Artículo de método

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

DOI:

10.3791/52307

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18 de enero de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital

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Resumen

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Este protocolo describe técnicas para el aislamiento de células vivas y el cultivo primario de líneas celulares miogénicas y fibroblastas a partir de tejido muscular o cutáneo. También se describe una técnica para la inmortalización de estas líneas celulares. En conjunto, estos protocolos proporcionan una herramienta fiable para generar y preservar células derivadas de pacientes para aplicaciones posteriores.

Resumen

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La generación de líneas celulares específicas del paciente representa una herramienta inestimable para la investigación diagnóstica o traslacional, y estas células pueden recogerse a partir del tejido de la biopsia de piel o músculo disponible durante el estudio diagnóstico del paciente. En este protocolo, describimos una técnica para el aislamiento de células vivas a partir de pequeñas cantidades de músculo o tejido cutáneo para el cultivo primario de células. Además, proporcionamos una técnica para la inmortalización de líneas celulares miogénicas y líneas celulares de fibroblastos a partir de células primarias. Una vez que las líneas celulares se inmortalizan, se puede lograr una expansión sustancial de las células derivadas del paciente. Las células inmortalizadas son susceptibles de muchas aplicaciones posteriores, como el cribado de fármacos y la corrección in vitro de la mutación genética. En conjunto, estos protocolos proporcionan una herramienta fiable para generar y preservar células derivadas de pacientes para aplicaciones posteriores.

Introducción

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El diagnóstico molecular ha evolucionado drásticamente en los últimos 20 años. El ADN genómico ahora se aísla rutinariamente del esputo o del hisopo de la mejilla, mientras que en el pasado requería una extracción de sangre. Con el rápido tiempo de respuesta actual y la facilidad de secuenciación de genes, muchas mutaciones de enfermedades se identifican de forma rutinaria sin necesidad de pruebas adicionales. En el caso del diagnóstico de enfermedades musculares, la identificación de docenas de nuevos genes en la última década responsables de la distrofia muscular o la miopatía ha cambiado drásticamente la forma en que se diagnostican estas enfermedades 1,2. Actualmente, hay docenas de genes que se han identificado como causas de la distrofia muscular y la miopatía congénita, aunque los mecanismos por los cuales muchos de estos genes producen la enfermedad siguen sin estar claros. En particular, las enfermedades raras constituyen un desafío debido al pequeño tamaño de las poblaciones de pacientes. Para estos casos, así como para enfermedades más comunes, es muy deseable la generación de herramientas estables que faciliten los estudios sobre el mecanismo de patogenia y el cribado de fármacos terapéuticos.

A pesar del progreso dramático en el diagnóstico de ADN, las biopsias musculares todavía se realizan para establecer el diagnóstico primario en muchos pacientes en los que se sospecha una enfermedad metabólica o muscular primaria. Cuando es necesaria una biopsia muscular, ofrece la oportunidad de realizar una recolección adicional de tejido de diagnóstico e investigación con un riesgo mínimo de morbilidad adicional para el paciente. Dado que hay una serie de usos para cada muestra de tejido, es muy deseable establecer técnicas para el cultivo celular primario utilizando tejido quirúrgico que sean sencillas, eficientes y que requieran cantidades mínimas de tejido. Se requiere un triaje adecuado de las biopsias de músculo o piel para maximizar el aislamiento de las células primarias del tejido y el almacenamiento a largo plazo de material vivo. Además, la investigación con células madre y el cribado de fármacos son muy prometedores para el desarrollo de terapias para muchas enfermedades mediante ensayos basados en células 3,4.

Describimos aquí métodos para el aislamiento primario de células a partir de biopsias de músculo o piel humanas. Además, incluimos un protocolo para la inmortalización de células miogénicas, que es útil para generar grandes cantidades de células a partir de un individuo. Estas células se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, como los cribados de fármacos personalizados, que de otro modo serían inalcanzables con el bajo número general de células obtenidas del tejido primario.

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Protocolo

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NOTA: Los protocolos para la recolección de tejido humano deben ser revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional IRB. Colección de descartados, el tejido humano de-identificado ha sido aprobado por los Comités IRB Hospital Brigham y Hospital de la Mujer y la Infancia de Boston. Los métodos descritos a continuación se han aplicado para el aislamiento de células miogénicas de desidentificados, descartado tejido. Los métodos descritos son aplicables a tejido recogido a partir de material paciente consentido.

