Para abordar los mecanismos de desmielinización y apoptosis neuronal en lesiones corticales de trastornos inflamatorios desmielinizantes, se utilizan diferentes modelos animales. Aquí describimos un enfoque ex vivo mediante el uso de células T CD8+ específicas de oligodendrocitos en cortes de cerebro, lo que resulta en la muerte oligodendroglial y neuronal. Se discuten las posibles aplicaciones y limitaciones del modelo.
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Artículo de método
Una Ex vivo Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo
En este artículo
Resumen
Resumen
La muerte de oligodendrocitos acompañada de destrucción de neuronas y axones son hallazgos histopatológicos típicos en lesiones de materia gris cortical y subcortical en trastornos desmielinizantes inflamatorios como la esclerosis múltiple (EM). En estos trastornos, se encuentran principalmente linfocitos T CD8+ de supuesta especificidad para antígenos relacionados con mielina y oligodendrocitos, por lo que la apoptosis neuronal en lesiones de sustancia gris puede ser un efecto colateral de estas células. Se establecen diferentes tipos de modelos animales para estudiar los mecanismos subyacentes de los procesos fisiopatológicos mencionados. Sin embargo, aunque imitan algunos aspectos de la EM, es imposible diseccionar el mecanismo exacto y el curso temporal de la muerte celular neuronal "colateral". Para abordar este curso, aquí mostramos un protocolo para estudiar los mecanismos y la respuesta temporal del daño neuronal después de un ataque de células T CD8+ dirigido a oligodendrocitos. Para dirigirse solo a la vaina de mielina y a los oligodendrocitos, las células T CD8+ específicas de oligodendrocitos activadas in vitro se transfieren a cortes de cerebro aislados de forma aguda. Después de un período de incubación definido, se puede analizar el daño mielínico y neuronal en diferentes regiones de interés. Se discutirán las posibles aplicaciones y limitaciones de este modelo.
Introducción
La muerte de los oligodendrocitos y la destrucción de la vaina de mielina acompañada de pérdida de neuronas y axones son hallazgos patológicos típicos en las lesiones de sustancia gris en individuos que padecen esclerosis múltiple (EM)1,2. Las lesiones corticales se pueden dividir hasta ahora en tres subtipos diferentes2: lesiones subpiales, intracorticales y leucocorticales. En comparación con las placas de sustancia blanca, los infiltrados se caracterizan por un predominio de células T CD8+, lo que sugiere su posible papel decisivo en la inflamación de la sustancia gris3. Además, se pueden encontrar expansiones oligoclonales en la sangre, el líquido cefalorraquídeo (LCR) y dentro de las lesiones inflamatorias para las propias células T CD8+ 4-6.
En línea con esto, se supone que las células T CD8+ pueden ser específicas para diferentes proteínas de mielina7,8. De hecho, las células T CD8+ se encuentran cerca de los oligodendrocitos y las vainas de mielina9,10 que muestran la expresión11 del MHC I y, por lo tanto, podrían ser responsables de la pérdida de la vaina de mielina. Este proceso se observa a menudo junto con un extenso daño neuronal y axonal "colateral" dentro de la materia gris del sistema nervioso central (SNC)1,2. De hecho, la muerte directa e indirecta de oligodendrocitos y neuronas es inducida por las células T CD8+ a través de dos mecanismos diferentes: (i) hinchazón y ruptura de la membrana celular debido a la formación de gránulos citotóxicos tras la liberación de perforinas y granzimas y (ii) ligadura a los receptores Fas o exposición de FasL en su superficie8,12,13.
Se establecen diferentes tipos de modelos animales para estudiar el mecanismo subyacente de los procesos mencionados. En este sentido, los linfocitos T CD8+ preparados para autoantígenos con expresión inducida en células gliales del SNC, como oligodendrocitos o astrocitos, pueden transferirse adoptivamente para analizar posteriormente la muerte neuronal y axonal ''colateral'' en la sustancia gris14,15. Realizar este tipo de experimentos in vivo es de gran ayuda para imitar algunos aspectos fisiopatológicos de la EM, sin embargo, este enfoque no es adecuado para resolver el mecanismo subyacente y la cinética del daño axonal y la apoptosis neuronal.
