Snabb och Robust analys av cellulär och molekylär Polarisering inducerad av Chemokine Signa

Abstract

Celler svarar på chemokin stimulering genom att förlora sin runda form i en process som kallas polarisering, och genom att ändra subcellulära lokalisering av många proteiner. Klassiska avbildningstekniker har använts för att studera dessa fenomen. Dock krävs det manuell förvärv av många celler följt av tidskrävande kvantifiering av morfologin och samlokalisering av färgning av tiotals celler. Här är en snabb och kraftfull metod som beskrivs för att studera dessa fenomen på prover som består av flera tusen celler med hjälp av en bild flödescytometri teknik som kombinerar fördelarna med ett mikroskop med de av en cytometer. Använda T-lymfocyter stimulerade med CCL19 och färgning för MHC klass I-molekyler och fintrådiga aktin, är en grindstrategi som presenteras för mätning samtidigt graden av formförändringar och omfattningen av samlokalisering av markörer som påverkas av CCL19 signalering. Dessutom har denna gating strategi tillät oss att Observe segregeringen av fintrådiga aktin (längst fram) och fosforyleras Ezrin-radixin-moesin (fosfor-ERM) proteiner (baktill) i polarise T-celler efter CXCL12 stimulering. Denna teknik var också nyttigt att observera den blockerande effekt på polarisering av två olika delar: hämning av aktin polymerisation av en farmakologisk hämmare och uttryck av mutanter av Par6 / atypiska PKC signaleringsvägen. Således är bevis visat att denna teknik är användbar för att analysera båda morfologiska förändringar och protein omfördelningar.

Introduction

Kemokiner är små lösliga proteiner som lockar celler till specialiserade platser ^1. Därför deltar de i rätt placering av celler i vävnader, en avgörande funktion i utvecklingen och fysiologi. Immunförsvaret är inget undantag från denna regel eftersom det bygger på effekten av många olika celltyper som samverkar om att montera ett effektivt immunsvar. Genom att kontrollera den specifika platsen av en immuncelltypen i ett givet tillstånd, kemokiner är pre-krävs innan främmande antigener kan detekteras och neutraliseras.

I T-lymfocyter i synnerhet, kemokiner binder till specifika ytreceptorer som, vid ingrepp, framkallar många intracellulära signaler (kalcium rise, ERK fosforylering, Rho GTPaser aktiverings, ökning av integriner affinitet och cytoskelettala förändringar) som gynnar T cellmotilitet ^2,3. På cellnivå, kan man observera morfologiska förändringar framkallade vid chemokin stimulering.Dessa förändringar i cellformer är särskilt dramatisk i T-celler: vilande T-celler har en pärlliknande rund morfologi när de reser i blodet. Dock är avkänning av förekomsten av kemokiner i inflammatoriska ställen eller vid närhet lymfoidorgan kommer att ändra formen på T-celler som nu antar en typisk "handspegel" morfologi bestående av en bipolär formen: en framkant på framsidan och en bakkant, eller uropod, på baksidan ^4. Dessutom kan intracellulära komponenter segregerar in i dessa två motsatta områden av en polariserad T-cell för att upprätthålla migrering. Exempelvis aktinfilament polymerisationsförfaranden ökar vid kemokin stimulering ⁵ och polymeriserad aktin ackumuleras på framsidan av en polariserad T-cell ^2. Å andra sidan, flera proteiner, såsom fosforylerade proteiner hos Ezrin-radixin-moesin (ERM) -familjen som kopplar plasmamembranet till det kortikala F-aktin cytoskelettet, åter lokalisera vid uropod av polariseradT-celler ^6. Intressant nog har vi och andra visat att denna polarisering process krävs för T-cell migration. I själva verket kommer någon behandling som stör polarisering hämma cellulär motilitet. Till exempel, hämning av aktiviteten av medlemmarna i den atypiska proteinkinaser C (PKC) familj, PKCζ och PKCι blockerar T-cell polarisering och deras vandrande skann av dendritiska celler ^7. T-cell polarisering regleras också av Rho GTPaser. Vi har visat att moduleringen av RhoA aktivitet genom den nyligen beskrivna Fam65b protein stör T-cellförändringar i morfologi och deras förmåga att migrera i en Transwell-analys ^6. Som polarisering är en förutsättning steg för cellulär motilitet är det alltså viktigt att kunna kvantifiera det som en huvud avläsning av kemokina svar. Cell form förändringar tidigare uppmätta manuellt ^8. Emellertid är denna typ av kvantifiering mycket tidskrävande, så att vanligen endast ett fåtaltiotals celler beaktas.