Aislamiento 1. celular

  1. La disociación de la biopsia muscular y la purificación de células miogénicas
    1. Pre-pesar una placa de cultivo tisular de 10 cm en una campana de bioseguridad de cultivo de tejidos, y luego volver a pesar el plato que contiene la biopsia muscular para calcular la cantidad de tejido que se ha disociado.
    2. Utilizando escalpelos estériles, tejido muscular mince finamente y añadir unas gotas de estéril 1x HBSS para evitar que el tejido se seque.
    3. Añadir 3,5 ml cada una de dispase II y colagenasa D por gramo de tejido muscular para ser digeridos. Pipetear la solución de enzima de tejidos y picada a través de una pipeta de 25 ml estéril unas cuantas veces. Incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C con 5% de CO2 durante 15 min y digerir el tejido hasta que la suspensión pasa fácilmente a través de una pipeta estéril ml 5.
      NOTA: la disociación del tejido se consigue normalmente por digestión enzimática dentro de 45 a 90 min. Por favor, consulte la sección "Los resultados representativos 'para obtener más detalles.
    4. Añadir 2 volúmenes de medio de crecimiento estéril al tejido disociado, filtro a través de un filtro de 100 micras celular más de un 50 ml de pellets de células tubulares y cónicos durante 10 min a 329 xg (~ 1100 rpm), la temperatura ambiente. Por favor consulte la Tabla de Materiales para la composición de los medios de comunicación.
    5. Resuspender el precipitado en 1 volumen de medio de crecimiento estéril y añadir 7 volúmenes de solución de lisis de glóbulos rojos. Filtrar la solución a través de un filtro de células de 40 micras, entonces sedimentar tél las células durante 10 min a 329 xg, a temperatura ambiente.
    6. Contar las células en un hemocitómetro y resuspender las células en 1x HBSS 0,5% de BSA a una concentración de 1 x 10 6 células / 100 mL. Aparte ~ 250.000 células en un único tubo que se utilizarán como control negativo (sin teñir). Conjunto de tubos de lado adicionales de un solo color manchados de control para yoduro de propidio y para CD56, que son necesarios para la selección adecuada de las células CD56 positivas por FACS clasificación. Por favor refiérase a los teléfonos manuales de clasificación o consultar con clasificación FACS expertos instalaciones fundamental de asegurar controles adecuados se incluyen.
    7. Teñir las células para ser ordenados con 5μl / 10 6 células de anticuerpo anti CD56. Incubar todas las muestras (incluyendo los controles) en hielo durante 30 min.
    8. Lávese las muestras en 10 ml 1x HBSS y células de pellets durante 10 minutos a 329 xg (~ 1100 rpm) en una centrífuga refrigerada, 4 ° C de temperatura.
    9. Añadir yoduro de propidio a una concentración final de 1μg / ml de la muestra a ser sorted para la exclusión de las células muertas. Purificar células positivas CD56 a partir de células miogénicas no miogénicas utilizando el clasificador de células activadas por fluorescencia.
  2. La disociación de biopsia de piel
    NOTA: Dérmica fibroblastos se pueden aislar de un punzón de piel de pacientes cuando las biopsias musculares no están disponibles. Fibroblastos dérmicos se pueden utilizar como biomaterial para muchos estudios, incluyendo la transducción con MyoD para generar células miogénicas. Además, los fibroblastos dérmicos se pueden utilizar para generar células iPS, que pueden diferenciarse en diversos tipos de células para el estudio adicional.
    1. Transporte la biopsia de piel para el laboratorio en un medio de transporte. Una vez que se recibe la muestra, realice el cultivo primario tan pronto como sea posible. Si el cultivo primario no se puede establecer en el mismo día, almacenar la muestra a temperatura ambiente durante la noche.
    2. Transferir la biopsia de piel para un 35 mm placa de Petri estéril en la campana de flujo laminar.
    3. Enjuague la biopsia de la piel en una placa de Petri estéril con 1x PBS para eliminar la sangre y los residuos. Retire el tejido adiposo con un bisturí estéril.
    4. Añadir solución de colagenasa 2 ml y picar el tejido con el escalpelo, se incuba a 37 ° C durante 45 min a 1 hr, dependiendo del tamaño del tejido.
    5. Transferir el tejido digerido a un tubo cónico de 15 ml, lavar la placa de Petri con 2 ml de medio de cultivo de fibroblastos dos veces, y recoger el medio en el mismo tubo.
    6. Sedimentar las células a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    7. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 3 ml de medio de fibroblastos para eliminar la colagenasa, a continuación, las células de pellets de nuevo. Por favor consulte la Tabla de Materiales para la composición de los medios de comunicación.
    8. Repita el paso 1.2.7 una vez más.
    9. Vuelva a suspender el sedimento en las células de fibroblastos y medianas placa 5 ml en un matraz de cultivo de tejido T25 estéril. Incubar el matraz a 37 ° C con 5% de CO 2.
    10. Evaluar la cultura de unión de los fibroblastos y el crecimiento en los próximos 1-3 días.
      Nota: Algunas piezas de tejido pequeños también podrán unir a la placa y los fibroblastos migran fuera de estas piezas de tejido.
    11. Mantener el cultivo bajo las mismas condiciones hasta que los fibroblastos se cultivan a aproximadamente 80% de confluencia.
    12. Recoge los fibroblastos por tripsinización y transferir a frascos de cultivo frescos para la expansión adicional. Realizar tripsinización por lavado de las culturas 3 veces en 1x PBS libre de Ca ++ y Mg ++. Añadir Tripsina-EDTA (ver Materiales Tabla) a las células (2 ml del matraz / T25) durante 2 min a 37 ° C.
    13. Dividir células desprendidas en frascos adicionales. Si algunas piezas de tejido de permanecer unidos a los matraces T25 originales, añadir 5 ml de medio de cultivo fresco a este frasco y más fibroblastos migran a cabo continuamente.
      NOTA: El cultivo de fibroblastos expandido se puede congelar abajo como P1 y se almacena en nitrógeno líquido para futuros experimentos.

