Artículo de método

Imaging intravital de axonales Interacciones con macrófagos y microglia en un ratón Dorsal Crush Columna Lesión

DOI:

10.3791/52228

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23 de noviembre de 2014

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1Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

En este artículo

Resumen

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Las imágenes intravitales de dos fotones se pueden utilizar para investigar las interacciones entre diferentes tipos de células en la médula espinal en su entorno de tejido nativo en un animal quimérico de médula ósea con una lesión traumática por aplastamiento de la médula espinal en la columna dorsal.

Resumen

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La lesión traumática de la médula espinal provoca una reacción inflamatoria que afecta a los macrófagos derivados de la sangre y a la microglía residente en el sistema nervioso central (SNC). La microscopía intravital de dos fotones permite el estudio de los macrófagos y la microglía en la lesión de la médula espinal en el animal vivo. Esto se puede realizar en animales adultos con una lesión traumática en la columna dorsal. Aquí, describimos métodos para distinguir macrófagos de la microglía en el SNC utilizando una quimera de médula ósea por irradiación para obtener animales en los que solo los macrófagos o la microglía están marcados con una proteína fluorescente verde codificada genéticamente. También describimos un modelo de lesión que aplasta la columna dorsal de la médula espinal, produciendo así una lesión rectangular simple, de fácil acceso y fácilmente visualizable en un animal a través de una laminectomía. Además, describiremos los procedimientos para obtener imágenes secuenciales de los animales en el sitio anatómico de la lesión para el estudio de las interacciones celulares durante los primeros días o semanas después de la lesión.

Introducción

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La reacción inflamatoria a la enfermedad o lesión en el sistema nervioso central (CNS) es poco conocida, especialmente con respecto a las interacciones entre las células inmunes y residentes dentro del tejido. Las investigaciones de estas interacciones celulares en la médula espinal son de particular interés en el animal vivo. El único de fácil acceso CNS blanco tracto asunto está en las columnas dorsales de la médula espinal, haciendo de este un área importante en la que centrar los esfuerzos en mejorar el enfoque experimental factible. Estas investigaciones han sido limitadas debido a la dificultad técnica en el acceso y la estabilización de la CNS para formación de imágenes. Imágenes en vivo en la médula espinal ha sido descrita movimiento celular previamente 1-13, sin embargo, pocos estudios han abordado en una lesión de la médula espinal más allá de unas pocas horas después de la lesión inicial. La lesión traumática de la médula espinal es un entorno complejo, con las neuronas, astrocitos, fibroblastos, células progenitoras NG2, y las células inmunitarias including microglía, neutrófilos, macrófagos, células T, células B y células dendríticas 14,15. Los macrófagos son el subconjunto de células inmunes responsables de la fagocitosis en la lesión, la infiltración de la circulación. El papel de estas células fagocíticas se ha debatido, con informes que indican que estas células pueden asumir ambos roles perjudiciales y protectores en el tejido lesionado. Estas funciones van desde el aumento de muerte regresiva axonal secundaria después de una lesión y actuar de una manera fagocítica 16-22, para asumir una cicatrización de heridas fenotipo y la disminución de los déficits funcionales en el animal herido 21,23,24.

Anteriormente, los intentos para distinguir los macrófagos de microglia se han basado principalmente en la morfología en el tejido sano. Sin embargo, la microglía y macrófagos activados expresan muchos de los mismos marcadores y muestran morfología indistinguibles después de la lesión 25-29, haciendo que la separación de las diferentes actividades de estas células difíciles de estudiar based en estos factores por sí solos 30. Estas células se pueden separar por la expresión diferencial de CD45 usando citometría de flujo 33,34, aunque este enfoque es menos útil en la discriminación de estos tipos de células in vivo. Utilizando la expresión diferencial de CCR2 y CX3CR1 en la microglía y los macrófagos también ha sido explorado, aunque los cambios dinámicos en la expresión de estos marcadores como los monocitos se diferencian en macrófagos puede complicar el análisis preciso 35,36. La microglía son las células inmunes residentes en el SNC y surgen a partir de progenitores saco vitelino durante el desarrollo fetal, mientras que los macrófagos se derivan a partir de progenitores de médula ósea y entran en el SNC lesionado después de un insulto 31,32. Un enfoque alternativo a la utilización de la morfología de distinguir estos dos tipos de células es reemplazar la médula ósea con células progenitoras a partir de un animal donante que expresa un marcador detectable en los macrófagos derivados de los progenitores de los donantes, preservando al mismo tiempo el residente CNS, recipient derivado de microglia. Estos modelos quiméricos de la médula ósea se utilizan comúnmente en muchas otras aplicaciones 37-40. Este método tiene advertencias únicas asociadas con el daño a la integridad de la barrera sangre-cerebro causada por irradiación o citotóxicos fármacos utilizados para erradicar progenitores de médula ósea en el huésped, lo que limita su uso en ciertas aplicaciones. Recientemente, las distinciones funcionales entre los macrófagos y microglia en el SNC están comenzando a ser discernido mediante citometría de flujo, el análisis conjunto de chips de genes y métodos quimerismo 24,26,41-44, que resultará muy útil en el futuro. Aunque la separación de estos dos tipos de células sigue siendo difícil, la comprensión de sus funciones únicas es importante en llevar a tratamientos más específicos de los trastornos que involucran tanto a los macrófagos y microglia en el SNC.