Här används en ny metod presenteras för att snabbt kvantifiera graden av form förändringar av T-lymfocyter exponerade för kemokin stimulering. En bild flödescytometri teknik (se tabell av särskilda reagenser / Utrustning) används, vilket kombinerar fördelarna med en flödescytometer och ett mikroskop ⁹ att kvantifiera effektivt mängden polarise celler i olika förhållanden kemokin stimulering. Förutom kvantifiering av de morfologiska förändringar som man kan mäta kraftigt med denna teknik är det också möjligt att utvärdera förändringar i subcellulära lokalisering av vissa proteiner vid chemokin signalering.

Protocol

1. Framställning av T-lymfocyter

1. Förbered primär mus eller humana T-celler, såsom beskrivits ^10,11.
2. Odla humana T-celler i komplett RPMI-medium med 10% humant serum AB vid en densitet av 2-3 x 10 ⁶ celler / ml.
   OBS: Användning av fetalt kalvserum (FCS) i stället för humant serum kan framkalla spontan polarisation av en stor fraktion av humana T-celler i odling. Förvara dessa celler i odling under 4-5 dagar och ytterligare process dem när som helst under denna period.
3. Upprätt mus-T-celler i komplett RPMI-medium kompletterat med 10% FCS vid en liknande celldensitet. Använd direkt eller nästa dag, efter ett O / N kulturen vid 37 ° C i närvaro av 10 ng / ml IL7.
4. Odla CEM human T-cellinje i fullständigt RPMI kompletterat med 10% FCS.

2. Chemokine Stimulering

1. Tvätta 5 x 10 ⁵ celler per experimentell betingelse i varmt HBSS-medium kompletterat med 10 mM Hepes. För vissa experiment, sam-transfektera primära humana T-celler dagen innan med 2 ug pmaxGFP och 8 pg pcDNA3.1 ⁺ (tom vektor, kontroll), PKCζ kinasdött, eller N-terminala Par6 plasmider.
2. Resuspendera cellpelleten i varmt HBSS-Hepes-medium (använd 0,3 ml x antal experimentella betingelser).
3. Fördela celler i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
   OBS: Därför kommer en slang som motsvarar en enda försöksbeting innehålla 5 x 10 ⁵ celler i 0,3 ml HBSS-Hepes-medium. För vissa experiment till 500 nM Latrunculin A eller vehikel (DMSO) och inkubera cellerna under 30 min innan kemokin stimulering.
4. Lägg 10 till 500 ng / ml CCL19 eller CXCL12 kemokin i varje rör.
   OBS: Vi använder vanligtvis 10-200 ng / ml kemokin för humana T-celler. CEM-celler uttrycker inte CCR7 receptor som binder CCL19. Därför kommer CEM celler endast kunna svara på en CXCL12 stimulering. Dessutom använder högre kemokina koncentrationer (300-500 ng / ml) för att polarisera mus-T-celler.
5. Vänd rören flera gånger och inkubera dem i ett 37 ° C vattenbad i 8 eller 10 min för primära T-celler eller CEM, respektive.
6. Stoppa polariseringsprocessen genom att till varje rör 0,3 ml av en varm lösning innehållande 2% paraformaldehyd (PFA) och 10 mM Hepes i PBS. Vänd rören och inkubera dem vid 37 ° C under 5 min.

