Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

Resumen

Aquí presentamos un protocolo aceptado por la comunidad en formato multimedia para inyectar subretinialmente un bolo de células EPR en ratas y ratones. Este enfoque se puede utilizar para determinar los potenciales de rescate, los perfiles de seguridad y las capacidades de supervivencia de las células EPR injertadas tras la implantación en modelos animales de degeneración de la retina.

Resumen

La conversión de la luz en impulsos eléctricos se produce en la retina externa y se lleva a cabo en gran medida por conos y bastones fotorreceptores y células del epitelio pigmentario de la retina (RPE). RPE proporcionar apoyo crítico a los fotorreceptores y la muerte o la disfunción de las células del EPR es característico de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de la pérdida permanente de la visión en personas mayores de 55 años. Si bien no hay cura para la DMAE ha sido identificado, la implantación de RPE saludable en ojos enfermos puede llegar a ser un tratamiento efectivo, y un gran número de células del EPR puede generarse fácilmente a partir de células madre pluripotentes. Varias preguntas interesantes sobre la seguridad y eficacia de la entrega de células RPE todavía pueden ser examinadas en modelos animales, y los protocolos bien aceptados utilizados para inyectar RPE se han desarrollado. La técnica descrita aquí ha sido utilizado por varios grupos en diversos estudios y consiste en crear primero un agujero en el ojo con una aguja afilada. A continuación, una jeringa con una blunt aguja cargada con células se inserta a través del agujero y pasa a través del humor vítreo hasta que toque suavemente el RPE. El uso de este método de inyección, que es relativamente simple y requiere un mínimo de equipo, logramos la integración coherente y eficaz de las células RPE derivadas de células madre en entre el RPE host que impide cantidad significativa de degeneración de los fotorreceptores en modelos animales. Aunque no es parte del protocolo real, también se describe cómo determinar la extensión de la trauma inducido por la inyección, y cómo verificar que las células fueron inyectadas en el espacio subretiniano en el uso de técnicas de imagen in vivo. Finalmente, el uso de este protocolo no se limita a las células del RPE; puede utilizarse para inyectar cualquier compuesto o de células en el espacio subretiniano.

Introducción

La retina sensorial está organizada en niveles funcionales de neuronas, glía y células endoteliales. Los fotorreceptores en la parte posterior de la retina se activan con la luz; A través de la fototransducción, convierten los fotones en señales eléctricas que son refinadas por las interneuronas y transmitidas a la corteza visual en el cerebro. La fototransducción no puede ocurrir sin los esfuerzos coordinados de las células del epitelio pigmentario de la retina y la glía de Mueller (EPR). Los EPR están organizados en una monocapa directamente detrás de los fotorreceptores y realizan múltiples y diversas funciones integrales para la función y la homeostasis de los fot....

Protocolo

NOTA: Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las normas éticas establecidas por el Instituto de Investigación Scripps.

1. Preparación de los materiales para la inyección (~ 20 min)

1. Solución de disociación celular Pre-caliente (preferiblemente uno que se inactiva a través de la dilución, no con suero), PBS estéril y medios de cultivo (Tabla 1).
2. Esterilizar la jeringa con una aguja de punta roma por el desmontaje y hervir las partes en agua durante 15 min.

2. Preparación de las células del EPR para inyección (~ 30 min a 1 hr)

Resultados

Podemos entregar una suspensión de células del EPR en el espacio subretiniano de roedores rápida y consistente con la técnica descrita en este manuscrito. Aunque no es necesario, traumas pueden minimizar en gran medida el uso de la configuración se muestra con un micromanipulador en la figura 1A & B. Mantenga el roedor como se muestra en la Figura 1C para proptosis temporal. Los pasos son los mismos si se realiza con el micromanipulador oa mano; éstas se representan en los dibujos a.......

Discusión

En este artículo se describe un método relativamente simple para realizar inyecciones subretinianas de células del EPR en suspensión en ratas y ratones. El protocolo es fácil de aprender y más experiencia con la técnica se traducirá en un menor número de traumas (Figura 3, lo que representa uno de los mejores inyecciones), especialmente si se utiliza un micromanipulador (Figura 1A). Cualquier trauma se puede monitorizar in vivo con un sistema de cSLO y OCT (Figura 2)

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-Mercaptoetanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Caja x 1
CellTracker Verde CMFDA	Sondas Moleculares	C34552	50 µ g x 20
DPBS, sin calcio, sin magnesio	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Verde Rápido	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Gotas de gel gentiles Gotas lubricantes para los ojos de moderado a severo	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Modelo 62 RN SYR	Hamilton	87942	Jeringa x 1
Aguja Hamilton 33 G, 0.5", punto 3 (acero inoxidable 304)	Hamilton	7803-05	Agujas x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Reemplazo	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamina 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Soporte Magnético	Leica Biosystems		Soporte 39430216 x 1
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulador	Leica Biosystems		Manipulador de 3943001 x 1
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Jeringas de punta deslizante sin agujas BD  (3 ml)	de BD309656	VWR	x 1
aguja de uso especial BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Caja x 1
Enzima TrypLE Express (1X), sin rojo fenol	Gibco	12604013	100 ml x 1

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