Descripción de las interacciones celulares dentro de la lesión de la médula espinal ha venido principalmente de estudios con modelos de cultivo celular. Esto es due a los desafíos implicados con imágenes tanto de la lesión de la médula espinal y células inmunes juntos en un animal vivo. Modelos de roedores actuales de lesión de la médula espinal de variar el tipo y la gravedad incluyen modelos contusión 45,46, lesiones pinchazo 2, laceración 47, y la lesión por aplastamiento de la columna dorsal descrito aquí 16,18,48. La inflamación de las meninges aumenta con la gravedad de la lesión y plantea desafíos únicos para la implantación de las ventanas o cirugías para imágenes en serie. Algunos de estos desafíos incluyen la infiltración de células fagocíticas, así como la generación de tejido fibroso sobre el sitio quirúrgico. Algunos de estos problemas pueden ser superados mediante la creación de lesiones más pequeñas y que cubre la médula espinal expuesta con apósito quirúrgico no inmunogénica entre la duramadre y los músculos paravertebrales para permitir la cirugía reapertura posterior, como se hace aquí a estudiar la columna de la lesión por aplastamiento dorsal . La capacidad de imagen sólo la porción dorsal de la escisiónal cable también limita la elección de la lesión, ya que los modelos contusiones causan principalmente daños en el cable central, a menudo ahorra la parte más dorsal de la columna dorsal, especialmente en los puntos de tiempo tempranos después de la lesión 45,49. Por lo tanto, se describe un modelo de lesión simple que produce una lesión limpio, repetible, de forma rectangular que es útil tanto para la observación de movimiento de las células dentro de la lesión y para facilitar la cuantificación de la posición axonal en relación con la lesión.

Protocolo

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NOTA: Todos los animales deben ser alojados y utilizados de acuerdo con el comité de cuidado y uso de animales (IACUC) en la institución. Todos los procedimientos descritos aquí son aprobados por la Universidad Case Western Reserve IACUC.

1. Animales Transgénicos

  1. Utilice reportero ratones fluorescentes disponibles comercialmente para etiquetar axones (Thy-1 YFP H) 50 y microglia / monocitos (CX3CR1 GFP / GFP 51; véase la lista de materiales). Estos ratones deben entrecruzaron y mantenidos como colonias de cría individuales de acuerdo a las políticas de cuidado de los animales institucionales.

2. Médula Ósea Quimeras

  1. Identificar a los animales que son al menos 8 semanas de edad para su uso como animales receptores.
  2. Coloque los animales huéspedes en una jaula irradiación celebración circular diseñado para sostener el ratón en condiciones de garantizar incluso, la irradiación de todo el cuerpo.
  3. Ajuste del temporizador en una de cesio (Cs-137) irradiador para administrar un dos radiación en todo el cuerpoedad de 800-1.000 Rads a los animales de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ejemplos mostrados aquí son 980 rads).
  4. Vuelta de los animales a sus jaulas para descansar durante un mínimo de 4 horas.
  5. Elige animales donantes del genotipo apropiado (véase la Figura 2A) como la fuente de células progenitoras de la médula.
    NOTA: Los donantes adecuados son animales que expresan diferentes reporteros fluorescentes específicos de linaje desde el host para identificar diferentes poblaciones de células, o uno del mismo genotipo como controles.
  6. Llene una caja de Petri con 70% de alcohol, y un segundo plato con 10 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medios de comunicación y un colador de 40 micras celular empapado en los medios de comunicación. Llenar un tubo cónico de 15 ml con medio RPMI. Mantenga los platos y tubo en hielo.
  7. Sacrificar los animales donantes por asfixia de CO 2 de acuerdo con las directrices institucionales. Limpiar la piel y el pelo empapando todo el animal con etanol al 70% hasta que todo piel está húmeda.
  8. Retire el skdesde la mitad inferior del animal mediante el corte alrededor de la sección media y tirando de la piel hacia abajo sobre las patas traseras para exponer completamente los músculos de la pierna.
  9. Retire la tibia por sobreextensión anterior en la articulación de la rodilla para dislocar el hueso, entonces el uso de fórceps y tijeras estériles, pelar y cortar los músculos de distancia desde ambos extremos de la tibia. Coloque el hueso en la placa de Petri con el alcohol durante un máximo de 30 segundos y luego traslado al filtro de células en el interior de la placa de Petri que contiene los medios de comunicación.
  10. Dislocar la articulación de la cadera y pelar lejos los músculos unidos al fémur, colocada brevemente fémur en alcohol y luego se coloca en el mismo filtro de células dentro del plato.
  11. En una campana de cultivo de tejidos, utilizar tijeras estériles para cortar ambos extremos de los huesos e insertar una aguja de calibre 21 en una jeringa de 1 ml en el extremo del hueso. Enjuague la médula hacia el cónico de 15 ml con medios de comunicación. Repita el procedimiento para los huesos restantes.
  12. El uso de la parte posterior del émbolo de una jeringa de 3 ml, hueso aplastamiento termina en la célulacolador en la placa de Petri para extraer más células.
  13. Colocar el filtro en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml y transferir los medios de comunicación con las células aspiradas de la tubo cónico de 15 ml. Utilice la parte posterior del émbolo para aplastar la médula ósea con el fin de obtener una suspensión de células individuales. Lavar las 15 ml tubo cónico, fragmentos de hueso y el filtro de células con 30 ml de medio en un tubo cónico de 50 ml.
  14. Centrifugar las células durante 5 min a 500 xg para sedimentar las células.
  15. Lisar las células rojas de la sangre con 2 ml de amonio-cloruro de potasio (ACK) tampón de lisis durante 2 min. Se inactiva el tampón de lisis con 10 ml de medio que contiene suero bovino fetal al 10%. Centrifugar a 500 xg durante 5 a 10 minutos para sedimentar.
  16. Lavar las células una vez en 10 ml de medio RPMI y dos veces en solución salina, centrifugación a 500 xg durante 5-10 min para sedimentar para cada lavado.
  17. Resuspender las células a una concentración final de 3 x 10 6 células en 200 l de solución salina.
  18. Transferencia de 3 x 10 6 células de la médula a través de inyección en la vena de la cola en irrratones receptores adiated.
  19. Coloque agua acidificada (pH 3,0) en la jaula destinatario y permiten ratones para recuperarse.
    NOTA: Los ratones que no pasa el trasplante va a morir dentro de 10 a 14 días después del procedimiento.
  20. Después de 8 semanas, verificar la reconstitución ósea mediante el examen de las células inmunes de la sangre periférica mediante citometría de flujo (Figura 2B-C).

3. Dorsal Crush Columna Lesión

NOTA: Elija animales quimera apropiados o animales transgénicos dobles para la cirugía sobre la base de la experiencia deseada. Los animales con células derivadas de médula ósea residentes o bien marcadas fueron creados en los pasos anteriores.

  1. Preparar y esterilizar en autoclave herramientas quirúrgicas, incluyendo gubia, Dumont # 4 pinzas, tijeras iris, pinzas para tejidos que sostienen, conductores de agujas y clips de la herida.
  2. Preparar medicamentos para administrar a los ratones para controlar el dolor. Bupernex y bupivacaína son comúnmente utilizados para el control del dolor. Use medicamentos adecuados según se requiera unand aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC).
  3. Inducir la anestesia con 4% de isoflurano y mantener con 1-2% de isoflurano para lograr una tasa de respiración de 60-100 respiraciones por min. Aplicar lubricante ocular para los ojos del animal para evitar la sequedad bajo anestesia y confirmar la falta de respuesta por parte pizca pie. Mantener la temperatura utilizando una almohadilla de calefacción y monitorizar la temperatura usando una sonda rectal.
  4. Afeitarse la parte posterior del ratón con una afeitadora eléctrica sobre el nivel de la médula espinal objetivo, y luego limpie el área tres veces con povidona-yodo seguido por dos veces con 70% de alcohol. Colocar el animal en un campo estéril, y cubrir el animal con otro paño estéril con un agujero cortado en un lugar apropiado para visualizar el sitio quirúrgico. Mantenga todas las herramientas en paños estériles durante toda la cirugía.
  5. Cortar la piel a lo largo de la línea media a nivel espinal deseado con tijeras iris para exponer el músculo en la parte posterior del animal.
  6. Bajo un disseja microscopio, cortar los músculos de la espalda, incluyendo el trapecio y los ligamentos de la dorsal ancho a lo largo de la línea media donde se unen a los procesos espinales dorsales, y exponer la columna vertebral.
  7. Quitar los músculos rotadores entre los procesos dorsales y transversal de la vértebra para revelar la lámina de la vértebra específica a eliminar (T11 en este caso). Identificar T11 mediante la inserción de la última costilla no flotante en este proceso.
  8. Inserte consejos de gubia en el espacio por encima y por debajo del proceso que desea eliminar y levantar ligeramente para asegurarse de que están en su lugar alrededor de la lámina vertebral, pero no demasiado profunda como para lesionar la columna vertebral. Cerrar gubia en un solo movimiento para quitar la lámina.
  9. Agrandar la laminectomía, según sea necesario utilizando las gubias para eliminar pequeñas partes de la vértebra restante.
  10. Mida 1 mm desde la punta de un # 4 fórceps sosteniéndolos contra un gobernante y marcado con un marcador permanente. Medir un 1 mm de separación apuestaWeen los dos dientes mediante la celebración de la pinza contra el gobernante y fijar la anchura máxima de las puntas a 1 mm deslizando un anillo fórceps de goma en su lugar sobre el eje de la pinza.
  11. Crear un pequeño agujero mediante la inserción de una aguja de calibre 30 a través de la duramadre en los dos puntos de inserción para los dientes de las pinzas para acceder a la médula espinal.
  12. Insertar las púas fórceps en un ángulo de 90 ° a la duramadre a través de los agujeros a la profundidad de 1 mm marcados en los lados de las pinzas, asegurándose de que la marca está por encima de la duramadre. Una pizca de cerrar la pinza y aguante por 10 segundos. Liberación, y la repetición fórceps exprimir dos veces más para un total de tres bodegas. Eliminar fórceps de la médula espinal.
  13. Remoje un pedazo de gelatina absorbible comprimido esponja en solución salina y el lugar sobre el sitio de la lesión.
  14. Usando una puntada corriente, suturar el músculo en su lugar sobre la laminectomía y empapado esponja de gelatina con # 4 suturas de nylon no absorbibles sintéticos.
  15. Clip de la piel en su lugar con 5 mm cli heridaps.
  16. Inyectar 10 l de bupivacaína (1,0 mg / kg) en 490 l de solución salina por vía subcutánea alrededor del sitio de la incisión y 5 l Bupernex (0,1 mg / kg) por vía intramuscular en los músculos de los glúteos.
  17. Deje que los animales se recupere en una compresa caliente y monitorear para cualquier dificultad en el movimiento o signos de parálisis en las extremidades posteriores. No deje de animales desatendidos o en presencia de otros animales hasta que se recupere completamente de la anestesia. No utilice animales que muestran déficits motores observables.
    NOTA: Aunque esta lesión de aplastamiento se puede realizar en cualquier nivel a lo largo de la médula espinal, prácticamente, T10-L4 plantean menos problemas técnicos para formación de imágenes con respecto a la respiración y estabilizar el movimiento del cuerpo usando abrazaderas. Colocación de la abrazadera debe ser modificado alrededor de la caja torácica a la imagen en los niveles torácicos.

4. intravital Imaging

  1. Preparar y esterilizar en autoclave herramientas quirúrgicas, incluyendo Dumont # 4 pinzas, tijeras iris, pinzas para sujetar el tejido, la aguja dríos y clips de la herida.
  2. Anestesiar el ratón como antes con isoflurano. Inducir la anestesia en el 4-5% y se mantiene a 1-2% según sea necesario para mantener una tasa de respiración de 60 a 100 veces por minuto y la falta de respuesta a la pizca pie. Mantenga el ratón climatizada, monitorear la frecuencia respiratoria cuando no la formación de imágenes y un seguimiento continuo de la temperatura de los animales con una sonda rectal.
  3. Limpie la piel alrededor de los clips de la herida con Betadine y luego el alcohol y eliminar los clips de la herida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez que se eliminan los clips de la herida, quitar el pelo con Nair si es necesario limpiar el sitio de nuevo con alcohol de povidona yodada y el 70%.
  4. Vuelva a abrir la piel con unas tijeras. Retire cualquier suturas restantes de músculo y tire muscular aparte con fórceps, cortar con tijeras si es necesario.
  5. Bajo un microscopio de disección, crear bolsas para la médula espinal abrazaderas cortando el músculo con tijeras en el lado de los procesos transversos de la vértebra un nivel vertebral por encima y por debajo de la laminectomy.
  6. Coloque las abrazaderas alrededor de cada una de estas vértebras y apriete. Ajuste según sea necesario para dejar espacio para objetivo de microscopio para llegar a la médula espinal. Asegúrese de que la médula espinal es paralelo a la plataforma de formación de imágenes, y mantener la estabilidad del tejido para formación de imágenes. Si se observa artefacto respiración, vuelva a ajustar las abrazaderas en consecuencia para minimizar el movimiento en el campo de la imagen.
  7. Cubra las abrazaderas con parafina.
  8. Retire la gelatina comprimido esponja absorbible de la médula espinal con pinzas, con delicadeza secuestrando tantas piezas como sea posible, también la eliminación de la mayor cantidad de tejido cicatricial en los meninges como sea posible. Cubierta expuesta la médula espinal con solución salina y esponja nueva si es necesario.
    NOTA: Si el sangrado se produce desde el músculo circundante, ya sea firme con esponja o cauterizar según sea necesario. Sin embargo, tenga cuidado de no tocar la médula espinal con el cauterio. Cubrir la médula espinal, ya sea con un pedazo de tejido humedecido o gelatina comprimido esponja cuando la cauterización.
  9. Crear un well para mantener el fluido de inmersión por primera sellado de la piel y el tejido con Vetbond y, a continuación, usando el acrílico dental para construir un pozo entre las dos abrazaderas del titular de la médula espinal y los lados del animal. Espere hasta que los curas de acrílico.
  10. Llene el bien con el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) y comprobar de nuevo para cualquier sangrado alrededor del sitio de la cirugía.
  11. Opcionalmente en este punto, inyectar colorantes fluorescentes de los vasos por vía intravenosa por inyección en la vena de la cola para resaltar los vasos sanguíneos durante la exploración.
    NOTA: dextrano fluorescente por encima de 70 kDa se utiliza a menudo, a pesar de los puntos cuánticos y lectinas marcadas con fluorescencia también sirven como colorantes vasos útiles. 50 l de 150.000 WM TRITC-dextrano normalmente se inyecta por vía intravenosa.
  12. Para obtener la motilidad celular inmune fisiológicamente relevante, la temperatura del ratón se debe mantener a 37 ° C. Mueve el ratón para un ambiente de temperatura controlada bajo el microscopio para la imagen y controlar al animal para anes correctosnivel tesia por la frecuencia respiratoria y la pizca pie. Monitorear el animal con frecuencia durante la exploración para determinar la profundidad de la anestesia, con el objetivo de alcanzar una frecuencia respiratoria de 60 a 100 veces por minuto.
  13. Busque el sitio de formación de imágenes a través del ocular del microscopio.
  14. Ajuste el 2 fotones microscopio de barrido láser para tomar una imagen de z-pila cada 30 a 60 segundos para obtener datos de imágenes dinámicas.
  15. Una vez que se haya completado la sesión de imágenes quitar el animal de la caja caliente.
  16. Afloje las abrazaderas de la columna vertebral y quitar el ratón de las abrazaderas. Tire del acrílico bien lejos de la piel, mientras que la eliminación de las abrazaderas.
  17. Si el ratón es a ser fotografiado de nuevo, colocar solución salina empapado de gelatina comprimido esponja sobre la médula espinal. Cierre el músculo y la piel sobre el sitio de la cirugía. No dejar al animal sin supervisión o en presencia de otros animales, mientras se recupera de la anestesia. Si el animal muestra signos de déficit neurológico después de la recuperación, el animal debe ser sacrificado. De lo contrario, la eutanasiael ratón en una cámara de CO 2 antes de que emerja de la anestesia, según el protocolo aprobado por el IACUC la eutanasia.
  18. Analizar imágenes fluorescentes con software de análisis, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Resultados