2. La inmortalización de células miogénicas

  1. células de la placa de 5 millones de Phoenix Ecotropic de embalaje (PE) durante la noche en una placa de cultivo tisular de 10 cm en DMEM estéril y Medio 199 en una proporción de 4: 1, suplementado con suero de ternera al 10%.
  2. Células de alimentación 30 min antes de la transfección con 5 ml de medio fresco suplementado con 10 mM de cafeína.
  3. Homogeneizar una mezcla de 2 g de ADN plasmídico a partir de una preparación midi (CDK4 o hTERT plásmido) y polyjet e incubar a temperatura ambiente durante 15 min, según lo recomendado por el fabricante.
  4. Añadir la mezcla de plásmido / polyjet a las células PE durante la noche.
  5. Células de alimentación con medio fresco (DMEM y medio 199 en una proporción de 4: 1, suplementado con suero de ternera al 10%). Doce horas más tarde, recoger el sobrenadante que contiene el virus y filtrar a través de un filtro de tamaño de poro 0,45 micras.
  6. Usar 1 ml de sobrenadante recogido durante la noche para infectar la línea celular de empaquetamiento PA317 anfotrópicas 5 y obtener una línea celular productora de virus estables después de la selección, ya sea con 0.5 mg / ml de neomicina (G418) para CDK4 o 0,5 mg / ml de higromicina para hTERT.
  7. Preparar trabajo sobrenadantes virales por el crecimiento de las células de empaquetamiento estables hasta casi confluencia, luego, la cosecha el sobrenadante cada mañana, la tarde y la mañana para tres cosechas.
  8. Filtra los sobrenadantes virales y, o bien utilizar directamente o dividirlos en alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 ° C para su uso posterior. Tenga en cuenta que sobrenadante viral pierde 50% de eficiencia de la infección con cada uno de congelación-descongelación. Recuerde que debe blanquear lavado antes de desechar todo lo que ha tocado las partículas virales.
    NOTA: La línea celular PA317 productoras de virus estable puede ser congelado y se mantiene a -150 ° C para el almacenamiento permanente (medio de congelación es del 10% DMSO; 90% de suero).
  9. Plate FACS purificado células miogénicas (descrito en los pasos 1.1 a 1.9) a una densidad de 5 x 10 4 células / pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina al 0,1%. Asegúrese de que las células se unen a la placa antes de proceder con la infección viral.
  10. Añadir 400 l filtrada, freshly producido sobrenadante viral o alícuotas congeladas a cada placa de seis pocillos durante la noche (mantener 2 pozos como controles).
  11. Cambio de medio por la alimentación de las células con 2,5 ml / pocillo de medio fresco muscular (4: 1 medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y medio 199 suplementado con suero bovino fetal al 15%; 0,02 M tampón HEPES; 1,4 mg / L de vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L de dexametasona, factor de crecimiento de hepatocitos / l 2,5 g y / L el factor de crecimiento de fibroblastos básico 10 g). Deseche los medios de comunicación y pipetas que contienen las partículas virales en un contenedor de lejía. Deja células en el mismo medio durante 3 días para recuperarse de la infección, entonces tratan de selección utilizando 400 mg / ml de neomicina (infección CDK4) o 300 mg / ml de higromicina (infección hTERT).
  12. Mantener células en la selección de medicamentos hasta que las células en la matriz placa control (1-2 semanas).
  13. Células de paso antes de que se hacen confluentes (60-80% de confluencia, utilizando 0,05% de tripsina EDTA), incluso durante la SELECTIel período. Células Replate en múltiples 10cm platos con medio fresco de mioblastos (como se describe en 2.11), complementado con la droga selección. Mantener células seleccionadas inmortalizadas como una población heterogénea o clonar para obtener un fondo genético completamente homogénea (el mismo de inserción del transgén en cada célula).
  14. Realice la selección clonal utilizando los siguientes pasos:
    1. Sembrar las células a baja densidad (por ejemplo, de 300 a 500 células en placas de 10 cm) y mantenerlas durante aproximadamente dos semanas, hasta pequeñas colonias se forman células (10-20).
    2. Eliminar la mayor parte del medio en este punto, dejando sólo una película fina para evitar que las células se sequen.
    3. Coloque un anillo de clonación (con un extremo sumergido en grasa de vacío de silicona) sobre cada clon deseado y añadir unas gotas de tripsina / EDTA.
    4. Las células de la cosecha una vez que se redondean aspirando cuidadosamente las células utilizando una punta de 1 ml o una pipeta Pasteur y su transferencia a la más pequeña pla multiwell disponiblete (96 o 48, 24 o 12 pocillos).
    5. Expandir clones según sea necesario para evitar la confluencia local.

