Este protocolo describe técnicas para el aislamiento de células vivas y el cultivo primario de líneas celulares miogénicas y fibroblastas a partir de tejido muscular o cutáneo. También se describe una técnica para la inmortalización de estas líneas celulares. En conjunto, estos protocolos proporcionan una herramienta fiable para generar y preservar células derivadas de pacientes para aplicaciones posteriores.
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Artículo de método
El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades
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Resumen
Resumen
La generación de líneas celulares específicas del paciente representa una herramienta inestimable para la investigación diagnóstica o traslacional, y estas células pueden recogerse a partir del tejido de la biopsia de piel o músculo disponible durante el estudio diagnóstico del paciente. En este protocolo, describimos una técnica para el aislamiento de células vivas a partir de pequeñas cantidades de músculo o tejido cutáneo para el cultivo primario de células. Además, proporcionamos una técnica para la inmortalización de líneas celulares miogénicas y líneas celulares de fibroblastos a partir de células primarias. Una vez que las líneas celulares se inmortalizan, se puede lograr una expansión sustancial de las células derivadas del paciente. Las células inmortalizadas son susceptibles de muchas aplicaciones posteriores, como el cribado de fármacos y la corrección in vitro de la mutación genética. En conjunto, estos protocolos proporcionan una herramienta fiable para generar y preservar células derivadas de pacientes para aplicaciones posteriores.
Introducción
El diagnóstico molecular ha evolucionado drásticamente en los últimos 20 años. El ADN genómico ahora se aísla rutinariamente del esputo o del hisopo de la mejilla, mientras que en el pasado requería una extracción de sangre. Con el rápido tiempo de respuesta actual y la facilidad de secuenciación de genes, muchas mutaciones de enfermedades se identifican de forma rutinaria sin necesidad de pruebas adicionales. En el caso del diagnóstico de enfermedades musculares, la identificación de docenas de nuevos genes en la última década responsables de la distrofia muscular o la miopatía ha cambiado drásticamente la forma en que se diagnostican estas enfermedades 1,2
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Protocolo
NOTA: Los protocolos para la recolección de tejido humano deben ser revisados y aprobados por el Comité Institucional IRB. Colección de descartados, el tejido humano de-identificado ha sido aprobado por los Comités IRB Hospital Brigham y Hospital de la Mujer y la Infancia de Boston. Los métodos descritos a continuación se han aplicado para el aislamiento de células miogénicas de desidentificados, descartado tejido. Los métodos descritos son aplicables a tejido recogido a partir de material paciente consentido.
Aislamiento 1. celular
- La disociación de la biopsia muscular y la purificación de células miogénicas
- Pre-pes....
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Resultados
La Figura 1 ilustra algunos de los pasos clave que participan en la disociación tejido primario: la cantidad exacta de tejido se pesa en una placa de cultivo tisular de Petri estéril (Figura 1A, B). El tejido se pica finamente utilizando escalpelos estériles, hasta que se obtuvo una suspensión de tejido (Figura 1C, D). Después de la adición de las enzimas de digestión, músculo primario de disociación del tejido se consigue normalmente mediante digestión enzimática dentr.......
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Discusión
Las células como un recurso útil
El aislamiento y el cultivo de poblaciones de células miogénicas es extremadamente útil cuando se establece fenotipos de la enfermedad o en modelos in vitro de la enfermedad. El procedimiento de aislamiento de células myogenic aquí descrito permite el aislamiento de los mioblastos y fibroblastos a partir de muestras de músculo esquelético, que luego pueden ser propagados, diferenciada, o inmediatamente analizadas. La estructura y función de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta publicación está financiada a través de Cure CMD, una beca de la Asociación Contre Les Myopathies (AFM) (proyecto 16297), y por los Institutos Nacionales de Salud (números de subvención K08 AR059750, L40 AR057721 y 2R01NS047727).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo | |||
| Tissue campana de bioseguridad para cultivo | Baker Company, Inc. | Centrífuga de sobremesa con campana | |
| , como el modelo Beckman | Beckman Coulter | Modelo Allegra 6R | Si se realiza la clasificación de células, se prefiere una centrífuga con refrigeración |
| Microscopio | Nikon | Modelo Eclipse TS100 | |
| Incubadora de cultivo de tejidos, conectada a una fuente de CO2 Forma | Scientific | Serie II | |
| Clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) | Becton Dickinson | Model Aria | |
| Reactivos para el aislamiento de mioblastos primarios de tejido | |||
| Dispasa II | Roche Applied Science | #04942078001 | Prepare una solución de calcetín de 2,4 U/ml en |
| DMEM Colagenasa D | Roche Applied Science | #088882001 | Prepare una solución madre de 10 mg/ml |
| 1x Sterile Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS), libre de calcio y magnesio | GIBCO Life Technologies | #14185-052 | |
| Albúmina sérica bovina, fracción V | Sigma | #05470 | Prepare una solución estéril de 1X HBSS 0.5% BSA para la clasificación FACS |
| Medio de crecimiento estéril para mioblastos: Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM) con glucosa alta (4,5 g) suplementado con un 30% de suero fetal bovino | GIBCO Life Technologies | 11965-092 | Contiene L-glutamina |
| Solución de lisis RBC | Qiagen | 158904 | |
| Yoduro de propidio stock 10mg/ml | Sigma | P4170 | Prepare la solución madre diluyendo el polvo en agua destilada estéril |
| Anticuerpo anti-CD56 humano para citometría de flujo | Biolegend | 318310 | Anticuerpo conjugado con APC, se pueden utilizar otras etiquetas |
| Reactivos para la inmortalización de mioblastos primarios | |||
| empaquetamiento Ecotropic | PE Cell Biolabs | RV-101 | |
| Línea celular de empaquetamiento anfotrópico PA3174 | Cell Biolabs | RV-102 | |
| Gelatina de piel de cerdo | Sigma | G1890-500g | Prepare una solución madre de gelatina al 0,1% en agua. Cubra el plato con la solución a 37 grados; C durante una hora. Retire la solución y agregue el medio. |
| PolyJet | Signagen | SL100688 | |
| G418 | Fisher | 345812 | |
| Hygromycin | de Biosciences | 400051 | |
| pBabe que contienen mCDK4 y hTERT | no están disponibles | Stadler et al, 2013 | |
| Qiagen plasmid midiprep kit | Qiagen | 12143 | |
| Medium 199 | Life Technologies | Medio 199 (31150022) | |
| Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM) | Life Technologies | DMEM (11965-092) | Mix 4:1 DMEM:199 |
| Medio de crecimiento de mioblastos: 4:1 Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM) y Medium 199 suplementado con 15% de suero fetal bovino; Búfer HEPES de 0,02 M; 1,4 mg/L de vitamina B12; 0,03 mg/L de ZnSO4, 0,055 mg/L de dexametasona, 2,5 μ g/L de factor de crecimiento de hepatocitos y 10 μ g/L de factor de crecimiento de fibroblastos beta. | Tecnología de la vida (DMEM, F199); Biológico de Atlanta (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (Sulfato de zinc); Sigma (Vit.B12, dexametasona); Chemicon Internacional (HGF); Biopionero (betaFGF) | #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). | Prepare el medio y la solución madre Vit. B12 (20 mg/ml); Sulfato de zinc (60µ g/ml); Dex (55µ g/µ l) por separado para facilitar su uso. Solución madre de HGF (5µ g/ml) y FGF (20µ g/ml) deben añadirse frescamente cada semana a la concentración final de trabajo. |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 | |
| Anticuerpo de cadena pesada de miosina para inmunotinción | Banco de hibridomas del desarrollo | Clon MF20 MF20 | |
| Desmin Anticuerpo para inmunotinción | Thermo Scientific | MS-376-S0 | Clon D33 |
| Suero de caballo | Invitrogen | 26050-088 | |
| Reactivos para el aislamiento primario de fibroblastos cutáneos | |||
| Medio de transporte: RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 0,2% de penicilina/estreptomicina | Medio RPMI 1640: GIBCO Life Technologies | 11875-093 | |
| Medio de cultivo de fibroblastos primarios humanos: RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicina | Suero fetal bovino: Thermo Scientific | SH30071.03 | |
| Solución de colagenasa: Colagenasa tipo 2 (100 mg) resuspendida en 12,5 ml de medio de cultivo de fibroblastos y esterilizada con filtro | Worthington | 4176 | |
| Tampón de fosfato estéril 1X solución salina (PBS) sin calcio ni magnesio | Lonza | 17-516F | |
| Materiales para el aislamiento de mioblastos primarios | |||
| 50 ml y 15 ml | GeneMate/Bioexpress | C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))Bisturíes | |
| estériles | Aspen Surgical | 372610 | |
| Hemocitómetro | Hausser Scientific | 1492 | |
| Pipetas estériles de 5, 10 y 25 ml Bellco | glass | 1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml) | pipetas reutilizables se lavan, se taponan con algodón y se esterilizan en autoclave antes de su uso |
| Platos de plástico estériles tratados con cultivo de tejidos (10 cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Coladores de células de nailon estériles (100 µ m y 40 y micro; tamaño m) | BD Falcon | 352340 (40µ m); 352360 (100µ m) | |
| Materiales para la inmortalización de | |||
| Estéril 0,45 y micro; m filtros | Millipore | SLHV013SL | |
| Anillos de clonación | Corning | #3166-8 | Para limpiar y esterilizar en autoclave antes y después de su uso |
| Materiales para líneas celulares de fibroblastos | |||
| Placas de plástico estériles de 35 mm tratadas con cultivo de tejidos | Greiner bio-one | 628160 | |
| Bisturíes estériles | DeRoyal | D4510A | |
| Matraces estériles para cultivo de tejidos T25 | Techno Plastic Product, TPP | 90026 | vendido en los EE. UU. por MIDSCI |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 |
Referencias
- Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
- Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
- Sharples, A. P., Stewart, C. E.
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.
A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette