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Un diagrama esquemático que representa el dorsal lesión de aplastamiento columna se muestra en la Figura 1A. Después de la lesión, el animal se prepara y se estabilizó para microscopía intravital con abrazaderas de la columna vertebral (Figura 1B). Una imagen tomada inmediatamente después de la lesión dorsal aplastamiento columna muestra una lesión rectangular claramente visible con los puntos de inserción fórceps de dientes que son claramente identificables. Los axones en el sitio de la lesión se cortan a través del ciclo de la columna dorsal entero (Figura 1C). La integridad de los vasos sanguíneos se mantiene intacta, y no hay evidencia de tinte recipiente de fuga se detectó por fluorescencia. Para realizar las imágenes de serie de la misma lesión en cuestión de semanas, los músculos y la piel se pueden suturar sobre la laminectomía para su posterior re-exposición. Similar morfología de las lesiones se ve en los puntos más tarde (Figuras 1D, E). 5 días después de la lesión, los sitios de inserción fórceps son todavía visibles, pero la lesión ha comenzado a aumentar de tamaño due a la lesión secundaria causada por la inflamación. Los axones en el extremo caudal de la lesión han retraído desde el sitio inicial de la lesión a través de un proceso llamado "muerte regresiva axonal". Los axones en el extremo rostral de la lesión exhibieron walleriana-como la degeneración (Figura 1D, E). Entre los días 5 y 22 después de la lesión, el tamaño de la lesión se ha estabilizado. Al mismo tiempo, una gran afluencia de células CX3CR1 + se puede ver infiltrarse en y alrededor de la lesión de aplastamiento durante estos momentos, a pesar de la identidad de estas células (microglia frente a macrófagos) no se puede distinguir en la preparación, como se muestra en la Figura 1.

A fin de distinguir el comportamiento de microglia y macrófagos dentro de la lesión microambiente aplaste, se utilizó un modelo quimera de radiación (se indica en la Figura 2A). En primer lugar, las células progenitoras de la médula ósea de un CX3CR1 + / GFP ratón se sustituyen con cel donante no fluorescentels, por lo que sólo las buenas prácticas agrarias + microglia CNS residente son visibles por imágenes fluorescentes. La eficiencia de la reconstitución ósea puede ser confirmado por citometría de flujo examen de la sangre periférica 8 semanas después del trasplante de médula (Figura 2B, C). En la Figura 2B, F4 / 80 y macrófagos positivas para GFP, resaltada en azul, se detectan en un CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 quimérico ratón, en el que algunos monocitos positivos negativos, pero F4 / 80 GFP también están presentes. En la Figura 2C, no F4 doble positivo / 80 y células GFP positivas se quedan después de la sustitución de CX3CR1 + / GFP médula ósea destinatario con el tipo salvaje de la médula ósea. Antes de la lesión, microglia se distribuyen uniformemente dentro de la médula espinal, mostrando un descanso, la morfología ramificada (Figura 2D). 8 días después de la lesión, sólo unos pocos microglia pueden ser detectados en y alrededor de la lesión. Estos microglia muestran una morfología ameboide (Figura 2E). En segundo lugar, el huesocélulas progenitoras de médula en un ratón no fluorescente se sustituyen por células de la médula de un CX3CR1 + / GFP ratón, por lo tanto, la prestación de médula ósea deriva CX3CR1 + monocitos / macrófagos visibles por la fluorescencia de GFP (Figura 2A). Antes de la lesión, las únicas células GFP + detectadas son en gran parte perivascular, que se han notificado a ser derivadas de médula ósea y continuamente vuelca sobre una base regular 28 (Figura 2F). Después de una lesión por aplastamiento, las células + / GFP CX3CR1 pueden ser vistos a lo largo del interior de los vasos sanguíneos que rodean la lesión (Figura 2H-J), y el centro de la lesión se llena con la infiltración de macrófagos CX3CR1 + / GFP (Figura 2G).