3. stainings

1. Överför cellerna från mikrocentrifugrör att flödescytometri rör.
2. Fyll rören fullständigt med en RT-lösning innehållande 1% bovint serumalbumin (BSA), 0,5 mM EDTA och 10 mM Hepes i PBS.
3. Centrifugera rören vid 460 xg under 4 minuter.
4. Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 | il av en RT-lösning innehållande 5% FCS i PBS.
5. Tillsätt 5 ìl av FITC-anti-HLA-ABC i varje rör, virvel dem, och inkubera dem i 30 minuter vid RT, borta från ljus.
6. Tvätta cellerna en gång med PBS innehållande 5% FCS, ennd gång med enbart PBS.
7. Vid RT: lägg 500 pl 1% PFA, inkubera i 10 min, därefter tvätta cellerna med en lösning innehållande 1% BSA, 0,5 mM EDTA och 10 mM HEPES i PBS.
8. Kasta bort supernatanten, fylla rören fullständigt med en lösning av PBS innehållande 0,2% BSA, 0,1% saponin, 0,5 mM EDTA och 10 mM Hepes (permeabilization buffert).
9. Tvätta cellerna två gånger i detta medium.
10. Vänd rören för att avlägsna mediet och vortexblanda dem att dissociera cellpelleten.
11. Lägg 0,25 | ig / ml TRITC-Phalloidin och / eller en 1: 100 utspädning av anti-P-ERM antikropp till varje rör, vortexa dem och inkubera under 30 min vid RT.
12. Tvätta cellerna med permeabilization buffert. Inkubera med en fluorescerande sekundär antikropp vid behov.
13. Resuspendera cellerna i 200 pl PBS och överföra dem till mikrocentrifugrör.
    OBS: Celler är redo för förvärv. Alternativt, samtidigt som en maximal total volym på 200 l per rör, lägga koncentrerad PFA till en slutlig 1%koncentration för att bevara de färgningar om cellerna inte ska användas samma dag för vidare bearbetning.

