Limb remoto Preacondicionamiento Isquémico: una técnica neuroprotector en roedores

Summary

Precondicionamiento isquémico remoto (RIP) es un método de acondicionamiento de tejidos contra el estrés perjudicial. Hemos establecido un método de isquemia a distancia hacia la extremidad posterior, inflando un manguito del esfigmomanómetro durante 5-10 minutos. Las capacidades neuroprotectoras de RIP se han demostrado en un modelo de degeneración de la retina en los roedores.

Abstract

Isquemia subletal protege los tejidos contra la posterior isquemia, más severa a través de la regulación positiva de mecanismos endógenos en el tejido afectado. Isquemia subletal también se ha demostrado que upregulate mecanismos de protección en los tejidos remotos. Un breve período de isquemia (5-10 min) en la extremidad posterior de mamíferos induce respuestas de autoprotección en el cerebro, los pulmones, el corazón y la retina. El efecto es conocido como el precondicionamiento isquémico remoto (RIP). Es una manera terapéuticamente prometedor de proteger órganos vitales, y ya está en ensayos clínicos para lesiones del corazón y el cerebro. Esta publicación muestra un método controlado, mínimamente invasivo de hacer una extremidad - específicamente la extremidad posterior de una rata - isquémica. Un manguito de presión arterial desarrollado para su uso en neonatos humanos está conectada a un esfigmomanómetro manual y utiliza para aplicar presión 160 mmHg alrededor de la parte superior de la extremidad posterior. Una sonda diseñada para detectar la temperatura de la piel se utiliza para verificar la ischemiuna, mediante el registro de la caída de la temperatura de la piel causado por la oclusión inducida por la presión de las arterias de las piernas, y el aumento de temperatura que sigue a la liberación del manguito. Este método de RIP protege a la retina de ratas contra el daño inducido por la luz brillante y la degeneración.

Introduction

La supervivencia de la mayoría, tal vez todos, los tejidos de la cara de estrés metabólico puede ser mejorada por el condicionamiento previo con un período de isquemia subletal ^1,2. El precondicionamiento isquémico (IP) en términos prácticos es la exposición del tejido a la isquemia subletal, antes de las experiencias de tejido factores estresantes más graves, tales como un insulto isquémico posterior. En modelos animales, IP proporciona protección sorprendente con el cerebro, la retina, el corazón y los pulmones ^3-6. En consecuencia, las observaciones en pacientes con accidente cerebrovascular mostraron un vínculo entre los ataques isquémicos transitorios anteriores y mejores resultados clínicos ^7,8. IP también protege los fotorreceptores de la retina de lesiones no isquémicas ^9.

La eficacia de la PI en diversos tejidos y lesiones sugiere que está activando un mecanismo innato de la supervivencia celular presente en todos los tejidos. El precondicionamiento isquémico de miocardio se ha sugerido que tiene efectos protectores a través de la regulación al alzadel factor inducible por hipoxia (HIF), conocido para regular las diferentes vías metabólicas a través de la liberación de adenosina o mediante la apertura de canales de potasio ATP mitocondrial ^10,11. Canales de liberación de adenosina y el ATP de potasio están implicados en la isquemia cerebral, pero, las investigaciones sobre los mecanismos neuroprotectores de condicionamiento isquémico hasta la fecha se han centrado en las modificaciones de anti-excitotoxicidad, vías anti-apoptóticos y anti-inflamatorios ^12,13. En general, la comprensión del proceso molecular de acondicionamiento isquémico para la protección de las neuronas es limitado.

Intentos precondicionamiento isquémico remoto para acondicionar distantes órganos críticamente importantes (corazón, cerebro, pulmón) por generar isquemia en los tejidos menos críticas. Precondicionamiento isquémico remoto (RIP) usando la extremidad posterior ha demostrado ser neuroprotector en modelos de roedores de accidente cerebrovascular ^14-17. El método descrito por nosotros proporciona un prot simple, fiable y no invasivoocol para inducir RIP.