Tiempo lapse de imágenes de las columnas dorsales se puede realizar durante un máximo de 6 horas. En la Figura 3, se muestra un CX3CR1 no quimérico + / GFP ratón inmediatamente después de la lesión en el que las células de la circulación se pueden vern moviendo fuera del vaso sanguíneo hacia el núcleo de la lesión y en movimiento dentro del sitio de la lesión (Figura 3A, B; Suplementario Movie 1). El análisis de imágenes utilizando la intensidad de fluorescencia para identificar las células pueden seguir las trayectorias tomadas por los macrófagos (Figura 3a, b; Suplementario Movie 1). Estadísticas derivadas del análisis de imágenes muestran la motilidad promedio de los macrófagos en la lesión es de 3,6 micras / min (Figura 3D). Finalmente, a los 22 días después de la lesión, los axones, macrófagos y microglia todavía se pueden detectar dentro de la lesión que demuestra el área de la imagen es estable durante largos períodos de tiempo (Película complementaria 2).

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Figura 1: Creación e imágenes secuenciales de la lesión dorsal aplastamiento columna. (A) El dorsallesión por aplastamiento columna se lleva a cabo mediante la eliminación del proceso de la vértebra dorsal en el nivel de interés. Fórceps se insertan en la columna de la dorsal de la médula espinal 1 mm entre sí y luego se cierran 3 veces para producir la lesión se muestra en púrpura. (B) El animal se coloca luego con la médula espinal abrazaderas para obtener estabilidad para formación de imágenes intravital. (C) Inmediatamente después de la lesión, los sitios de inserción (fórceps ovales de color rojo) y el volumen de la lesión por aplastamiento rectangular (caja gris) pueden ser claramente identificados. Los axones en las raíces dorsales pueden ser vistos (flechas blancas), así como los extremos de los axones lesionados en el lado caudal de la lesión (cabezas de flecha rellenos). (D) 5 días después de la lesión, los fórceps sitios de inserción (óvalo rojo ), y la extensión de la lesión (caja gris) todavía puede visualizarse fácilmente. La lesión ha aumentado su tamaño desde la lesión inicial. Los axones sometidos Walleriana-como la degeneración pueden verse rostral a la lesión (cabezas de flecha abierta) en additia los axones en las raíces dorsales (flechas blancas) y los extremos de los axones lesionados (puntas de flecha blancas). (E) 22 días después de la lesión, el sitio de lesión aún es identificable con dimensiones similares a la lesión después de 5 días. Tenga en cuenta el gran número de células CX3CR1 + en y alrededor del sitio de la lesión. Características etiquetados son los mismos que en (D). Todas las barras de escala = 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Construcción de ratones quiméricos para rastrear CX3CR1 + / GFP expresando macrófagos derivados de médula ósea o microglia CNS residentes en la lesión dorsal aplastamiento columna. (A) Un diagrama esquemático de la generación de ratones quiméricos con cualquiera de CX3CR1 + / GFP expresar microglia o macrófagos. En primer lugar, los ratones Thy-1 H YFP se irradian y la médula ósea se reconstituye con células de la médula aisladas de un CX3CR1 + / GFP ratón, resultando en un ratón quimérico cuya macrófagos son GFP +. En segundo lugar, Thy-1 YFP ratones H / CX3CR1 + / GFP se irradian y la médula ósea se reconstituye con células de la médula aisladas a partir de un ratón no fluorescente, produciendo un ratón quimérico cuya microglia son GFP +. (B) Ejemplo de citometría de flujo de datos con células F4 / 80 + y CX3CR1 GFP + en la sangre de un animal quimérico con un donante de médula + / GFP CX3CR1 trasplantado en un irradiado C57BL / 6 destinatario. Las células derivadas de los donantes positivos CX3CR1 que son positivas tanto para GFP y F4 / 80 se muestran en el área azul resaltado. (C) Ejemplo de citometría de flujo de datos con células F4 / 80 + y CX3CR1 GFP + en un animal quimérico con una C57BL6 donantes de médula ósea trasplantada a una IRradiada CX3CR1 destinatario + / GFP. Tenga en cuenta la falta de doble CX3CR1 + / GFP positivas y células F4 / 80 dentro de la zona azul resaltado. (D) Una de dos fotones instantánea microscópica intravital de un ratón desde el primer esquema quimérico, mostrando GFP + microglia con morfología ramificada en el dorsal columna (cabeza de flecha). Estas células se intercalan entre los axones (amarillo) en la raíz dorsal y la columna dorsal. La barra de escala = 100 micras. (E) intravital de imágenes del mismo ratón en (B) 8 días después de la lesión de la columna dorsal revela algunos CX3CR1 + microglia con cuerpos celulares grandes y en forma de ameboides que faltan procesos (cabeza de flecha). Barra de escala = 100 micras. (F) Instantánea de un ratón desde el segundo esquema de quimérico en (A), mostrando escasa GFP + macrófagos, en el parénquima del SNC. La barra de escala = 100 micras. (G) de imágenes intravital del mismo ratón en (F) 8 días después de la lesión de la columna dorsal revela alarge afluencia de macrófagos en y alrededor de la lesión. La barra de escala = 100 micras. (H) Una imagen más ampliada de células derivadas + sangre CX3CR1 en contacto con los buques en el animal está sano. Barra de escala = 30 m. (I) Una reconstrucción de células CX3CR1 en contacto con el recipiente, visto desde el interior del recipiente. Barra de escala = 30 m. (J) Una reconstrucción de células CX3CR1 en contacto con el recipiente, visto desde fuera del vaso. La barra de escala = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3 :. Datos de seguimiento de la célula de representación en un CX3CR1 no quimérico + / GFP ratón inmediatamente después de aplastar la columna dorsallesión. (A) Una instantánea de CX3CR1 + macrófagos y microglia axones dañados alrededor (amarillo) de la película complementaria 1 inmediatamente después de una lesión por aplastamiento de la columna dorsal. (B) Los caminos (gris) tomado por las células CX3CR1 + en (A) durante una 110 min sesión de imágenes intravital. (C) Una vez representación codificada de las pistas en (B). Las pistas son de color en función de su tiempo dentro de toda la película 110 minutos, como se muestra en la barra de tiempo. (D) Histograma de la motilidad global de las células CX3CR1 +. Todas las barras de escala son 30 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película complementaria 1: película intravital Representante inmediatamente después de la lesión por aplastamiento de la columna dorsal en el doble heterocigoto Thy-1 YFP / + GFP / + ratón. imágenes médula intravital se realizó inmediatamente después de una lesión por aplastamiento columna dorsal a nivel T11. El panel derecho muestra el movimiento de CX3CR1 + microglia y macrófagos. Los caminos del movimiento de las células se muestran como pistas blancas en el panel izquierdo. La lesión se encuentra a la esquina superior izquierda. Células CX3CR1 + se puede ver en movimiento en el sitio de la lesión a lo largo de estas pistas. Los axones se muestran en amarillo. La barra de escala = 40 micras. Tiempo total: 110 min. La velocidad de reproducción: 300x.