4. Bilder Förvärv och analys

1. Slå på apparaten (se tabell av särskilda reagenser / Utrustning) och låt den kalibrerar sig enligt tillverkarens anvisningar.
   OBS: Inspire programvara användes med ett 40X objektiv (0,75 NA). Idéerna 3,0 mjukvara användes för alla de rapporterade kvantifieringar.
2. Bered en serie av förvärvs fönster som kan sparas i en mall för framtida experiment. Rita histogram som kvantifierar RMS Lutningsvärden. Från "I fokus" befolkningen, väljs på RMS lutning histogram, avgränsa den "Single cell" population på ett histogram av området. När mikrocentrifugrör har satts in i maskinen, justera lasereffekten, grind på enskilda celler och förvärva 5.000 T-lymfocyter.
3. I Idéer mjukaware, öppnar förvärvet filen och skapa ett histogram som visar värdet av gradienten RMS-värdet för ljusa fält bilder (kanal 1) erhålls för varje enskild cell. Rita en grind på RMS lutning histogram som anser celler uppvisar RMS lutning värde över 57.
   OBS: RMS gradienten tillåter tar hänsyn till i analysen endast de T-lymfocyter som finns i fokalplanet. Vi har fastställt empiriskt att enskilda celler som uppvisar en RMS-gradientvärde överlägsen 57 är i fokalplanet, och kan noggrant beaktas.
4. I Analys / Masker menyn, skapa en ny mask, som kallas Erode (M01,2) från morfologin masken på bright bilderna M01, eroderade av 2 pixlar. Därefter, i Analys / Funktioner menyn, skapa en ny funktion i området, beräknat på Erode (M01,2) mask. Från cellerna som valts i föregående porten, öppna ett histogram som visar området med celler som använder denna nyskapade mask.
   OBS: morfologin masker som är tillgängliga genomdefault är mycket större än den faktiska storleken på cellen. Sålunda är det mer exakt för att erodera det upp till två pixlar.
5. Rita en grind på de individuella T-celler, exklusive kalibrerings pärlor och skräp (liten Area) och dubbletter (stora Area). Justera denna grind vid varje förvärv.
   OBS: Avvikelser i cellstorleken kommer att påverka läget för porten. Såsom mus-T-celler är mindre än humana T-celler, som i sig själva är mindre än CEM-celler, kommer området för varje celltyp vara proportionell mot dess storlek.
6. Med tanke på de enskilda, i-fokus celler som gated vid föregående steg, öppna ett punktdiagram som består av Raw Max Pixel på HLA-ABC färgning (kanal 2, x-axeln) som funktion av Raw Max Pixel på phalloidin färgning (Channel 4, y-axeln). Skapa en grind för att utesluta de ofärgade eller mättade fluorescerande händelser. Öppna två histogram som visar Raw Max Pixel för HLA-ABC (kanal 2) och phalloidin (Channel 4) färgningar.
7. I Analys / Masker menyn, createa ny mask, som kallas Erode (M02,2) från morfologin masken av HLA-ABC färgade celler (kanal 2), eroderade av 2 pixlar. Därefter, i Analys / Funktioner menyn, skapa en ny funktion som består av cirkelparametern, beräknat på Erode (M02,2).
   OBS: Denna parameter mäter avvikelsen av cellformen från en cirkel. Därför kommer en helt rund T-cell har en hög cirkularitet värde medan långsträckta polarise celler kommer att uppvisa en låg cirkularitet index.
8. Därefter skapa en annan histogram som kommer att rapportera värdena för cirkel funktionen från de tidigare gated cellerna. Använd detta histogram att direkt rita fördelningen av en individ, i-fokus cellpopulation i enlighet med värdet av cirkulariteten för varje enskild cell.
9. Om man tittar på formen på histogrammet för icke-stimulerade celler, dra en grind för polarise celler, med början på den lägsta cirkelvärdet upp till cirkel gränsvärdet där de flesta av de icke-stimulerade cellerplottas. Titta på statistiken display för andelen polarise celler bland gated befolkningen (% Gated).
   OBS: Vi har satt denna grind för indexcirkel värden under 13.
10. För att titta på polarisationen av aktin-färgning i cellerna, rita ett histogram för den ljusa detaljer Likhet R3 värde, jämföra den HLA-ABC-färgning (kanal 2) och falloidin-färgning (kanal 4).
    OBS: Ju större värdet av denna funktion, desto mer överlagrade de två färgningar är.
11. Med samma gating strategi som tidigare, rita en grind på de icke-stimulerade celler för åtskild färgning som visar andelen celler med polariserad aktin färgning.
12. När det är klart, är procentandelen celler uppvisar en segregation i fördelningen av MHC klass I och phalloidin färgningar, andelen polarise celler tillsammans med medelvärden för cirkel och likhet index alla celler ± SD visas i CORRESPonding statistik paneler.

Representative Results

Det första exemplet väljs här gäller användningen av mänskliga primära T-lymfocyter som stimulerats med CCL19. Emellertid kan samma strategi användas med primär mus-T-celler, T-cellinjer eller någon annan celltyp som reagerar för kemokin stimulering. Strategin gating presenteras här innehåller en rad fönster som väljer de fokuserade händelser, då de enskilda cellerna. Slutligen intervallet fluorescensintensitet följes här som ett exempel på två markörer: MHC klass I HLA-ABC och filamentös aktin för att vila (figur 1) eller CCL19-stimulerade (figur 2) T-lymfocyter.