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Resultados

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La Figura 1 ilustra algunos de los pasos clave que participan en la disociación tejido primario: la cantidad exacta de tejido se pesa en una placa de cultivo tisular de Petri estéril (Figura 1A, B). El tejido se pica finamente utilizando escalpelos estériles, hasta que se obtuvo una suspensión de tejido (Figura 1C, D). Después de la adición de las enzimas de digestión, músculo primario de disociación del tejido se consigue normalmente mediante digestión enzimática dentr...

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Discusión

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Las células como un recurso útil

El aislamiento y el cultivo de poblaciones de células miogénicas es extremadamente útil cuando se establece fenotipos de la enfermedad o en modelos in vitro de la enfermedad. El procedimiento de aislamiento de células myogenic aquí descrito permite el aislamiento de los mioblastos y fibroblastos a partir de muestras de músculo esquelético, que luego pueden ser propagados, diferenciada, o inmediatamente analizadas. La estructura y función de ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta publicación está financiada a través de Cure CMD, una beca de la Asociación Contre Les Myopathies (AFM) (proyecto 16297), y por los Institutos Nacionales de Salud (números de subvención K08 AR059750, L40 AR057721 y 2R01NS047727).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipo
Tissue  campana de bioseguridad para cultivoBaker Company, Inc.Centrífuga de sobremesa con campana
, como el modelo Beckman Beckman CoulterModelo Allegra 6RSi se realiza la clasificación de células, se prefiere una centrífuga con refrigeración
MicroscopioNikonModelo Eclipse TS100
Incubadora de cultivo de tejidos, conectada a una fuente de CO2 FormaScientific Serie II
Clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS)Becton DickinsonModel Aria
Reactivos para el aislamiento de mioblastos primarios de tejido
Dispasa IIRoche Applied Science#04942078001Prepare una solución de calcetín de 2,4 U/ml en
DMEM Colagenasa D Roche Applied Science#088882001Prepare una solución madre de 10 mg/ml
1x Sterile Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS), libre de calcio y magnesioGIBCO Life Technologies#14185-052
Albúmina sérica bovina, fracción VSigma#05470Prepare una solución estéril de 1X HBSS 0.5% BSA para la clasificación FACS
Medio de crecimiento estéril para mioblastos: Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM) con glucosa alta (4,5 g) suplementado con un 30% de suero fetal bovinoGIBCO Life Technologies11965-092Contiene L-glutamina
Solución de lisis RBCQiagen158904
Yoduro de propidio stock 10mg/mlSigmaP4170Prepare la solución madre diluyendo el polvo en agua destilada estéril
Anticuerpo anti-CD56 humano para citometría de flujoBiolegend318310Anticuerpo conjugado con APC, se pueden utilizar otras etiquetas
Reactivos para la inmortalización de mioblastos primarios
empaquetamiento EcotropicPE Cell BiolabsRV-101
Línea celular de empaquetamiento anfotrópico PA3174Cell BiolabsRV-102
Gelatina de piel de cerdoSigmaG1890-500gPrepare una solución madre de gelatina al 0,1% en agua. Cubra el plato con la solución a 37 grados; C durante una hora. Retire la solución y agregue el medio.
PolyJet SignagenSL100688
G418Fisher345812
Hygromycinde Biosciences400051
pBabe que contienen mCDK4 y hTERTno están disponiblesStadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kitQiagen12143
Medium 199Life Technologies Medio 199 (31150022)
Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM)Life Technologies DMEM (11965-092)Mix 4:1 DMEM:199
Medio de crecimiento de mioblastos: 4:1 Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM) y Medium 199 suplementado con 15% de suero fetal bovino; Búfer HEPES de 0,02 M; 1,4 mg/L de vitamina B12; 0,03 mg/L de ZnSO4, 0,055 mg/L de dexametasona, 2,5 μ g/L de factor de crecimiento de hepatocitos y 10 μ g/L de factor de crecimiento de fibroblastos beta.Tecnología de la vida (DMEM, F199); Biológico de Atlanta (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (Sulfato de zinc); Sigma (Vit.B12, dexametasona); Chemicon Internacional (HGF); Biopionero (betaFGF) #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). Prepare el medio y la solución madre Vit. B12 (20 mg/ml); Sulfato de zinc (60µ g/ml); Dex (55µ g/µ l) por separado para facilitar su uso. Solución madre de HGF (5µ g/ml) y FGF (20µ g/ml) deben añadirse frescamente cada semana a la concentración final de trabajo.
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
Anticuerpo de cadena pesada de miosina para inmunotinciónBanco de hibridomas del desarrolloClon MF20 MF20
Desmin Anticuerpo para inmunotinciónThermo ScientificMS-376-S0Clon D33
Suero de caballoInvitrogen26050-088
Reactivos para el aislamiento primario de fibroblastos cutáneos
Medio de transporte: RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 0,2% de penicilina/estreptomicinaMedio RPMI 1640: GIBCO Life Technologies11875-093
Medio de cultivo de fibroblastos primarios humanos: RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicinaSuero fetal bovino: Thermo ScientificSH30071.03
Solución de colagenasa: Colagenasa tipo 2 (100 mg) resuspendida en 12,5 ml de medio de cultivo de fibroblastos y esterilizada con filtroWorthington4176
Tampón de fosfato estéril 1X solución salina (PBS) sin calcio ni magnesioLonza17-516F
Materiales para el aislamiento de mioblastos primarios
50 ml y 15 mlGeneMate/BioexpressC-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))Bisturíes
estérilesAspen Surgical372610
HemocitómetroHausser Scientific1492
Pipetas estériles de 5, 10 y 25 ml Bellcoglass1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)pipetas reutilizables se lavan, se taponan con algodón y se esterilizan en autoclave antes de su uso
Platos de plástico estériles tratados con cultivo de tejidos (10 cm)BD Falcon353003
Coladores de células de nailon estériles (100 µ m y 40 y micro; tamaño m)BD Falcon352340 (40µ m); 352360 (100µ m)
  Materiales para la inmortalización de
Estéril 0,45 y micro; m filtrosMilliporeSLHV013SL
Anillos de clonaciónCorning#3166-8Para limpiar y esterilizar en autoclave antes y después de su uso
Materiales para líneas celulares de fibroblastos 
Placas de plástico estériles de 35 mm tratadas con cultivo de tejidosGreiner bio-one628160
Bisturíes estérilesDeRoyalD4510A
Matraces estériles para cultivo de tejidos T25Techno Plastic Product, TPP90026vendido en los EE. UU. por MIDSCI
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
SterilGuardLínea celular de EMD Los plásmidos comercialmente Tubos cónicos estériles deLas mioblastos

Referencias

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

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Stacy C. Cossette

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Stacy A. Cossette

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Aislamiento de biopsia muscularinmortalizaci n de l neas celularescultivo celular primariopurificaci n por FACSdiferenciaci n de c lulas miog nicassobreexpresi n de CDK4expresi n de hTERTproducci n de sobrenadante viralselecci n antibi ticat cnica de clonaci n en anillo

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