Película complementaria 2:. Película intravital Representante a los 22 días después de la lesión de aplastamiento de la columna dorsal en el doble heterocigoto Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + ratón Aquí se muestra una película representativa tomada en un ratón 22 días después de la aglomeración inicial columna dorsal lesión en T11 nivel espinal. El injUry se encuentra en la esquina superior derecha del marco. Los axones (amarillo) ascendente rostral se muestran en la parte inferior derecha. Los vasos de la vena dorsal y la sangre son etiquetados con TRITC-dextrano (rojo). + Células CX3CR1 dentro de la lesión movimiento a una velocidad más lenta en comparación con los inmediatamente después de la lesión. La barra de escala = 50 micras. Tiempo total: 90 min. La velocidad de reproducción: 600x.

Discusión

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Interacciones de imágenes de diferentes tipos de células en sus compartimentos de tejidos nativos durante consiguiente patología en tiempo real ha generado un gran interés. Dentro de la densa red de la CNS, contacto célula-célula y la señalización con las células adyacentes son esenciales para la función normal y para la comprensión de la patología del SNC. Aquí, describimos el uso de 2-fotón microscopía de escaneo láser para la observación de movimiento celular dentro de una lesión mecánica en la médula espinal. Además de la calidad de la preparación de la cirugía y el tejido, la estabilidad mecánica del tejido es de suma importancia para el éxito de la microscopía de lapso de tiempo, en particular el aislamiento de la médula espinal de la respiración artefacto de movimiento. La estabilidad puede evaluarse mediante la búsqueda de movimiento de la médula espinal en un microscopio de disección que corresponde a la frecuencia cardíaca o la respiración del animal. Estabilidad debe evaluar tanto el desempeño de la cirugía y también inmediatamente antes de comenzar la proyección de imagen. Si el ánimal no es estable, se deben hacer ajustes a la colocación y el apriete de las abrazaderas de la médula espinal. Modelos fluorescente específico reportero ratón de tipo celular, junto con enfoques quimeras de médula ósea han permitido la identificación de las células monocíticas frente microglia y axones. Estudios previos han revelado que los monocitos derivados de la sangre y no microglia son responsables de daño axonal secundaria después de un traumatismo utilizando la metodología descrita aquí 43. El dextrano tinte buque conjugado permite la identificación del buque, tanto para proporcionar puntos de referencia y de detectar infracciones de integridad de los vasos. La selección del modelo de ratón reportero fluorescente apropiado es crítico para permitir la correcta identificación de los tipos de células deseados a explorar.

Desarrollo de modelos de ratón fluorescentes que son apropiados para los estudios que está realizando también es fundamental para el éxito de los experimentos. Distinguir entre las dos poblaciones fagocíticas del CX3CR1 + / GFP Células en el SNC ha sido tradicionalmente difícil. Como se muestra aquí, una técnica inmunológica común, quimeras de irradiación, se puede utilizar para distinguir la radio-resistentes, microglia residente CNS de los macrófagos derivados de médula ósea. El procedimiento de irradiación tiene el potencial de dañar la barrera hematoencefálica y alterar fenotipos de células, por lo que el uso de este modelo debe ser considerado cuidadosamente. El alcance de estos cambios se diferencia con dosis de irradiación, así como la duración del período de recuperación, y su impacto en diferentes modelos inflamatorios no se ha estudiado completamente. Los efectos de la irradiación sobre CNS barrera hematoencefálica pueden ser minimizados mediante el blindaje de la cabeza durante la irradiación, y esto se ha demostrado que disminuye la infiltración de células en la médula espinal después de la irradiación, incluso si la médula espinal no está directamente protegido 52. Aquí hemos observado que el número de células infiltrantes en el SNC en estado de equilibrio como resultado de la generación de quimera es insignificante en contraste con el entumecidaer de las células que entran en la lesión. Otros modelos alternativos a considerar incluyen quimeras inducidas por fármacos 52 o modelos parabiotic ratón 53.

