Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

Resumen

Aquí presentamos un protocolo aceptado por la comunidad en formato multimedia para inyectar subretinialmente un bolo de células EPR en ratas y ratones. Este enfoque se puede utilizar para determinar los potenciales de rescate, los perfiles de seguridad y las capacidades de supervivencia de las células EPR injertadas tras la implantación en modelos animales de degeneración de la retina.

Resumen

La conversión de la luz en impulsos eléctricos se produce en la retina externa y se lleva a cabo en gran medida por conos y bastones fotorreceptores y células del epitelio pigmentario de la retina (RPE). RPE proporcionar apoyo crítico a los fotorreceptores y la muerte o la disfunción de las células del EPR es característico de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de la pérdida permanente de la visión en personas mayores de 55 años. Si bien no hay cura para la DMAE ha sido identificado, la implantación de RPE saludable en ojos enfermos puede llegar a ser un tratamiento efectivo, y un gran número de células del EPR puede generarse fácilmente a partir de células madre pluripotentes. Varias preguntas interesantes sobre la seguridad y eficacia de la entrega de células RPE todavía pueden ser examinadas en modelos animales, y los protocolos bien aceptados utilizados para inyectar RPE se han desarrollado. La técnica descrita aquí ha sido utilizado por varios grupos en diversos estudios y consiste en crear primero un agujero en el ojo con una aguja afilada. A continuación, una jeringa con una blunt aguja cargada con células se inserta a través del agujero y pasa a través del humor vítreo hasta que toque suavemente el RPE. El uso de este método de inyección, que es relativamente simple y requiere un mínimo de equipo, logramos la integración coherente y eficaz de las células RPE derivadas de células madre en entre el RPE host que impide cantidad significativa de degeneración de los fotorreceptores en modelos animales. Aunque no es parte del protocolo real, también se describe cómo determinar la extensión de la trauma inducido por la inyección, y cómo verificar que las células fueron inyectadas en el espacio subretiniano en el uso de técnicas de imagen in vivo. Finalmente, el uso de este protocolo no se limita a las células del RPE; puede utilizarse para inyectar cualquier compuesto o de células en el espacio subretiniano.

Introducción

La retina sensorial está organizada en niveles funcionales de neuronas, glía y células endoteliales. Los fotorreceptores en la parte posterior de la retina se activan con la luz; A través de la fototransducción, convierten los fotones en señales eléctricas que son refinadas por las interneuronas y transmitidas a la corteza visual en el cerebro. La fototransducción no puede ocurrir sin los esfuerzos coordinados de las células del epitelio pigmentario de la retina y la glía de Mueller (EPR). Los EPR están organizados en una monocapa directamente detrás de los fotorreceptores y realizan múltiples y diversas funciones integrales para la función y la homeostasis de los fotorreceptores. De hecho, el EPR y los fotorreceptores son tan codependientes que se consideran una unidad funcional. La muerte o disfunción del EPR produce efectos secundarios devastadores sobre los fotorreceptores y se asocia con la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de ceguera en los ancianos^1,2.

Aunque no se ha descubierto una cura para la DMAE, varios estudios clínicos han demostrado que el reemplazo de células EPR puede ser una opción terapéutica prometedora^3-13. Con el advenimiento de la tecnología de células madre, ahora es posible generar un gran número de células EPR in vitro a partir de células madre pluripotentes embrionarias e inducidas (hES y hiPS) que se parecen mucho a sus contrapartes somáticas funcional y anatómicamente^14-26. También se ha demostrado que el EPR derivado de células madre funciona in vivo por múltiples grupos independientes, incluido el nuestro, para ralentizar significativamente la degeneración de la retina en líneas de ratas y ratones con degeneración espontánea de la retina^{16,18,21,22,25,28,29}. Esta combinación de evidencia clínica y preclínica de apoyo es tan convincente que actualmente se están llevando a cabo varios ensayos clínicos para prevenir la degeneración de la retina utilizando células RPE derivadas de células madre^30,31.

RPE puede derivarse fácilmente de hES y/o hiPS e implantarse en el espacio subretiniano de los roedores utilizando diversas técnicas de derivación e inyección^32,33. (Véase Westenskow et al. para un documento de métodos en formato multimedia que demuestra el protocolo de diferenciación dirigida que empleamos)³⁴. Quedan preguntas críticas por resolver con respecto a la seguridad, la supervivencia y la capacidad funcional de las células EPR administradas exógenamente en el momento de la implantación, por lo tanto, la capacidad de realizar inyecciones subretinianas en roedores es una habilidad crítica^{16,18,21,29,36,37}. La administración de RPE no es trivial y el campo se divide en la técnica de inyección más efectiva. El protocolo que describimos aquí es una forma sencilla y eficaz de administrar el bolo de células EPR por vía subretiniana, y se utilizó en el primer ensayo clínico para el trasplante de EPR derivado de células madre³¹. (El lector también puede consultar otro artículo de JoVE de Eberle et al. para una descripción alternativa de las inyecciones subretinianas en roedores. ^{Artículo 38})

La técnica descrita en este manuscrito no se puede visualizar y el trauma es inevitable (como con cualquier técnica de inyección subretiniana). Se realiza haciendo un orificio justo debajo de los vasos del limbo e insertando una aguja roma a lo largo de una ruta transescleral para inyectar un bolo de células debajo de la retina diametralmente opuesta. La persona que aplica la inyección sentirá resistencia cuando la aguja roma toque la retina. Sin embargo, las células se pueden visualizar directamente después de la inyección, y el grado de desprendimiento de retina inducido se puede determinar marcando las células del EPR con un marcador fluorescente transitorio y detectándolas con un oftalmoscopio de barrido confocal (cSLO). También se puede utilizar un sistema de tomografía de coherencia óptica (OCT) para controlar el traumatismo e identificar fácilmente el lugar de la inyección.

Protocolo

NOTA: Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las normas éticas establecidas por el Instituto de Investigación Scripps.

1. Preparación de los materiales para la inyección (~ 20 min)

1. Solución de disociación celular Pre-caliente (preferiblemente uno que se inactiva a través de la dilución, no con suero), PBS estéril y medios de cultivo (Tabla 1).
2. Esterilizar la jeringa con una aguja de punta roma por el desmontaje y hervir las partes en agua durante 15 min.

2. Preparación de las células del EPR para inyección (~ 30 min a 1 hr)

1. Separe las células del EPR utilizando solución de disociación de células pre-calentado por 5-8 minutos a 37 ° C.
2. Raspe las células suavemente para liberar cualquier que todavía esté conectado.
3. Diluir las células con un gran volumen de medios de cultivo (llenar un tubo de 15 ml) para inactivar la solución de disociación y contarlos.
4. Centrifugar a 800 xg durante 5 min para sedimentar las células.
5. Resuspender las células a 200.000 células / l (para entregar 100.000 células en un volumen de 0,5 l) en PBS precalentado estéril y transferirlos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
6. Opcionalmente, añada un marcador fluorescente transitoria de células vivas y se incuba a 37 ° C durante 30-45 min.
7. Cargar la jeringa con una aguja roma con 0,5 l de células. Inyectar las células tan pronto como sea posible.

3.-Sub retina Inyección (~ 5 min por inyección)

NOTA: Si es posible, aprender la técnica con ratas albinas adultas desde los vasos del limbo son mucho más fáciles de visualizar. Inyectar solución verde cuando el aprendizaje rápido (antes de tratar de inyectar las células) para facilitar más fácilmente la visualización del sitio de la inyección.

1. Anestesiar el roedor. Utilice inyecciones intraperitoneales de 100 mg / ml de ketamina y 10 mg / ml de xilazina (20 l / 10 g cuerpo wocho) sobre la inhalación de isofluorano ya que es difícil de maniobrar el roedor y se inyecta en el ojo con el hocico en el inhalador.
   1. Asegúrese de que el animal se anestesió profundamente pellizcando una de sus patas. Si se estremece, esperar varios minutos y vuelva a intentarlo antes de comenzar la inyección subretiniana.
2. Coloque el roedor a su lado para que el ojo que se inyecta se enfrenta el techo.
3. Bajo un microscopio de disección estirar suavemente la piel para que el ojo aparece ligeramente arriba de la toma (proptosis temporal) y se vuelve más accesible mediante la celebración de su cabeza con dos dedos justo por encima de la oreja y por su mandíbula y estirar suavemente la piel en paralelo a los párpados por lo que el ojo aparece ligeramente arriba de la toma (Ver Figura 1 C). No agarre el roedor demasiado cerca de la garganta.
4. Con una aguja previamente esterilizada desechable afilada 30 G, hacer un agujero justo debajo del limbo (si los vasos son golpeados, sangrado bE significativa y ser difícil de encontrar el agujero más adelante) y en un ángulo para evitar tocar la lente con la aguja (Figura 1D). Evite tocar la lente con la aguja (o roma) o la formación de cataratas inmediata va a producir.
   NOTA: Las inyecciones funcionan mejor con dos personas. De esta manera una persona puede pasar a la jeringa con la aguja roma a la persona que realiza la inyección después de haber creado el primer agujero con la aguja desechable afilado para mantener la atención en el dónde está el agujero.
5. Retraer la aguja desechable desde el ojo mientras se mantiene el agarre en la cabeza. Recuerde exactamente dónde está el agujero.
6. Después de cualquiera de montar la jeringa precargada con una aguja roma en un micromanipulador o sosteniéndolo con la mano, inserte la punta de la jeringa con la aguja roma a través del agujero, cuidando de nuevo de no tocar la lente, y empuje suavemente a través del ojo muy suavemente hasta sentir resistencia (Figura 1D).
7. Keeping todos los movimientos a un mínimo, inyectar cuidadosamente las células del EPR lentamente en el espacio subretiniano.
   NOTA: desprendimiento del EPR / retina se inducirá; esto es inevitable. Sin embargo, una inyección limpio minimiza el desprendimiento y mejora en gran medida las posibilidades de una reparación (Figura 1E). Cualquier movimientos exagerados pueden mover la aguja de nuevo en la retina, y movimientos laterales pueden dañar la retina. El uso de una bomba de inyección es opcional, pero permite una entrega muy precisa.
8. Retraer la jeringa lentamente. Aplicar hidratante gotas para los ojos para mantener el ojo hidratado.
9. Continúe controlando el animal hasta que recupera decúbito esternal. No deje de animales sin vigilancia o volver a una jaula con otros animales de alerta hasta que recupera decúbito esternal.

Resultados

Podemos entregar una suspensión de células del EPR en el espacio subretiniano de roedores rápida y consistente con la técnica descrita en este manuscrito. Aunque no es necesario, traumas pueden minimizar en gran medida el uso de la configuración se muestra con un micromanipulador en la figura 1A & B. Mantenga el roedor como se muestra en la Figura 1C para proptosis temporal. Los pasos son los mismos si se realiza con el micromanipulador oa mano; éstas se representan en los dibujos a...

Discusión

En este artículo se describe un método relativamente simple para realizar inyecciones subretinianas de células del EPR en suspensión en ratas y ratones. El protocolo es fácil de aprender y más experiencia con la técnica se traducirá en un menor número de traumas (Figura 3, lo que representa uno de los mejores inyecciones), especialmente si se utiliza un micromanipulador (Figura 1A). Cualquier trauma se puede monitorizar in vivo con un sistema de cSLO y OCT (Figura 2)

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-Mercaptoetanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Caja x 1
CellTracker Verde CMFDA	Sondas Moleculares	C34552	50 µ g x 20
DPBS, sin calcio, sin magnesio	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Verde Rápido	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Gotas de gel gentiles Gotas lubricantes para los ojos de moderado a severo	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Modelo 62 RN SYR	Hamilton	87942	Jeringa x 1
Aguja Hamilton 33 G, 0.5", punto 3 (acero inoxidable 304)	Hamilton	7803-05	Agujas x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Reemplazo	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamina 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Soporte Magnético	Leica Biosystems		Soporte 39430216 x 1
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulador	Leica Biosystems		Manipulador de 3943001 x 1
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Jeringas de punta deslizante sin agujas BD  (3 ml)	de BD309656	VWR	x 1
aguja de uso especial BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Caja x 1
Enzima TrypLE Express (1X), sin rojo fenol	Gibco	12604013	100 ml x 1

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