La gran mayoría de protocolos RIP implica la extremidad posterior, presumiblemente debido a la arteria femoral situada en la extremidad posterior superior se puede identificar fácilmente y se accede para la sujeción quirúrgica y la aplicación del torniquete. En las extremidades isquémicas invasiva estudios para el estudio de cerebro y protección de la piel, la isquemia se indujo mediante la separación de la arteria femoral de la ingle y los ligamentos pinzamiento de la arteria femoral ^2,15,18.

La isquemia resultante de cualquiera extremidad manguitos de sujeción o femoral de la arteria ha sido confirmado por los cambios en la extremidad incluyendo una pérdida de pulso, disminución en la oxigenación y una caída en la temperatura de la piel. Isquemia a distancia puede ser confirmado por la pérdida de pulso utilizando Doppler láser o ultrasonido Doppler ^17-19. Temperatura de la piel se puede utilizar como alternativa a Doppler aunque la relación no es lineal ^20,21. Grabaciones precisas de temperatura son comunes en los laboratorios y lataser fácilmente incorporados en los estudios isquémicas remotas.

Una alternativa a la cirugía de fijación femoral es la inducción de isquemia usando un torniquete. Aplicación del torniquete produce isquemia comparable al conseguido con sujeción buque; Kutchner et al. comparación de la arteria femoral invasiva de sujeción para un torniquete no invasivo y encontraron ambos métodos detuvieron el flujo sanguíneo a la extremidad y daño de la piel reducido en un modelo de cirugía plástica de la isquemia colgajo de piel ^18. Manguitos ya sea la pierna o el brazo y el aumento de la presión del manguito a encima de la presión arterial sistólica se ha encontrado para ser protector contra el daño isquémico en cerdos y seres humanos ^17,19,22.

Different torniquete se acerca a inducir remoto incluye isquémica el uso de un manguito de presión arterial o un ^17,22,23 banda elástica. Sin embargo, el uso de una banda elástica para inducir isquemia es un método inseguro, potencialmente dando lugar a una cantidad no regulada de presión en elextremidad, con aumentos de presión por encima de 500 mmHg siendo grabado en los seres humanos ^24. Además, isquemia de las extremidades usando una banda elástica conduce a daño muscular en ratas después de la eliminación de la banda ^23, según la evaluación de colorante azul de Evans, un marcador in vivo de la permeabilidad de miofibras ^25. En contraste, la entrega de una presión controlada para el torniquete se puede lograr utilizando un manguito de presión arterial conectado a un ^17,19,22,26 esfigmomanómetro.

En este estudio, se utilizó un modelo de lesión de luz de degeneración de los fotorreceptores para demostrar la eficacia neuroprotectora de precondicionamiento isquémico remoto. Isquemia a distancia se indujo inmediatamente antes de la lesión luz, evitando la posterior degeneración de los fotorreceptores según lo confirmado por las pruebas de la función retiniana. El video que acompaña demostrará la aplicación de isquemia a distancia no invasiva.

Protocol

Declaración de Ética: El protocolo sigue las directrices de cuidado de animales de la Universidad de Sydney, AEC # 5657. La anestesia fue aprobado por el comité de ética animal (Universidad de Sydney, AEC # 5657).

1. Preparación del equipo

1. Utilice el seguimiento de la temperatura de la piel en tiempo real. Encienda el ordenador, y el hardware de adquisición de datos.
2. Software de registro de la temperatura Abrir y ajustar el ajuste de temperatura de entre 30 a 35 ° C y la frecuencia de muestreo de cada 100 ms.
3. Opcional: Inserte el termómetro rectal para garantizar la temperatura central se mantiene estable en 37,5 ° C.

2. La calibración del esfigmomanómetro manual

1. Conecte brazalete neonatal a sphygmomanometer.Use un manguito de tamaño 2 de 250 a 550 g de rata. Un adaptador puede ser necesario conectar el tubo del manguito de esfigmomanómetro.
2. Desinflar el manguito por cualquiera de aflojar la válvula de escape de aire o desconectar el tubo del manguito de la adaptacióno. Asegurar ninguna presión permanece en el tubo y la aguja del manómetro se apoya en cero dentro del óvalo / rectángulo.
3. Compruebe la presión entre la tubería, manómetro y brazalete. Inflar el manguito con bombas suaves de la bombilla de la inflación hasta que lea 100 mmHg en el manómetro. Asegúrese de que la presión se mantiene constante. Desinflar el manguito abriendo lentamente el valor de liberación de aire.

3. Preparación Animal

Nota: Los animales que han de someterse a una lesión luz requerir adaptación oscura la noche antes de la isquemia a distancia. Animales sometidos a daño de la luz requieren cría (12 h de luz: oscuridad ciclo (5 lux)) oscuro

1. Realizar isquemia a distancia, ya sea en roedores despiertos o anestesiados. Asegúrese de que los animales tienen un tono muscular saludable. Asegurar esta pellizcando la extremidad posterior superior para confirmar que no es adecuada presente muscular. Protección RIP inducida por la luz contra la lesión ha sido probado en ratas sedentarias hasta 6 meses de edad.
2. Preparación anestesiado para RIP
   1. Inyectar las ratas con una inyección intraperitoneal de 60 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina. Comprobar la profundidad de la anestesia mediante la extensión de la pierna y pellizcando la piel en la parte inferior del pie. El animal no tiene reflejo si está profundamente anestesiado. Aplicar las lágrimas artificiales para evitar la sequedad de la córnea mientras bajo anestesia.
   2. Coloque ratas en cualquiera de una almohadilla de calor o circulación tubo calentador de agua para mantener una temperatura corporal constante de 37,5 ° C. Coloque la rata en la posición prona con almohadillas de las patas de las extremidades inferiores "hacia arriba. O bien la derecha o la izquierda extremidad pueden sufrir isquemia a distancia.
3. Preparación Awake para RIP
   Nota: Despierta la experimentación animal requiere de dos personas. A una persona le restringe el animal y la segunda persona opera el esfigmomanómetro manual. Los experimentadores deben estar seguros para llevar a cabo el procedimiento como restricción aumenta el riesgo de lesiones a los manipuladores. Las ratas sometidas a isquemia a distancia deben estar condicionadas to la restricción manual. En función de las directrices intuitivas moderación manual debe ser el progreso de 30 segundos a un máximo de 5 minutos durante un número de semanas. Animales tímidos que no logran aclimatarse a la moderación manual tienen que ser excluidos de la experimentación despierto. Por último, la moderación manual es probable que cause estrés (y potencialmente introducir confunde con el estudio) a los animales y una cohorte simulada (colocación de manguito sin inflamación) debe ser utilizado para interpretar con precisión los resultados del estudio de RIP.
   1. Cortar una toalla en un 15 cm x 30-50 cm pieza y colocar el borde corto perpendicular a la espina dorsal de la rata, que cubre la cabeza de la parte superior de las extremidades posteriores.
   2. Meta el borde corto bajo el torso de la rata con fuerza y ​​empezar a envolver la rata con el borde largo restante de toalla. Asegurar el animal envuelto bajo el brazo en una posición supina. Si la rata se lleva a cabo bajo el brazo izquierdo, liberar la extremidad derecha de la rata de la toalla.

O 4. Aplicaciónf Temperatura de la piel de la sonda

1. Extender la pata de la rata que ha de someterse a la isquemia y colocar la sonda de piel en la almohadilla de la pata. Coloque la sonda de la piel para maximizar el contacto entre la sonda de temperatura y la piel. Empuje firmemente la sonda en la almohadilla plantar y colocar la sonda con cinta de papel.
2. Compruebe la colocación de la sonda de la piel mediante el seguimiento de la temperatura en el software de registro de la temperatura. Asegúrese de que la temperatura de la piel es de entre 30 a 34 ° C y se mantiene estable. Seguimiento de la temperatura de la piel durante 1-2 minutos. Ajustar la sonda de la piel si la temperatura es inestable o por debajo de 30 ° C.

