantificar la dinámica de microtúbulos.

Resumen

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Microtúbulos (MT) plus de fin de seguimiento de las proteínas (+ consejos) localizar a las crecientes más-extremos de MTs y regulan la dinámica de MT 1,2. Uno de los consejos más conocidos y utilizados ampliamente + para el análisis de la dinámica de MT es la proteína, EB1 Fin de Unión, que une a todos los que crecen MT plus-extremos, y por lo tanto, es un marcador para la polimerización MT 1. Muchos estudios de comportamiento EB1 dentro conos de crecimiento se han utilizado mucho tiempo y, métodos tendenciosos mano de seguimiento con ayuda de computadora para analizar individuo MTs 1-3. Nuestro enfoque consiste en cuantificar los parámetros globales de la dinámica de MT utilizando el paquete de software, plusTipTracker 4, tras la adquisición de alta resolución, imágenes en directo de EB1 etiquetados en los conos de crecimiento embrionarias cultivadas 5. Este software es un código abierto, paquete basado en MATLAB, fácil de usar que combina la detección automática, el seguimiento, la visualización y el análisis de las películas de + Filtros marcadas con fluorescencia. A continuación, presentamos el protocolo para el uso de plusTipTracker para el análisis de los cometas TIP marcadas con fluorescencia + en los conos de crecimiento laevis cultivadas Xenopus. Sin embargo, este software también puede ser utilizado para caracterizar la dinámica de MT en diversos tipos celulares 6-8.

Introducción

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El objetivo de este método es la obtención de información cuantitativa respecto a los microtúbulos (MT) plus de fin de seguimiento de la dinámica en los conos de crecimiento que vive proteína (+ TIP). MT + consejos son un grupo de proteínas que se localizan en las plus-extremos de los MT 9,10. Llevan a cabo una serie de funciones para regular los parámetros de MT inestabilidad dinámica 11, como los porcentajes de polimerización, la catástrofe, y el rescate. Un método muy usado para el análisis de la dinámica de MT es realizar un seguimiento del comportamiento de la EB1 TIP +, que se une específicamente a la creciente MT plus-termina 1,12.

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Protocolo

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Este protocolo y el vídeo tienen el propósito de servir como un compañero al documento original que describe el paquete de software en más detalle 4, así como el informe técnico que acompaña la descarga del software en el sitio web Danuser Lab. Se anima a los lectores a revisar estos documentos cuidadosamente si hay preguntas adicionales con respecto al uso del software.

1. Antes de Análisis de Imágenes

  1. Convertir cada película de lapso de tiempo en una secuencia de TIFF (Tagged Image File Format) archivos de imagen. Si hay varios conos de crecimiento / células en una película dada, primera cosecha de cada cono de cre....

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Resultados

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El uso de este software aquí descrito ofrecer varios archivos de información que cuantifican + dinámica TIP en las células vivas.

Los plusTipGetTracks función identifica las pistas (utilizando la configuración de ejemplo que se muestran en la Figura 1) y, a continuación, proporciona parámetros respecto a las pistas TIP +. Para ver la información que el software ha obtenido, vaya al directorio roi_X que se creó en el paso 2.2. La carpeta "hazaña" contiene "overlayImages", que.......

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Discusión

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PlusTipTracker proporciona una interfaz de usuario sencilla, gráfica para detectar de forma rápida y automática prácticamente todos los cometas visibles EB1-GFP en un cono o el crecimiento celular, vincular las cometas en pistas, y calcular los parámetros de MT. Otras publicaciones han informado el diseño de tipos similares de software (por ejemplo, Marx et al. También utilizó el análisis cuantitativo de la dinámica de EB1 marcadas en los conos de crecimiento 18). Pero, este programa parece ser único.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Agradecemos al Dr. Gaudenz Danuser y a los miembros de su laboratorio por crear el software plusTipTracker y por la útil discusión sobre el uso del software, en particular a Maria Bagonis y Sebastien Besson. Agradecemos especialmente al Centro de Medios de Boston College por su asistencia y apoyo en la creación y edición del video. También agradecemos a los miembros del Lowery Lab por sus útiles discusiones y críticas constructivas, y a Abigail Antoine por la revisión del manuscrito. Este trabajo fue financiado por un premio de MH095768 R00 de los NIH a LAL.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
plusTipTracker softwareDanuser Labhttp://lccb.hms.harvard.edu/software.htmlEste software puede estar alojado en otro sitio web en el futuro.  Si el sitio listado no existe, busque "Danuser Lab Software" en un motor de búsqueda web para encontrar el sitio.
Software de MATLABMathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/

Referencias

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  1. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
  2. Lee, H., et al.

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Etiquetas

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