Artículo de método

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos

DOI:

10.3791/52259

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3 de enero de 2015

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1Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 2Department of Internal Medicine II, University Hospital Tübingen

En este artículo

Resumen

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Los ensayos de esferas in vitro se utilizan comúnmente para identificar células madre cancerosas. Aquí comparamos ensayos de esferas individuales con ensayos basados en múltiples células. Los ensayos más laboriosos basados en células individuales o la suplementación con metilcelulosa dan resultados más precisos, mientras que los ensayos basados en células múltiples realizados en medio líquido pueden verse muy influenciados por la densidad celular.

Resumen

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Años de investigación indican que los cánceres de ovario albergan una mezcla heterogénea de células, incluyendo una subpoblación de las llamadas "células madre cancerosas" (CSCs) responsables de la iniciación, mantenimiento y recaída del tumor después de las quimioterapias convencionales. Por lo tanto, la identificación de las CSC ováricas es un objetivo importante. Un método comúnmente utilizado para evaluar el potencial de CSC in vitro es el ensayo de esferas, en el que las células se siembran en condiciones de cultivo no adherentes en un medio libre de suero suplementado con factores de crecimiento y la formación de esferas se puntúa después de unos días. Aquí, revisamos los protocolos actualmente disponibles para los ensayos de esferas de cáncer de ovario humano y realizamos un análisis lado a lado entre los ensayos basados en múltiples células de uso común y un sistema más preciso basado en la siembra de una sola célula. Nuestros resultados indican que tanto los ensayos de esferas multicelulares como los basados en células individuales se pueden utilizar para investigar la formación de esferas in vitro. Los ensayos basados en células individuales, más laboriosos y costosos, son más adecuados para la evaluación funcional de células individuales y conducen a resultados generales más precisos, mientras que los ensayos basados en células múltiples pueden verse fuertemente influenciados por la densidad de las células en placa y requieren experimentos de valoración por adelantado. La suplementación con metilcelulosa en ensayos basados en múltiples células se puede utilizar eficazmente para reducir los artefactos mecánicos.

Introducción

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Cada vez hay más evidencia de que los carcinomas de ovario están formados por mezclas heterogéneas de células y albergan las llamadas "células madre cancerosas" (CSCs) responsables del inicio, mantenimiento y recaída de la enfermedad después de las terapias citotóxicas convencionales1-3. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias moleculares dirigidas a las CSC de ovario es un objetivo importante y promete mejorar la terapia de las pacientes con cáncer de ovario.

Un requisito previo para la comprensión de las características moleculares de las CSCs es su aislamiento fiable de las no CSCs. Sin embargo, la identificación de las CSC ováricas parece ser un desafío. Si bien se ha reportado que la expresión de CD133 y la actividad de la aldehído deshidrogenasa (ALDH)4,5 marcan las CSC ováricas, algunos datos indican que estos marcadores son inestables6. Consistentemente, en el cáncer de ovario, excepto, por ejemplo, en el carcinoma de mama7, la expresión de ALDH1 se asocia con un resultado favorable8 y la expresión de la variante propuesta del marcador de células madre CD44 no tiene valor pronóstico9. Más recientemente, hemos demostrado que la expresión de la proteína de células madre embrionarias SOX2 confiere tallo a las células de carcinoma de ovario10 y la alta expresión de SOX2 se asocia con carcinomas de ovario y mama clínicamente agresivos11,12. Por lo tanto, en este informe utilizamos una construcción reportera lentiviral que contiene una proteína de fluorescencia roja (RFP) cuya expresión está controlada por una región reguladora de SOX2, como método para aislar CSC ováricas putativas.

Por definición, las CSC pueden autorenovarse y diferenciarse, dando lugar a todos los tipos de células tumorales. Las poblaciones putativas de CSC necesitan ser analizadas en ensayos funcionales realizados in vivo. Por razones obvias, en las células humanas estas pruebas funcionales se limitan a ensayos de xenoinjertos, que comprenden principalmente el trasplante de células tumorales humanas en ratones inmunocomprometidos10,13.

Un método alternativo in vitro fue ofrecido por Brent Reynolds y Sam Weiss, quienes informaron por primera vez del llamado ensayo de la neurosfera como un ensayo sustituto que evalúa el potencial madre en las células neuronales14. Dontu y colaboradores confirmaron posteriormente el uso de este ensayo para evaluar el potencial de las células madre en las células mamarias15,16. Aquí, las células mamarias humanas se sembraron en diferentes cantidades en un medio libre de suero suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), B-27 y heparina y se cultivaron en condiciones no adherentes durante siete a diez días antes de que la formación de esferas se determinara mediante microscopía. Siguiendo este protocolo con algunos ajustes en el número de células, el medio de crecimiento y los suplementos, varios grupos han explorado el potencial de las células madre in vitro de varios tipos de cáncer como los tumores de mama17, cerebro18, páncreas19 y colon20. En el carcinoma de ovario, recientemente hemos reportado la factibilidad del ensayo de esferas y comparado sus resultados con los recolectados en modelos de xenoinjerto murino in vivo 10. Encontramos que la sobreexpresión de la proteína de células madre SOX2 mejoró tanto la formación de esfera in vitro como la tumorigénesis in vivo de las células de carcinoma de ovario humano10. Sin embargo, la frecuencia de células iniciadoras de esferas fue mayor que la frecuencia de células iniciadoras de tumores medida in vivo10, lo que sugiere que el ensayo de esfera puede dar lugar a resultados falsos positivos debido a razones técnicas o, alternativamente, el ensayo in vivo puede ser ineficiente y dar lugar a resultados falsos negativos.

En este informe, analizamos con más detalle los ensayos de esferas ováricas basados en múltiples células, revisamos los diferentes protocolos disponibles en la literatura y los comparamos con un ensayo basado en una sola célula. Demostramos que el ensayo basado en una sola célula proporciona resultados más precisos y reproducibles que los ensayos basados en múltiples células, que pueden estar muy influenciados por la densidad de las células en placa, a menos que se agregue metilcelulosa a los cultivos para inmovilizar las células. Sin embargo, también en los ensayos basados en células individuales, el potencial de iniciación de la esfera in vitro se observa con mayor frecuencia que el potencial de iniciación tumoral in vivo.

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Protocolo

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1. Generación de células humanas de carcinoma de ovario OVCAR-3 estable transduced con lentivirus que contiene el reportero construir Sox2 Región Reguladora

  1. Generar partículas lentiviral por transfección de la línea celular 293T-embalaje HEK con un reportero construir el reconocimiento de una región reguladora Sox2 descrita 10,21.
    NOTA: La construcción informadora contiene además un dominio de desestabilización del sistema de protección ProteoTuner por delante de la proteína de fluorescencia tdTomato. Shield1 se une al dominio de desestabilización evitando así que el proteasoma para degradar la proteína de fluorescencia 22.
  2. Transducir OVCAR-3 células con partículas lentivirales más de un período de tiempo de 24 hr. Después, eliminar el sobrenadante viral y lavar las células con tampón fosfato salino (PBS) y se cultivaron en medio completo (RPMI suplementado con 10% FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina).
  3. 48 horas más tarde, 10 mg / ml puromicina se añadieron a las culturas y se mantuvo durante 5 días para permitir la selección de células transducidas correctamente.

2. Preparación de la clasificación celular y Chapado

  1. Añadir Shield1 a escala 1: 1000 dilución 24 horas antes de la clasificación de células. Utilice células transducidas de forma estable OVCAR-3 sin tratamiento Shield1 como controles negativos (Figura 1). Aspirar los medios de frasco, lavar las células con PBS 1x y trypsinize células con 0,05% de tripsina-EDTA durante 3 min.
  2. Detener la tripsina mediante el uso de medio completo (véase más arriba), contar el número de células, centrifugar las células a 300 xg a temperatura ambiente (15 - 25 ° C) durante 5 min.
  3. Decantar el sobrenadante y volver a suspender las células cuidadosamente en 0,5 a 1 ml de PBS estéril.
  4. Utilice 40 micras filtro tapa filtro de células para obtener la suspensión de una sola célula.
  5. Ajuste el recuento de células a 5 millones de células por ml.
  6. Preparar bajo de fijación placas de ultra 96 ​​pocillos con 100 l esferas medio (MEGM suplementado con factores de crecimiento, citoquinas, y suplementos,B-27, heparina-sodio; o DMEM / F12 suplementado con factores de crecimiento, citoquinas, y suplementos, B-27, heparina-sodio con o sin adición de 1% de metilcelulosa, ver también la Tabla 1). Opcionalmente añadir antibióticos al medio a una concentración de 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina para reducir al mínimo el riesgo de posible contaminación.
  7. Ordenar células RFP- en placas de 96 pocillos preparados desde arriba + RFP y, 1 célula por pocillo (esferas ensayo basado en células individuales) y 100 células por pocillo (multi ensayo esferas basadas en células), respectivamente. Realizar clasificador de células tipo de venta en comercios (ver Materiales) usando el modo de célula única, Sort configuración: 100 μ boquilla, presión de funda 20 psi, y el rendimiento de la máscara 0, la máscara de pureza 32, máscara de fase 16.
  8. Evaluar la eficiencia chapado al anotar microscópicamente los pocillos que contenían células (para el ensayo basado en células individuales) y contando el número de células en pocillos individuales (para el ensayo basado en células múltiples; Figura 2 ).
  9. Se incuban las células en condiciones estándar en esferas medianas (para la composición véase el paso 2.6) a 37 ° C y 5% de CO 2. Suplemento diario bFGF (20 ng / ml) y EGF (20 ng / ml).
  10. Después de una semana, contar números de emergente esferas tumorales utilizando un microscopio estándar con 4X o un aumento de 10X y un microscopio de fluorescencia para detectar la señal de fluorescencia del sistema reportero integrado. Cuente esferas con un diámetro superior a 100 micras como esferas "grandes", y esferas de diámetro 50 - 100 micras como esferas "pequeños" (Figura 3). Asegúrese de que usted cuenta esferas reales y no teléfonos clusters.
    NOTA: En los ensayos basados ​​en células individuales formación esfera es más fácil de marcar microscópicamente después de 10 (frente a 7) días de cultivo.
  11. Calcular la proporción de células de formación de esferas en RFP + y células, respectivamente RFP- en ensayos basados ​​en células individuales (una placa de 96 pocillos para cada experimento individual) o múltiples de células-baensayos sed esferas (uno así para cada experimento individual) expuestos por Shaw et al. 16
    NOTA: Proporción de formar esfera células (%) = (número de esferas) / (número de células sembradas) x 100

3. pasada en serie de esferas

  1. Coloque el contenido de cada pocillo en un tubo estéril apropiado y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA. Por esferas ensayos basados ​​en células múltiples, recoger juntos las esferas de un pozo. Lavar el bien de 3 - 5 veces con PBS y centrifugar 2 min más. Por esferas ensayos basados ​​en células individuales, recoger esferas individuales. Debido al bajo número de celdas, utilice tubos de 1,5 ml para las etapas de centrifugación y lavado.
  2. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 200 l de 0,05% de tripsina-EDTA.
  3. Con el fin de conseguir la separación óptima de la célula, se incuba la suspensión celular a 37 ° C durante 5 min en un agitador suave. Optimizar tripsinación hora de su línea celular a una menor tasa de muerte celular: si no hay grandesesferas es triturado visible suavemente con una punta de pipeta 100 l. En el caso de las grandes esferas todavía están presentes, se incuban con tripsina otros 3 min y luego proceder a la etapa de trituración. En caso de una sola ensayos basados ​​en células que asegúrese de optimizar el tiempo para el rendimiento óptimo de las células de las células vivas durante la etapa de tratamiento con tripsina.
  4. Para inactivar la tripsina, añadir 500 l de medio completo y se centrifuga a 300 xg durante 10 min, en el caso de ensayos de células individuales, se centrifuga durante 2 min adicionales.
  5. Eliminar las células sobrenadante y resuspender cuidadosamente en medio esferas.
  6. Utilice un filtro de tapón del filtro celular 40 micras para obtener una suspensión de una sola célula.
  7. En el caso de utilizar células RFP- en ensayos de células-bassed múltiples RFP + y, evaluar el porcentaje de células fluorescentes en cada pocillo después de la resuspensión citómetro de flujo a través de análisis.
  8. Para los ensayos de resiembra de serie de células individuales, semillas de 1 célula por pocillo en un nuevo bajo de fijación placa de 96 pocillos de ultra preparados como se detalla anteriormente. De una esfera individual, sembrar aproximadamente 20 pozos individuales. Para los ensayos de resiembra de múltiples esferas primarias basados ​​en células, las células de semillas obtienen a partir de un pocillo de esferas primarias en una nueva placa de 96 pocillos y contar el número de células por microscopía día siguiente.
  9. Evaluar la proporción de células de formación de esferas en ensayos de esferas secundarias utilizando la fórmula descrita en el paso 2,11.

Análisis 4. Resultado

  1. Analizar los resultados de los experimentos realizados por triplicado independientes y utilizar la prueba t de Student bilateral para analizar los valores normalmente distribuidos y de otro tipo de Mann-Whitney-Tests para el análisis estadístico.

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Resultados

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En los ensayos de esferas convencionales, casi el 40% de RFP + OVCAR-3 células vs. 20% de las células RFP- dio lugar a una esfera tumor individual en el ensayo de esferas primaria (Figura 4A). Por otra parte, esferas formadas por las células RFP + eran más grandes en tamaño que los formados por células RFP-.

Cuando chapada en ensayos basados ​​en células individuales, células RFP + también formaron más esferas que las células RFP-, lo que confirma los resultados anteriores. ...

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Discusión

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Culturas esferas son un método ampliamente utilizado para ensayar el potencial de células madre de cáncer y enriquecer para las células-madre como en una amplia gama de células tumorales humanas 15,25,26. Bajo estas condiciones de cultivo, se espera que las células cancerosas que carecen de la capacidad de auto-renovación de diferenciar y eventualmente someterse a la muerte celular. Aunque pueden formar inicialmente grupos de células o incluso esferas tumorales especialmente en ensayos primarios, no son capac...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este estudio fue financiado por una subvención de la Baden-Württemberg Stiftung (Programa de Células Madre Adultas II) otorgada a C.L. Agradecemos a la Dra. Martina Konantz por su aporte crítico y revisión del manuscrito. Agradecemos a Emmanuel Traunecker y Toni Krebs del DBM FACS Facility (Hospital Universitario de Basilea) por su ayuda en la clasificación de FACS.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de baja fijaciónCorning3474
MEGMLonzaCC-3151
InsulinaLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
HidrocortisonaLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFSigmaE9644concentración final: 20 ng/ml
FGFPeproTech100-18Bconcentración final: 20 ng/ml
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044concentración final: 1X
Heparina-Natrium-25000 IERatiopharmN68542.02dilución 1:1.000
Pluma/EstreptococoGibco15140-122
FCSGibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Trypsin-EDTAGibco25300-054
Dulbecco' s PBS (1X)Gibco14190-094
Shield1Clontech632189dilución 1:1.000
DMEM/F12Gibco21041-025
DMEM/F12 (polvo)Gibco42400-010
MetilcelulosaSigmaM0387
Clorhidrato de puromicinaApplichemA2856
Cell clasificadorBDAria III clasificador de células
FACS analizadorBDAccuri c6 citómetro de flujo
MicroscopioOlympusIX50 Osiris

Referencias

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