Para superar estas restricciones, se estableció un enfoque ex vivo para estudiar los mecanismos y el curso temporal de la muerte celular neuronal después de un ataque de células T CD8+ dirigido por oligondendrocitos. Dado que solo las células inmunitarias deben dirigirse a los oligodendrocitos y, por lo tanto, a la producción de la vaina de mielina, se utilizan células T OT-I reactivas a la ovoalbúmina (OVA) restringidas a la claseI del MHC 16. Posteriormente, estas células se transfieren a trozos de cerebro obtenidos de ratones que expresan selectivamente OVA en oligodendrocitos (ratones ODC-OVA)17.
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Protocolo
Todos los experimentos con ratones se deben realizar de acuerdo con las directrices del respectivo comité de cuidado de los animales y el uso institucional.
1. Comentarios generales para experimentos con ratones
- Mantenga los ratones en condiciones libres de patógenos y les permitirá el acceso a alimentos y agua ad libitum.
NOTA: Es importante la utilización de ratones por edad y sexo en los grupos experimentales porque los patrones inmunológicos pueden variar con la edad y el género.
2. Las células T específicas de OVA Preparación y activación de CD8 + (OT-I)
- Realice la estimulación de las células T OT-I como se describe a continuación 5 días antes de la preparación de cortes de cerebro.
NOTA: 5 x 10 5 efectoras CD8 + activadas OT-I células T (células T CD8 + de ratones transgénicos que reconocen sólo el OVA 257-264 péptido en el contexto de moléculas MHC-I) se necesitan por rebanada La concentración 5 x 10 5 fue elegido experimentoaliado como uno óptima para favorecer una buena interacción célula-célula una vez que las células comienzan a migrar a la rebanada y, al mismo tiempo, la cantidad de células no es demasiado alta para inducir una reacción exagerada de una sola célula lo que permite contar 8,18. - Preparar el medio para el cultivo de células T OT-I. Suplemento 500 ml de DMEM con 5% de suero de ternera fetal (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 50 micras 2-mercaptoetanol, 1% de aminoácidos no esenciales y 25 mg / ml de gentamicina. Almacenar el medio a 4 ° C hasta su uso.
- Retirar el bazo de OT-I ratones transgénicos como por referencia 16. Transferirlos al medio preparado.
- Generar suspensión de células individuales por maceración bazos a través de un filtro de 70 micras y se centrifuga la suspensión a 300 xg durante 5 min, 4 ° C.
- Incubar suspensión de células con 5 ml de amonio-cloruro de potasio (ACK) tampón (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, EDTA 0,1 mM, pH 7,3) durante 5 min para lisar las células rojas de la sangre.
- Deje de incubatien 10 ml con medio y se centrifuga de nuevo como se describió anteriormente.
- Diluir la suspensión celular en medio y calcular números. Células de la placa a una densidad de 3 x 10 7 células / pocillo en una placa de 12 pocillos y se les prime por incubación con OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) y la interleucina 2 (IL-2) (500 UI / ml) durante 5 días.
- Después de 4 días, añadir IL-2 a una concentración de 500 UI / mL de nuevo.
- Después de la estimulación, purificar OT-I células T de suspensión celular mediante el uso de un ratón basado selección negativa kit de aislamiento de células T CD8 +, siguiendo las instrucciones del fabricante. La purificación se basa en el agotamiento de todas las células no-CD8 + mediante el uso de un cóctel de anticuerpos contra CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Clase II, Ter-119, y TCRγ / δ que luego son desechados por el uso de columnas magnéticas para la elución de las células T CD8 + purificados.
NOTA: Los pasos críticos en este procedire se indican por los fabricantes: es importante que la reacción implica sólo células individuales debido a la presencia de grupos podría bloquear la columna durante la etapa de elución; contando de la celda antes de añadir el cóctel Byotin es importante para el grado de pureza de la muestra y el procedimiento se debe realizar en hielo para minimizar los enlaces de anticuerpos no específicos.
3. Preparación de rodajas de cerebro agudo y co-cultivo con células T OT-I
- Antes de la preparación de cerebral aguda rebana 19, preparar la solución salina placedine fisiológica enfriada con hielo usando sacarosa 200 mM, tubos de 20 mm, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de dextrosa NaH 2 PO 4, 10 mM MgSO 4, 0.5 CaCl 2 y 10 mM y el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) utilizando NaCl 125 mM, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 mM NaHCO 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10 mM de dextrosa. Ajuste el pH de cada solución a 7,35 por using NaOH. Antes de ajustar el pH de ACSF, solución debe burbujeó con una mezcla de 95% O 2 y 5% de CO 2.
- Pre-enfriar las soluciones.
- Anestesie 8 - 10 semanas de edad ratones (por ejemplo, ratones C57BL / 6 como control o ratones transgénicos ODC-OVA 17 con la inhalación usando 5,0% de isoflurano, 5,0% de halotano o inyectar 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de peso corporal a través de xilazina ip Espere para la anestesia y utilizar una pizca dedo del pie para evaluar el nivel de anestesia y decapitar a la vez. La eutanasia a los ratones como por el cuidado de animales institucional y utilizar criterios del comité para la eutanasia.
- Ponga el ratón en posición ventral. Desinfectar y cortar el cuero cabelludo sagital. Abra el hueso craneal sagital, retire el cerebro rápidamente con la ayuda de una cuchara y fijarlo en el plato de un vibratome utilizando pegamento.
- Llene la placa con la solución salina preparada placedine enfriado con hielo fisiológica.
- Cortar 300 micras cortes coronales con la vibratome.
NOTA: Este procedimiento se conocen para producir muestras de tejido intactas viables adecuados para estudios celulares funcionales dentro de un intervalo de tiempo de al menos 8 hr 19-21. En efecto, después de este período de tiempo, ya partir después de las 6 horas, la preparación muestra una menor calidad, es decir, cambios en las propiedades básicas y funcionales como la acción potencial de generación y propagación. - Después de seccionar, transferir una rebanada de inmediato en cada pocillo de una placa de 12 pocillos lleno de ACSF.
- Añadir con cuidado 5 x 10 5 células OT-I T por rebanada.
- Incubar las rebanadas para un máximo de 8 horas en una incubadora (37 ° C, 5% de CO 2).
- Después del período de incubación, las rebanadas de cosecha e integrarlos mediante OCT compuesto tejido-tek y congelarlos en nitrógeno líquido. Almacenar a -20 ° C para otros estudios histológicos a por ejemplo, evaluar la estructura neuronal (por ejemplo, usando anti-MAPII o anticuerpos anti-sinaptofisina) o apoptosis (por ejemplo, utilizando anti caspasa-3-anticuerpos y anti-NeuN contracuerpos) de acuerdo con procedimientos estándar.
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Resultados
Después de la incubación de secciones de cerebro con células T de oligodendrocitos dirigida CD8 +, oligodendrocitos, así como las neuronas sufren apoptosis (Figuras 2A y 1C, respectivamente). Signos histológicos de la apoptosis (por ejemplo, la caspasa-3, Tunel) pueden ser detectados más temprano después de 3 horas de incubación. El período de incubación no debe ser de más de 8 horas con el fin de garantizar una buena calidad de la preparación y resultados reproducibles. Las células ...
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Discusión
Diferentes modelos animales se han descrito en las últimas décadas para abordar las características patológicas de trastornos desmielinizantes inflamatorias como la esclerosis múltiple. En vivo modelos de ratón y de rata son ampliamente utilizados para imitar las características fisiopatológicas de la enfermedad, es decir, el análisis de las consecuencias de los procesos de desmielinización y remielinización y de episodios entremezcladas de inflamación y neurodegeneración. Sin embargo, sólo un enfoque ex vi...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Centro Interdisciplinario para la Investigación Clínica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 a S.G.M. ME3283/2-1 a S.G.M.) y por Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB y SGM).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 12 pocillos | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoetanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Metilbutano | Roth | 3927.1 | |
| 70 µ m colador | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | cloruro de calcio |
| CD8+ kit de aislamiento | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucosa | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | caliente en 37 ° C baño de agua antes de usar |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | suero fetal para terneros |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | cloruro de potasio |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | carbonato de hidrógeno de potasio |
| L-Glutamina | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | sulfato de magnesio |
| NaCl | Sigma | 31434 | cloruro de |
| sodioNaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | hidrogenofosfato de sodio |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | hidrogenocarbonato de sodio |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | hidróxido de sodio |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | cloruro de amonio |
| Aminoácido no esencial | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovoalbúmina |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sacarosa | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
Referencias
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