Först cirkulariteten index mätt i obehandlade (figur 1) eller CCL19-stimulerad (Figur 2) T-lymfocyter. Det faktum att vilande celler har stor enkel topp med ett högt cirkelindexvärde indikerar att de flesta celler är nära att runda. Det är emellertid klart att CCL19 stimulering framkallar uppkomsten ofa andra subpopulation av celler med ett lågt cirkularitet index. Denna subpopulation omfattar celler som har antagit en polariserad morfologi. Även när representerar Bright Detail Likhet index mellan HLA-ABC och F-aktin färgning, kan man konstatera att vissa celler uppvisar en nedgång i värdet på detta index på CCL19 behandling, vilket tyder på att båda markörerna visar en lägre grad av samlokalisering . Intressant från dot-tomter presenterade tidigare, kan man placera markören på någon särskild punkt för att få en bild av cellen består av en ljusfältsbild och en bild för varje färgningar utförda. Figur 3 därmed redovisar exempel på CCL19 stimulerade T lymfocyter som faller i porten icke polariserad (Figur 3A) eller polarise (Figur 3B) celler. Man kan tydligt visualisera skillnaderna i morfologi mellan de båda subpopulationer. Från statistik tabellerna under cirkel histogram från figurerna 1 2, kan en plotta procentandelen celler som faller i den polariserade porten i frånvaro eller närvaro av CCL19 (figur 3C). Som förväntat, är det tydligt att kemokin stimulering ökar den procentuella andelen av polarise T-celler (från 11,2% till 50,6%). Man kan också rita medelvärdet cirkularitet index för hela cellpopulationen som erhölls i båda villkoren (Figur 3D). CCL19 stimulering framkallar en droppe i detta index. Emellertid, eftersom endast hälften av cellerna är polariserad, är förändringen i den genomsnittliga cirkularitet indexet observeras vid CCL19 stimulering liten.

Likaså Figur 4 representerar exempel på CCL19-stimulerade celler, i vilka både HLA-ABC och F-aktin infärgningar göra (Figur 4A) eller som inte colocalize (Figur 4B). Från statistik tabellerna nedan de ljusa detaljer Likhet histogram som visas i figur 1 och 2, kan man få den andelav celler som uppvisar ett indexvärde under 1,5, vilket motsvarar de celler som uppvisar en mycket låg grad av samlokalisering mellan HLA-ABC och F-aktin. Figur 4C visar att den del av celler som faller i denna port ökar vid CCL19 stimulering ( från 3,4% till 13,9%). Uppsamling av de värden för index för varje individuell cell, kan en också plotta medelvärdet Bright Detalj Likhet index för hela cellpopulationen som erhölls i båda villkoren (Figur 4D). CCL19 framkallar en droppe i index är dock av samma skäl som tidigare, förändringarna är små. Genom att titta på bilderna av motsvarande celler, verkar det som denna nedgång i HLA-ABC - F-aktin samlokalisering beror främst på att gruppera F-aktin i en pol av cellen. Omvänt gäller att subcellulära distributionen av HLA-ABC MHC klass I-molekyler verkar inte vara grovt påverkas av CCL19 stimulering.

Det är anledningen till att vi nästa beslutat att testa ytterligaremetodiken genom att analysera två markörer (F-aktin och fosfor-ERM) kända för att segregera i motsatta poler av kemokin-stimulerade T-celler. Humana T-celler stimulerade med CXCL12 polariserat starkt som kvantifieras i Figur 5A med samma grindningsstrategi än tidigare (från 5,95% till 79,10% polarise celler efter 8 min av stimulering med 50 ng / ml CXCL12). Under dessa förhållanden, det finns en stark minskning av den genomsnittliga Bright Detail Likhet index som visas i figurerna 5B och 5D, vilket innebär att F-aktin och fosfor-ERM colocalize mindre efter CXCL12 stimulering. Som förväntat, är den procentuella andelen av celler som uppvisar en segregering av markörerna valda här högre (48%, Figur 5C), jämfört med de som tidigare studerats (14%, Figur 4C). Följaktligen är nedgången i den genomsnittliga Likhet index för varje tillstånd också mer uppenbart (figur 5D). Därför bildflödet tekniken cytometry presenteras här är susam att kvantifiera graden av samlokalisering av två färgningar i olika miljöer.

Slutligen beslutade vi att belysa i vilken utsträckning den störning av vissa cytoskeletal element eller signalväg känd för att påverka förändringar i T-cell morfologi vid kemokinet stimulering, kan mätas genom avbildning flödescytometri. Kontroll T-celler först jämfört med några förbehandlade med aktin störande läkemedel latrunculin A (figur 6A). Celler stimulerades med CXCL12, färgas med fluorescerande phalloidin och analyseras genom avbildning flödescytometri. Histogram visar Råmaterial Max pixelintensiteten av F-aktin-färgning visas för båda cellpopulationer (figur 6A, överst). Som förväntat från den avskärande aktivitet latrunculin A mot aktinfilament, är intensiteten hos den falloidin färgning lägre i dessa celler (höger panel) jämfört med kontroll T-lymfocyter som behandlats med vehikeln DMSO (vänster panel). Dessutom latrunculin A-treated T-celler uppvisar en större cirkel index indikerar att de förblir rundare än kontrollceller (Figur 6A, botten). Detta kan kvantifieras genom en grind inställd på histogrammen för att mäta procentandelen celler som uppvisar morfologiska förändringar. Även 32% av kontrollceller får polariserat i detta skick, endast 10% av latrunculin En -behandlat T lymfocyter uppvisar några förändringar form (Figur 6B). Därför visas det här som bild flödescytometri teknik är lämplig för att mäta skillnader i morfologiska förändringar när man studerar den potentiella effekten av vissa cytoskelettala element i detta fenomen.

För det andra förvärvet av ett stort antal celler med denna metod öppnar också möjligheten att analysera snabbt små delmängder av celler som finns som en minoritet. I figur 7 visas ett exempel presenteras där vår analys är särskilt begränsad till beteendet hos T-celler co-transfekteraed med GFP tillsammans med plasmider som kodar för dominerande negativa mutanter av polariteten komplexet Par6 / PKCζ. Histogrammet motsvarar de icke-transfekterade celler har tillåtit oss att grinden specifikt på den relevanta GFP ⁺ T-celler (figur 7A, vänster). Intensiteten av GFP mätt som histogram som kvantifierar fördelningen av fluorescensintensiteten hos kanalen 2 visar faktiskt att endast en liten bråkdel av hela cellpopulationen har transfekterats (figur 7A). Graden av morfologiska polarisering av dessa transfekterade celler kvantifierades sedan genom att mäta endast cirkulariteten index för GFP ⁺ celler (figur 7B). En extra port för T-celler som uppvisar låga värden av cirkel tillät uppskattning av andelen polarise celler i varje tillstånd (figur 7C). Resultaten visar att störning av funktionen hos Par6 / PKCζ signalväg inhiberade T-cells polarizatipå inducerad av både CCL19 och CXCL12 kemokiner, i linje med våra tidigare fynd ^7.

Figur 1. Representativa icke-stimulerad färgningsresultat på primära humana T-celler. Den övre vänstra panelen visar histogrammet fördelningen av Gradient RMS beräknas med M01 masken på ljusa fält bilder (kanal 1). Den övre högra panelen visar området för M01 masken eroderade av 2 pixlar, baserat på de ljusfält bilder (kanal 1) av In Focus cellerna gated från föregående tomten. De mellersta panelerna visar Raw Max Pixel värden för både HLA-ABC och falloidin färgningar (Kanaler 2 och 4, respektive) antingen som ett punktdiagram (till vänster) eller som histogram (mitten och höger paneler) för den enskilde, in- fokusera celler valda vid föregående steg. Från denna population av enskilda, i-fokus celler med korrekt färgning, beräknas den cirkel funktionen på M02 masken eroderade av 2 pixlar i HLA-ABC färgning (nedre vänstra panelen) och Bright Detalj Likhet R3-funktionen (nedre högra panelen) som visar graden av likhet mellan HLA-ABC och phalloidin färgningar . För dessa två senaste tomter, statistik som visar fördelningen av befolkningen (% gated, menar den funktionen, SD) anges i en tabell nedan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2:. Representativa färgningsresultat på primära humana T-celler stimulerade med 200 ng / ml CCL19 under 8 min Strategin panelen layout och grind är identisk med fig 1.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Kvantifiering av den morfologiska status T-lymfocyter som stimuleras av CCL19. (A, B) Exempel på celler från figur 2 utanför eller i "polariserad" gate, respektive (C) Histogram visar andelen polarise T-celler som erhållits i frånvaro av CCL19. (Figur 1, -) eller med 200 ng / ml CCL19 (Figur 2, +) (D) Histogram representerar medelvärden av cirkulariteten indexet ± SE hos individen, i-fokus cellpopulation i frånvaro. (-) eller närvaro (+) av CCL19. *** P <0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Kvantifiering av graden av samlokalisering mellan HLA-ABC och phalloidin färgningar. (A, B) Exempel på celler från figur 2 utanför eller i "inte samlokaliserades" gate från Bright Detalj Likhet histogram, respektive. (C) Histogram visar andelen T-celler som uppvisar ingen samlokalisering mellan båda markörerna i oför stimulerad (-). eller CCL19 stimulerad (+) förhållanden (D) Histogram representerar medelvärden av likheten index ± SE hos individen, i-fokus cellpopulation i frånvaro (-) eller närvaro (+) av CCL19. *** P <0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

