Describimos un método para generar un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística. Utilizamos peces Tg(wt1b:GFP) para visualizar la estructura del riñón. La eliminación de wnt5a se realizó mediante inyección de morfolino. Se observó la formación de quistes pronefricos después del derribo de wnt5a en este pez cebra transgénico GFP.
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Artículo de método
Un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística: Derribo de Wnt5a Causas Los quistes en el pez cebra Riñones
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Resumen
Resumen
La enfermedad renal poliquística (PKD) es una de las causas más comunes de enfermedad renal terminal, una enfermedad devastadora para la que no hay cura. Los mecanismos moleculares que conducen a la formación de quistes en la PKD siguen siendo algo inciertos, pero se cree que muchos genes están involucrados. Wnt5a es una glicoproteína no canónica que regula una amplia gama de procesos de desarrollo. Wnt5a funciona a través de la vía de polaridad de células planas (PCP) que regula la división celular orientada durante la elongación de las células tubulares renales. Se ha descubierto que los defectos de la vía PCP causan la formación de quistes renales. Nuestro artículo describe un método para desarrollar un modelo de enfermedad renal quística del pez cebra mediante la eliminación del gen wnt5a con oligonucleótidos de morfolino (MO) antisentido wnt5a. Se utilizaron peces cebra transgénicos Tg (wt1b:GFP) para visualizar la estructura renal y los quistes renales después del derribo de wnt5a. Se utilizaron dos MO antisentido distintos (AUG - y sitio de empalme) y ambos dieron lugar a un fenotipo de cola rizada hacia abajo y formación de quistes después del derribo de wnt5a. La inyección de ARNm Wnt5a de ratón, resistente a los MOs debido a una diferencia en la estructura del par de bases primarias, rescató el fenotipo anormal, demostrando que el fenotipo no se debía a efectos "fuera del objetivo" del morfolino. Este trabajo apoya la validez del uso de un modelo de pez cebra para estudiar la función de wnt5a en el riñón.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio), los embriones se han usado ampliamente como un modelo para estudiar el desarrollo del riñón y enfermedad renal poliquística. Hay muchas ventajas en el uso del pez cebra como modelo animal: la viabilidad de estudiar las interacciones genéticas, la capacidad de utilizar morfolinos antisentido (MO) durante caída de proteínas, la oportunidad para ensayar rápidamente un gran número de embriones, y la facilidad de ver fenotipos de órganos en larvas 1 viviente. Los pronefros es el primer riñón para desarrollar en los vertebrados y es funcional en larvas de pez cebra 2. La estructura de los pronefros pez cebra es rel....
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Protocolo
Declaración de Ética: NOTA: Todos los experimentos de pez cebra fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en la Eastern Virginia Medical School.
1. Preparación morfolino
- Diseño y síntesis de traducción-bloqueo (aumentación) y el empalme de inhibición (Splice-) morfolino anti-sentido (MO) oligonucleótidos para el gen de interés según las instrucciones del fabricante (Figura 1A). Por favor, consulte la información del fabricante en la Tabla 1.
NOTA: OM se envían como acciones liofilizados en botellas de vidrio. - Añadir alto grado agua estéril a las botellas de vidrio pa....
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Resultados
Wnt5a derribar se logró mediante la introducción de traducción bloqueando MO (agosto-MO) o el exón / intrón empalme frontera MO (empalme-MO) a los embriones de pez cebra en la etapa de una célula. El AUG-MO se dirige al codón de inicio y, por lo tanto, inhibe tanto mensaje Wnt5a materna y cigóticos. El empalme de MO se dirige a la tercera sitio donador de empalme y sólo inhibe la transcripción cigóticos de Wnt5a (Figura 1A). La aumentación y morphants splice- phenocopied uno al otro co.......
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Discusión
La enfermedad renal poliquística (PKD) es una de las principales causas de enfermedad renal terminal en los seres humanos y se caracteriza por la progresiva formación de quistes, agrandamiento renal y desarrollo de túbulos anormal 14. PKD autosómica dominante (PQRAD) es una enfermedad genética en la que la mutación de cualquiera de PKD1, que codifica policistina-1 (PC1), o PKD2, que codifica policistina-2 (PC2), los resultados en los riñones poliquísticos. Muchos otros genes, especialmente los que codifican p.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el NIH (DK093625 a la LH, y DK069909 y DK047757 a JHL) y la Administración de Veteranos (Premio al Mérito I01BX000820 a JHL). Nos gustaría agradecer al Dr. Michael paquete y el Dr. Jie Él en la Universidad de Pennsylvania pez cebra Core para proporcionar un apoyo esencial.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.5% Fenol-Rojo | Sigma | P0290 | Indicador de color para inyección |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (personalizado) | Personalizado diseñado para el gen de interés |
| Aguja pre-tirada | Tritech Research | MINJ-PP | Si se requiere una gran cantidad de aguja, también puede comprar un extractor de agujas y preparar la aguja en el laboratorio |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | Para la transcripción in vitro para hacer ARNm tapado para el experimento de rescate |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | Para la prevención de la melanización |
| Tricaína | Sigma | A5040 | También llamado 3-aminobenzoato de etilo, para la anestesia del pez cebra |
| Metil celulosa | Sigma | M-0387 | Para la posición del pez cebra |
| Kit de purificación QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | Para la purificación de productos de PCR para la síntesis de ARN de tapa. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | para PCR |
| Tag DNA Polymerasa | Invitrogen | 10342-053 | para PCR |
| Espectrofotómetro NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | Para medir la concentración de morfolino y ARN |
| Compresor de aire | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Fuente de aire para inyección |
| Pico bomba de microinyección | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Se pueden utilizar otros tipos de sistemas de microinyección. |
| Micro-fabricante | World Precision Instruments Inc | MMJR | Diestro (MMJL para zurdos) |
| Portaagujas | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | Para sujetar la aguja para la micromanipulación |
| Pinzas Dumont | Herramientas quirúrgicas finas | 11253-20 | Para romper la punta de la aguja |
| Microscopio de disección | Leica M205C | Para la observación y la obtención de imágenes de embriones de pez cebra | |
| Microscopio de fluorescencia | Zeiss Axio Obserer D1m | Para la obtención de imágenes de pronefros de pez cebra | |
| Tubo capilar (diámetro interno de 0,15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | Para medir el volumen de cada gota inyectada |
Referencias
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn
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Reimpresiones y permisos