5. La isquemia a distancia

1. Desinflar el manguito y asegurar la válvula de presión de aire se cierra. Extienda la pierna y sin apretar rodear el brazalete en la extremidad posterior superior. Utilice el dedo índice y el pulgar para extender la pierna y los dígitos más bajos para mantener el brazalete suelta en su posición.
2. Elevar la presión del manguito del animal anestesiado a 160 mmHg, y en animales despiertos INCREase la presión del manguito a 180 mmHg.
   Nota: La presión arterial anestesiado de ratas oscila 120-140 mmHg y se eleva a 160 mmHg cuando consciente. Comenzar las grabaciones con temporizador y la temperatura del pie una vez que se alcanza la presión correcta.
   Nota: La temperatura del pie debe caer por 2 ° C después de 5 minutos de presión constante.
3. Mantener la posición del manguito por encima "rodilla" del animal durante toda la isquemia. Presión del manguito comenzará a bajar después de unos minutos, o si la extremidad de la rata está en movimiento.
4. Repetidamente bombear la pera de inflado en ráfagas cortas para mantener la presión del manguito deseada corta ráfaga repetitivo de bombeo
5. Isquemia remoto se puede enviar de forma continua durante entre 5 y 15 min. El protocolo de isquemia reperfusión incluye 2 periodos de 5 min de isquemia con una intervenir 5 min de reperfusión.
6. Desinflar la presión del manguito aflojando la válvula de presión de aire. Compruebe el cambio de temperatura en el transcurso de la pro isquemiaProtocolo. Suelte el puño.
7. Continuar con la experimentación lesión. Animales bajo el efecto de la anestesia tendrán que ser colocado sobre una almohadilla de calor. Continuar monitoreando animales hasta ambulatoria. Los animales no pueden ser devueltos a la vivienda hasta caminando.

6. Lesiones Luz - Retina Degeneración Modelo

1. Oscuro adaptarse a los animales durante la noche (15.12 h). Inmediatamente después de la isquemia acondicionado remoto o isquemia a distancia simulada (contención de los animales) lugar animales en la vivienda de plexiglás con los alimentos y el agua.
2. Encienda la iluminación fluorescente (1000 lux) situado por encima de plexiglás vivienda a las 9 am durante 24 horas. A raíz de exposición a la luz, devolver los animales a la luz tenue cíclica durante 7 días.

Procedimientos Isquemia 7. Post-remotas

1. Evaluación Vision con Electrorretinograma (ERG):
   Nota: El ERG configuración y el protocolo de flash siguieron Brandli y la piedra ^26.
   1. Oscuro se adaptan los animales durante la noche (12.15 h). Bajotenue iluminación roja anestesiar a los animales mediante inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina (60 mg / kg y 5 mg / kg, respectivamente). Midriática (sulfato de atropina 1,0%), anestesia corneal (proximetacaína 0,5%).
   2. Aplicar la hidratación corneal (Carbomer polímero) gotas para los ojos inmediatamente a la córnea. Aplique el gel del ojo en intervalos de 20 minutos para mantener la hidratación de la córnea.
   3. Dibuja un hilo suelto atada alrededor del globo ocular para ayudar grabaciones ERG estables. Monitorear la temperatura usando una sonda rectal y mantener la temperatura corporal del animal en 37 a 37,5 ° C.
   4. Coloque la cabeza dentro de una esfera de integración Ganzfeld.
      Nota: El Ganzfeld es un estímulo luminoso totalmente programable que ofrece la pizca parpadea uniformes de los LED en el ojo.
   5. Registre el electrorretinograma usando un 4 mm de platino electrodo positivo a medida tocando ligeramente la córnea y un diámetro de 2 mm Ag / AgCl electrodo pellet insertado en la boca. Referencia ambos electrodos a una aguja de acero inoxidableinsertado por vía subcutánea en la grupa.
   6. Señales de registro con ajuste de paso de banda de 0.3-1,000 Hz (-3 dB), con una velocidad de adquisición de 2 kHz (Instrumentos AD). Después de que se estableció una grabación estable ERG sujeto al animal a un adaptación a la oscuridad 10 min antes de iniciar las grabaciones.
   7. Siga el protocolo de flash como se describe anteriormente por Brandli y la piedra ^26.
      1. Programar la duración del flash (se utilizó flashes 2.1 ms de duración), y establecer su intensidad de -4,4 a 2,0 log scot cd.sm ^-2. Utilice destellos brillantes (log 2,0 scot cd.sm ^-2, 1 ms) para medir la función de la retina. En este estudio es la comparación entre el control, lesiones leves y lesiones de luz con RIP.

8. TUNEL ensayo

1. La eutanasia a los animales mediante inyección intraperitoneal de sobredosis de fenobarbital (100 mg / kg). Enuclear los ojos y fijar en paraformaldehído al 4%.
2. Lave los ojos en PBS antes cyroprotectingojos durante la noche en sacarosa al 30% (w / v). Insertar los ojos en compuesto OCT y cortar en 20 micras secciones sagital utilizando un criostato.
3. Realizar el ensayo TUNEL en secciones de la retina con tinción DAPI siguiendo el protocolo de Maslim et al. ²⁷
4. Utilice microscopía de fluorescencia para el recuento de TUNEL de la retina. Células TUNEL se registraron a partir de la capa nuclear externa (ONL); la capa más externa de la retina que contiene núcleos fotorreceptoras. En este estudio, los recuentos de TUNEL se realizaron por triplicado para cada ojo, con 5 ojos para cada grupo de tratamiento.
5. Utilice un modelo lineal al grupo estadístico comparar medios de control, lesiones leves y lesiones + RIP luz ratas.

Results

Un manguito de presión arterial elevada por encima de 160 mmHg detiene el flujo sanguíneo a la extremidad posterior como se ve claramente en la figura 1B. La falta de oxigenación de los tejidos resultó en una reducción de la temperatura del pie del animal para un protocolo de isquemia-reperfusión (Figura 2). La temperatura del pie (33 ° C) fue menor que la temperatura central y la reducción de forma fiable durante la elevación de presión del manguito (31 ° C) aumentando cuando el brazal...

Discussion

Roedor extremidad posterior isquemia se indujo con éxito con un esfigmomanómetro manual de la entrega de la neuroprotección y el manguito de los fotorreceptores de la retina. Un hallazgo consistente con isquemia inducida acondicionado protección de los fotorreceptores de una lesión ligera ^9,28.

En esencia, la isquemia a distancia hace que la privación breve de oxígeno a los tejidos. Por lo tanto, el precondicionamiento isquémico remoto tiene muchas similitudes con acondicionado is...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Esfigmomanómetro aneroide de mano DuraShock de la serie	Gold Welch Allyn	DS56	Esfigmomanómetro manual
Neonato [tamaño 2] 1 tubo, paquete de 10	Welch Allyn	5082-102-1	Manguito de presión arterial para extremidades
Adaptador de bloqueo Luer	Welch Allyn	5082-178	Adaptador para manguito neonatal
Cápsula de termistor	AD Instruments	Unidad de temperatura cutánea	ML 309
Sonda de temperatura cutánea	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, herrajes de adquisición de 4 canales	AD Instruments	PL 35044
Sistema de mantas homeotérmicas con sonda flexible	Harvard Appartus	507222F
Toalla			opcional: isquemia remota despierta
Isoflo - 100% Isoflurano (250 ml)	Abbot Animal Health	05260-05	opcional: anestésico inhalatorio isquemia a distancia
Ketamil - ketamina 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		opcional: anestésico inyectable isquemia a distancia
Xilio - xilacina 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		opcional: anestésico inyectable isquemia a distancia