p-together.within-page = "always">
Figur 5. Analys av F-aktin - fosfor-ERM utanförskap på CXCL12 stimulering av humana primära T-celler. (A) Andel polarise T-celler i frånvaro eller närvaro av CXCL12 (10 eller 50 ng / ml). (B) Imaging flödescytometri histogram som visar fördelningen av den enskilde, i-fokus cellpopulation enligt Bright Detail Likhet index som jämför omfattningen av samlokalisering mellan Fosfor-ERM och falloidin färgningar, i avsaknad av CXCL12 eller med 10 ng / ml eller 50 ng / ml CXCL12. (C) Kvantifiering av andelen celler som uppvisar ingen co-lokalisering av Perm och falloidin färgningar i T-cellerna stimulerades eller inte med CXCL12. (D) Kvantifiering av medelvärdena av likheten indexet ± SE i varje tillstånd. *** P <0,001.ladda upp / 52140 / 52140fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. Effekt av aktin polymerisation på T-cell polarisering. (A) F-aktin färgningsintensitet (övre fält) och cirkularitet (lägre paneler) av primära humana T-celler behandlade med Latrunculin A (500 nM, 30 min) eller DMSO och stimulerades sedan med 100 ng / ml CXCL12 i 8 min. ( B) Histogram visar andelen polarise T-celler som behandlats med DMSO eller Latrunculin A efter 8 min av stimulering med CXCL12. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7. Expression av PKCζ kinasdöda mutant eller den N-terminala mutant av Par6 blockerar T-cell polarisering efter CCL19 eller CXCL12 behandling. (A) Imaging flödescytometri histogram som visar uttrycket intensitet av GFP, i icke-transfekterade primära T-celler eller primära T-celler sam-transfekterades med GFP och en tom vektor (kontroll) eller den kinasdöda mutanten av PKCζ eller den N-terminala del av Par6 (B) Imaging flödescytometri histogram representerar cirkulariteten index av GFP-positiva cellpopulation som uttrycker de olika konstruktionerna på den basala nivån (NS: Ingen stimulering). eller efter CCL19 eller CXCL12 stimulering (100 ng / ml för 8 min ). (C) Kvantifiering av andelen morfologiskt polarise T-celler som uttrycker de olika konstruktionerna på basnivå eller efter CCL19 eller CXCL12 stimulering. Klicka här för att se en större versionsionen av denna siffra.

Discussion

Med hjälp av en ny teknik för bild flödescytometri, en snabb och informativ gating strategi för att analysera cellulära och molekylära händelser som framkallas av kemokin stimulering presenteras. Från ett enda experiment, kan man få två huvudtyper av information: förändringar i cellmorfologi inducerade av kemokin stimulering och subcellulära fördelningen av olika proteiner under polariseringsprocessen. Intressant är bevis också för möjligheten att analysera ett stort antal celler, vilket möjliggör statistisk robusthet och relevant analys av en liten del av hela cellpopulationen. Som rapporterats, kan denna teknik också användas för att analysera molekylära omfördelningshändelser i samband med den immunologiska synapsen ^12. Dessutom har en liknande uppsättning upp redan använts för SDF1-stimulerade T-celler, men ingen analys av graden av samlokalisering mellan två markörer har lämnats ^13.