Aquí, hemos presentado un modelo de lesión específica pequeño, simple y reproducible, que resulta en una lesión de la materia blanca dorsal de la médula espinal que es fácil de imagen utilizando la microscopía de 2-fotón. Este método también proporciona una lesión cuantificable en analizar el grado de muerte regresiva axonal en las columnas dorsales que en la literatura ha sido, junto con el análisis complementario tejido fijado 16,18,43,48,54. En este modelo, los animales muestran sólo los déficits mínimos y no requieren cuidados especiales después de una lesión. Los estudios futuros que utilizan las técnicas de lesión por aplastamiento de la columna y de imágenes dorsales aquí descritos pueden ser poderosas herramientas de evaluación para evaluar la eficacia del tratamiento para la lesión de la médula espinal. Estos tratamientos pueden incluir inhibidores de moléculas pequeñas, fármacos, productos celulares, injertos de tejido y tratamiento combinatorios. La interacción entre macrófagos, microglia y neuronas son también probable que desempeñe un papel en otros modelos de enfermedad en la médula espinal, incluyendo esclerosis múltiple, tumores, meningitis y la esclerosis lateral amiotrófica, y esta técnica puede ser útil en el estudio de estas enfermedades, así .

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las siguientes agencias proporcionaron apoyo financiero crítico para este estudio: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick's Foundation (A.Y.H.), Alex's Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle's Angel Foundation (A.Y.H.) y Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). Los autores están agradecidos por la ayuda indispensable de Jerry Silver y Sarah Busch en el aprendizaje de la lesión por aplastamiento de la columna dorsal (DCC). Los autores también agradecen a Jingquang You, Elisabeth Hare y Hongmei Hu por su ayuda técnica con el genotipado y a Ross Anderson por montar la unidad estabilizadora de la columna vertebral.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CX3CR1 Ratones GFPLaboratorios Jackson5582
Thy-1 Ratones YFPH Laboratorios Jackson3782
Jaula para tarta de ratónBraintree ScientificMPC 2 set
60 mm2 Placade Petri Corning 430166Para el aislamiento de la médula ósea
Falcon 40 μ filtro de células mFisher Scientific08-771-1Para el aislamiento de la médula ósea
1 tubo cónico de 15 ml y 1 tubo cónico de 50 mlFisher ScientificPara el aislamiento de la médula ósea
aguja de calibre 21BD305177Para el aislamiento de la médula ósea
Jeringa de 1 mlBD309628Para el aislamiento de la médula ósea
Tampón de lisis ACKGibcoA10492-01Para hueso aislamiento de médula ósea
HBSSCorning Cellgro21-022-CVPara aislamiento de médula ósea
Medios RPMISigmaR8758Para aislamiento de médula ósea
Anticuerpo F4/80Ebioscience12-4801 PEPara FACS Verificación de quimeras
Jeringa de insulina de calibre 30BD328280Para inyección de venas de cola
Pinzas de médula espinalNarshingeSTS-APara la imagen
Ortho-Jet Dental Polvo acrílicoLang DentalREF1320Para la imagen
Ortho-Jet Dental Acrílico líquidoLang Dental REF1404Para la imagen
Esponjas de gelatina GelfoamPfizer9034201Para la imagen
4-0 Suturas EthilonEthilon1667GPara cirugía
Reflex Clips, 7 mmKent Scientific INS750344Para cirugía. Esterilizar antes
de usar Tijeras IrisFine Science Tools14061-09Para cirugía
Pinzas 45/5, DumoxelFine Science Tools11251-35Para cirugía
RongeursFine Science Tools16021-14Para cirugía
aguja de calibre 30BD305106Para hacer orificios de acceso en duramadre
Pinzas Dumont #4 Consejos de biologíaDumont11242-40Para cirugía
Destornilladores de agujasFine Science Tools12002-12Para cirugía
Pinzas Michel Wound Clip KentScientificINS700753Para cirugía
Removedor de pinzas para heridasFine Science Tools12033-00Para cirugía
Juntas tóricas para fórcepsFine Science Tools11200-00Para cirugía, A menudo provisto de pinzas # 4, también puede se puede pedir por separado
Recargable inalámbrico Recortador de animalesWahlSerie 8900para cirugía
Vetbond3M1469SBPara cirugía
Solución de Betadine (Solución tópica de providina y yodo al 10%)Purdue Products L.P.NDC 67618-150-08Para cirugía
Nair Loción removedora de velloChurch & Dwight Co., Inc.NRSL-22329-05Para cirugía
IsofluranoButler ScheinNDC 11695-6776-2Medicamentos – para cirugía
MarcaineHenry ScheinNDC 0409-1587-50Medicamentos – para cirugía 1,0 mg/kg administrados por vía subcutánea
BupernexHenry Schein121-7793Medicamentos – para cirugía buprenorfina 0,1 mg/kg
aCSFProductos químicos de Sigma119 mM NaCl
26.2 mM NaHCO3
2.5 mM KCl
1 mM NaH2PO4
1.3 mM MgCl2
10 mM glucosa		Para cirugía
De Cold Spring Harbor
Protocolos TRITC-dextrano 150,000 MWSigmaT1287Para administración intravenosa para etiquetar la vasculatura

Referencias

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