Ävendenna teknik kan därför vara lämpligt för många celltyper, vidhäftande celler inte direkt analyseras och celler i suspension måste fastställas före förvärvet. Utöver dessa inneboende begränsningar hos maskinen, är det viktigt att hålla cellerna vid 37 ° C vid stimulering dem. Temperaturen är verkligen nyckeln för att uppnå rätt T-cell polarisering eftersom cytoskelettala förändringar, såsom aktin polymerisation som driver formförändringar, är mycket beroende av temperaturen. Våra experiment med latrunculin A behandlade cellerna bekräftar att korrekt aktin ombyggnad inducerad av kemokinet stimulering är verkligen avgörande för en cell för att uppnå sitt helt polariserat tillstånd. Utöver de uppgifter som lämnats här med denna drog, testade vi också bild flödescytometri teknik med humana primära T-lymfocyter transfekterade med muterade proteiner som hämmar Par6 / PKCζ signalväg. Konsekvent med våra tidigare publicerade resultat ^7, visas det här att denna polaritet komplexa favors T-cell polarisering.

Vid chemokin stimulering, T-celler förlorar sin runda morfologi att anta en polariserad form. Vi har hittat cirkel parametern vara den mest korrekta att kvantifiera dessa morfologiska förändringar. Men andra parametrar som beskriver formförändringar som föreslås av analysprogram, t.ex. bildformat eller Elongatedness. Därför kan ett enkelt testa bidraget av en särskild signalväg eller ett specifikt protein i denna process.

I denna studie har vi alltid observerat att den procentuella andelen celler som uppvisar en morfologisk polarisation är högre än en för molekylär polarisation. Detta tyder på att en fraktion av celler som antar en förändring i morfologi inte utgör stora molekyl omfördelningar av markörerna studerats. Detta skulle kunna uppstå genom att vissa celler förlorar sin runda form så de uppvisar en lägre cirkel index även om de inte tydligt visar ett leading kant och en uropod. Dessa delvis polarise T-celler kan fortfarande falla i porten till morfologiskt polarise T-celler utan att presentera tydliga molekylära omfördelningar av typiska markörer. Dessutom skillnader i kemokinet signalerar tröskeln som skulle kunna vara högre för markörer omfördelning än för formförändringar kan också förklara dessa skillnader.

Det visas också här att HLA-ABC markör inte relocalized i polarise T-celler och det finns ingen förändring i intensiteten av denna färgning vid CCL19 stimulering. Omvänt är en bekräftelse ges här att F-aktin färgnings ökar vid CCL19 behandling (figur 1 och 2) som redan är känt, eftersom kemokin stimulering aktiverar aktin polymerisation ^5. Dessutom visas att aktinfilament få relocalized på framsidan av polarise celler. Följaktligen Bright Detail Likhet index som mäter omfattningen av samlokalisering mellan både markers tenderar att minska vid CCL19 stimulering. Som en jämförelse, är en sådan analys ges här för graden av F-aktin samlokalisering med fosfor-ERM proteiner som får undantas från cell fronten. Andelen kemokin-stimulerade T-celler som uppvisar F-aktin - MHC klass I segregationen är mycket lägre än den för F-aktin - fosfo-ERM (14% vs 48%, respektive), eftersom F-aktin relocalizes fram och fosfor-ERM proteiner på baksidan av polarise T-celler, medan fördelningen av MHC klass I-molekyler inte påverkas av kemokin stimulering. Denna ljusa Detail Likhet index kan således användas systematiskt för att jämföra fördelningen av två markörer i polarise T-celler. Därför är denna teknik mycket lämpligt att kvantifiera graden av samlokalisering eller samtidig uteslutning av två olika markörer på ett stort antal celler eller, potentiellt, i sällsynta händelser som förekommer i en bred cellpopulationen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis