Qué hacer y qué no hacer de crio-microscopía electrónica: Una introducción a la preparación de muestras y de alta calidad de recopilación de datos para la Reconstrucción de Macromoléculas 3D

Resumen

Este artículo describe la metodología de criomicroscopía electrónica, que se utiliza para obtener imágenes microscópicas de alta calidad de macromoléculas en su estado casi nativo. El método produce imágenes adecuadas para el procesamiento computarizado posterior utilizando el enfoque de partícula única, ideado para generar la reconstrucción 3D de una macromolécula.

Resumen

La criomicroscopía electrónica (crioEM) implica la congelación instantánea de una capa delgada de muestra en un soporte, y luego visualizar la muestra en su estado hidratado congelado mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Esto se puede lograr con una cantidad muy baja de proteína y en el tampón de elección, sin el uso de ninguna tinción, lo cual es muy útil para determinar las correlaciones estructura-función de las macromoléculas. Cuando se combina con el procesamiento de imágenes de una sola partícula, la técnica ha encontrado una amplia utilidad para la determinación estructural en 3D de macromoléculas purificadas.

El protocolo presentado aquí explica cómo realizar cryoEM y examina las causas de los problemas más comúnmente encontrados para una resolución racional de problemas; seguir todos estos pasos debería conducir a la adquisición de imágenes cryoEM de alta calidad. La técnica requiere acceso al instrumento de microscopio electrónico y a un dispositivo de vitrificación. También se necesitan conocimientos de los conceptos y el software de reconstrucción 3D para el procesamiento computarizado de imágenes. Es importante destacar que los resultados de alta calidad dependen de encontrar las condiciones de purificación adecuadas que conduzcan a una población uniforme de macromoléculas estructuralmente intactas.

La capacidad de cryoEM para visualizar macromoléculas combinada con la versatilidad del procesamiento de imágenes de una sola partícula ha demostrado ser muy exitosa para la determinación estructural de proteínas grandes y máquinas macromoleculares en su estado casi nativo, la identificación de sus múltiples componentes mediante el mapeo de diferencias en 3D y la creación de estructuras pseudoatómicas mediante el acoplamiento de estructuras de rayos X. El incesante desarrollo de la instrumentación crioEM y las técnicas de procesamiento de imágenes durante los últimos 30 años ha dado como resultado la posibilidad de generar reconstrucciones 3D de novo a nivel de resolución atómica.

Introducción

El objetivo de cryoEM es obtener imágenes microscópicas de electrones de macromoléculas en su estado hidratado nativo. En virtud de la incorporación de la macromolécula en agua vitrificada, una muestra congelada-hidratado se puede introducir y visualizar en el instrumento TEM directamente. La vitrificación, logrado por el flash de congelación (10.000 ^{° C} / seg), se congela la muestra sin cristalización del agua y asegura que los reordenamientos moleculares durante la congelación son insignificantes. El exceso de dispersión de electrones de la muestra con respecto al tampón circundante ofrece una pequeña pero suficiente contraste para ver la macromolécula en ausencia de cualquier mancha ^1. Procesamiento de imagen computarizada puede entonces ser usado para recrear la estructura 3D de la macromolécula. Macromoléculas grandes en el rango de ~ 500 kDa de múltiples muestras MDa son ideales para cryoEM (que representan más del 80% de la Microscopía Electrónica de Data Bank (EMDB) entradas); estos incluyen proteínas, complejos de proteínas, proteína-ácido nucleico complexes, y proteínas de membrana incorporadas en una bicapa. Estas macromoléculas son menos propensos a ser cristalizado (con menos del 2% en las entradas de la base de datos PDB), sin embargo, a menudo es el caso que las piezas más pequeñas resueltos por cristalografía de rayos X o RMN se pueden acoplar en el sobre 3D creado por cryoEM. Por otro lado, algunas de las estructuras más grandes que resuelve cryoEM son identificables dentro de la célula completa por sección delgada TEM ^2. Por lo tanto, cryoEM salva efectivamente el tamaño y la resolución brecha entre las estructuras subcelulares y atómicas.

CryoEM refleja mejor estructura nativa de la macromolécula que el método más clásico de tinción negativa (NS), donde la macromolécula es deshidratada y rodeado por una capa de tinción de metal pesado mediante el cual la región de la exclusión mancha crea una imagen fuertemente contrastado "negativo" ^3. En ambos casos, el haz de electrones produce imágenes en 2D de proyección de las macromoléculas, llamados partículas, donde la shape depende de la orientación de la macromolécula con respecto al haz de electrones. Muchas partículas, al menos ~ 1000 y sin límite superior, se pueden analizar en el equipo con el "análisis sola partícula '(SPA) de software para aumentar la relación señal a ruido (SNR), aunque de promedio, y para encontrar los parámetros de orientación espacial de la partícula necesaria para recrear la estructura 3D de la macromolécula por volver proyección ^4-7. NS, con mayor SNR, se utiliza para la caracterización preliminar de la muestra y para generar una reconstrucción de novo 3D; su resolución rara vez supera los 20 Å, que se impone por la deshidratación y el tamaño del grano del metal pesado. En general, para la determinación estructural cryoEM 3D, una reconstrucción 3D de baja resolución que se obtenga de NS y luego cryoEM se utiliza para refinar esta baja resolución mapa inicial para estudiar más a fondo la macromolécula en su estado hidratado nativo, para ver su estructura interna, y para aumentar su resolución. Note que si el modelo NS fue distorsionada (el ejemplo más común es el aplanamiento resultante de la deshidratación ⁸⁾ y las partículas cryoEM tenido baja SNR, a continuación, la distorsión podría llevar en el modelo cryoEM (el artefacto modelo de sesgo, que es común en baja SNR conjuntos de datos ^9). Distorsión estructural daría lugar a falta de coincidencia entre el NS y partículas primas cryoEM y entre las partículas cryoEM primas y proyecciones correspondientes del modelo 3D ortogonal a la dirección de aplanamiento. Modelo sesgo puede resolver por sí mismo como el modelo 3D se somete a ciclos de perfeccionamiento sucesivas. En caso de que no se produzca, que se detecta como la falta de correspondencia entre las partículas cryoEM primas y proyecciones correspondientes del modelo 3D, a continuación, un modelo de novo debería construirse a partir de los datos cryoEM. Un buen enfoque podría ser utilizar el algoritmo de la reconstitución angular ^10, que puede producir varias posibles volúmenes 3D y, a continuación, utilizar el modelo NS 3D para seleccionar el mejor modelo posible cryoEMque se perfeccionarán ^11. Una mejor estrategia es aumentar la SNR del conjunto de datos cryoEM (ver sección dedicada en la Discusión).

La calidad bioquímica de la macromolécula purificada tiene una mayor influencia en el resultado final. La macromolécula, purificada a partir de tejido o expresado en sistemas heterólogos, debe tener un alto grado de pureza y ser estructuralmente intacto. Se tampoco debe formar agregados ni debe desglosar. Para definir una conformación particular, las condiciones de preparación deben promover un estado conformacional uniforme. Para estudiar complejos, lo óptimo es que su k _D está en el rango nM, de lo contrario fijadores han sido utilizados con éxito para estabilizar interacciones de afinidad inferiores ^12,13.

Imágenes cryoEM no procesados ​​proporcionan información valiosa sobre las dimensiones, esquema general, estado de agregación / multimerización, la homogeneidad y la estructura interna de la macromolecule. Sin embargo, el potencial de la técnica está muy mejorada con procesamiento de imágenes. Una estructura 3D revela arquitectura general de la macromolécula, la ubicación 3D de ligandos y subunidades, cambios conformacionales, y permite el acoplamiento de las estructuras atómicas determinadas por cristalografía de rayos X o RMN. La cantidad de información de una reconstrucción en 3D aumenta por etapas como la resolución se incrementa: en general 15-20 Å de resolución permite acoplamiento inequívoca de estructuras atómicas, a los 9-10 Å hélices alfa son visibles como barras, a las 5 Å es posible discernir láminas beta, y en resoluciones de 3,5 Å y mejor es posible construir un modelo atómico ^14.

La posibilidad de obtener imágenes informativas y una reconstrucción en 3D usando SPA de cantidades relativamente pequeñas de muestra hacer cryoEM una técnica atractiva, como 5/3 l de al menos 0,05 mg / ml son suficientes para preparar una rejilla TEM. Los requisitos mínimos instrumentalespara cryoEM son un crio-émbolo de fabricación casera o comercial, un microscopio electrónico con ultra alto vacío, medios de grabación de imagen y kit de dosis baja, un crio-titular con su estación de bombeo, un aparato de descarga de gas, y un evaporador. Las características no esenciales, pero aún más deseables en el TEM son cámara CCD (presente en todos los TEM modernos) o un detector de electrones directa, cañón de emisión de campo (FEG), filtrado de energía y alto rendimiento del software de recogida de datos. Este software, en principio, permite la recolección de decenas de miles de partículas en una sola sesión cryoEM ^15, sin embargo, las crecientes necesidades de almacenamiento de datos y la posterior necesidad de tiempo de post-procesamiento de supervisión que deben tomarse en consideración. FEG combinado con función de transferencia de contraste (CTF) de corrección subyace en la mayoría de las reconstrucciones en 3D que alcanzaron suficiente resolución para visualizar las hélices alfa. En ese momento, el nivel de resolución también es muestra de dependientes: alcanzar el 10 Å de resolución es menos común para las proteínas de membrana, mientras que sialto grado de simetría está presente, entonces resolución atómica es más alcanzable. El reciente desarrollo de detectores de electrones directos ha permitido a resolución atómica incluso para macromoléculas con bajo (4x) o no simetría, donde la calidad de los mapas de densidad de electrones cryoEM coincide con éstos derivan de los datos de difracción de rayos x ^16,17.

Ejemplos prácticos que ilustran las capacidades de la técnica se proporcionan aquí cuatro tipos importantes de macromoléculas donde cryoEM tiene un papel principal Continua en su determinación estructural. (I) Con su simetría icosaédrica que aumenta el conjunto de datos en un 60 veces y su gran tamaño que permite fiel y alineación reproducible, las estructuras de varios virus icosaédricos han resuelto con la resolución casi atómica por cryoEM seguido de SPA ^18. Mostramos un ejemplo de una clase de virus icosaédricos, los virus adeno-asociados (AAV), para el que cerca de las estructuras atómicas por cryoEM y por cryoEM HY / x-rayExisten métodos brid ^19,20. (Ii) macromoléculas con estructura helicoidal incluyen los microtúbulos, filamentos y virus. Sus unidades repetitivas a lo largo del eje de la hélice pueden ser analizados por una versión más compleja de SPA adaptada a la geometría helicoidal ^21. En el ejemplo que mostramos virus del mosaico del tabaco (TMV), un virus ARN que se ha resuelto con la resolución atómica por cryoEM ^22. (Iii) las proteínas solubles grandes se han estudiado ampliamente. Entre ellas, las macromoléculas que forman cilindros multímeras simétricas constituyen una arquitectura que se repite a menudo resuelto en resolución subnanometer ^23,24. Aquí te mostramos imágenes de KLH, un transportador de oxígeno de invertebrados, donde un modelo molecular híbrido fue creado a partir de / x-ray cryoEM métodos cristalografía híbridos ^25. (Iv) proteínas de membrana son una clase importante de proteínas; que constituyen aproximadamente un tercio de las proteínas codificadas por el genoma humano, sin embargo, son difíciles de caracterizar estructuralmente debido a complejidades asociadas con trestabilización de dominio ansmembrane ^26, constituyendo menos del 1,5% de las estructuras resueltas por cualquier técnica estructural combinado. El papel de la reconstrucción cryoEM y 3D en su determinación estructural se ejemplifica con el receptor de rianodina (RyR), un gran eucariótica de Ca2 ⁺ intracelular canal importante en la contracción muscular y la señalización cerebro. Las estructuras más altas resolución cryoEM hasta la fecha, con una resolución de 10 Å, revelan la estructura secundaria ^27.

Protocolo

1. Cryo-titular de Preparación y Mantenimiento

NOTA: La estación de bombeo seco, que consiste en una estación de bombeo turbo y uno o más controladores de la etapa de frío, se utiliza principalmente para tres propósitos: a) Se trata de un lugar seguro para guardar los titulares crio cuando no se están utilizando. La forma correcta de almacenar los titulares es dejarlos en la estación al vacío. b) Para evaporar la escarcha y humedad acumulación que se produce cuando el nitrógeno líquido se retira del dewar y la punta del soporte de crio está expuesto; esto se logra con el ciclo de calentamiento. c) Para regenerar el desecante de zeolita, y para lograr un alto vacío en los termos cryoholder. Esto es necesario para mantener una temperatura constante cuando se hace microscopía electrónica de crio.

1. Ciclo de calentamiento.
   1. Insertar el soporte crio en uno de los puertos de bombeo de la estación de bombeo. Conecte uno de los tubos de evacuación a la salida de metal debajo de la válvula de vacío del titular. Hacerasegurarse de que todas las válvulas en la estación (V1, V2, y V3) y en el soporte de crio están cerrados.
   2. Encienda el controlador de fase fría y conéctelo al titular a través del cable de control. Encienda el interruptor de alimentación de la estación de bombeo turbo.
   3. Inicie la opción de ciclo de calentamiento en el controlador de fase fría. Cuando el vacío en la estación de bombeo turbo lee 10 ^-3 Torr o mejor, abrir la válvula V2 mariposa, espere hasta que el vacío se estabiliza, y abra la válvula V1 mariposa.
   4. Ejecute el ciclo de calentamiento para alrededor de 30 minutos hasta que la temperatura en el soporte es estable por encima de 20 ° C. Cerrar V1 y, a continuación, detener el ciclo.
2. Ciclo de zeolita. Ejecute el ciclo de Zeolita Entre 4 horas y O / N Antes de que un cryoEM período de sesiones, y una vez por semana si no se utiliza.
   1. Iniciar la opción de ciclo de zeolita y seleccionar el tiempo necesario para alcanzar un buen vacío, en el intervalo de 1-2 x 10 ^-4 Torr, y por lo tanto a largo tiempo de retención. Cuando el vacío alcanza el 10 ^-3Torr, abra la válvula de evacuación Dewar, V3. La estación de bombeo entonces evacuar la línea para el titular; espere hasta que el vacío se estabilice.
   2. Abra la válvula de la titular de la crio. Cuando se complete el ciclo, cierre las válvulas en el orden inverso en que fueron abiertos, la válvula en el soporte, entonces V3, V2, y finalmente V1. Apague la estación de bombeo turbo y el controlador de fase fría, y desconecte el titular de la crio desde el controlador de fase fría y la estación de bombeo turbo.

2. preparación de la cuadrícula

1. Limpieza.
   NOTA: Al utilizar rejillas perforadas comerciales, se recomienda limpiar antes de su uso, con el fin de eliminar cualquier polímero residual que se utilizó en el proceso de fabricación. Haga esto en una placa de Petri de vidrio con 5 capas de papel de filtro establecidos en la parte inferior.
   1. Coloque las rejillas en el papel de filtro con el lado de carbono holey hacia arriba.
   2. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, mojar el papel con varias gotas of cloroformo alrededor de las rejillas hasta que acaba de empezar flotante.
   3. Cubra la placa de Petri con la tapa ligeramente abierta en una campana extractora O / N.
2. NOTA: el soporte de carbono fina (pasos 2.2 a 2.3) se puede omitir como la capa de hielo puede formarse directamente a través de los pequeños orificios en la rejilla de carbono holey.
   1. Con un par de pinzas, escindir un pedazo de mica para exponer dos nuevas superficies. Coloque las nuevas superficies expuestas de mica boca arriba en un trozo de papel blanco en una placa de Petri.
   2. Coloque la placa de Petri en la campana de un evaporador de carbono. Iniciar la secuencia de bomba hasta que el vacío es inferior a 2 x 10 ^-6 Torr. Para evaporar cualquier impureza en la superficie de la barra de carbón, realizar una pre-evaporación con el plato Petri cubierta. Luego transmitirá la campana y retire la cubierta de la placa de Petri.
   3. Realizar la secuencia de la bomba hacia abajo hasta que el vacío es inferior a 10 ^-6 Torr y la capa de mica con una capa delgada (~ 5 nm) de carbono. Utilice protección para los ojos durante carbonoevaporación. Supervisar el espesor de la película de carbono por la oscuridad resultante en el papel que había sido colocado bajo las láminas de mica.
3. Transferir el fina de carbono a la TEM cuadrícula.
   1. Cortar una pieza de 0,5 x 1 cm de mica recubierta y flotar el carbono fuera sobre la superficie plana de agua filtrada y desionizada. Utilice papel lente óptica para conseguir una superficie de agua plana. Usando las pinzas, coloque la cara de carbono holey de la red en contacto con la superficie superior de la capa de carbón flotante y recogerlo.
   2. Repita los pasos 2.3.1 y 2.3.2 hasta que se preparó un número suficiente de rejillas.
4. Descarga luminiscente.
   NOTA: La descarga luminiscente convierte la capa de recubrimiento de carbono naturalmente hidrófoba de las rejillas en hidrófila. Este paso es opcional.
   1. Coloque las rejillas con la cara de carbono hasta en un portaobjetos de vidrio 7,5 x 2,5 cm cubierto con Parafilm. Colócalo en la cámara de los equipos de descarga luminiscente y cerrar la cámara.
   2. Bombala campana de vidrio y de descarga luminosa de 20 segundos a 25 mA y 7 x 10 ^-2 mbar.
      NOTA: Durante este tiempo un resplandor púrpura luz se hace visible. Retire la placa de vidrio con las rejillas y usarlos dentro de 1 hora, de lo contrario, tendrán que ser dado de alta de nuevo resplandor.

3. Muestra Plunge-congelación

NOTA: Utilice gafas de seguridad y calzado adecuado cuando se utiliza este instrumento para proteger contra las salpicaduras de nitrógeno y etano líquidos.

1. Encienda el aparato de inmersión congelación. Llenar el depósito del humidificador con agua destilada. Ajuste la temperatura deseada, la humedad relativa y las condiciones de hundimiento para el tiempo de transferencia, la fuerza Blot y tiempo de adsorción (22 ° C, 95%, 2 seg, 2 y 40 segundos en el ejemplo presentado aquí). Coloque el nuevo filtro de papel secante.
2. Enfriar el recipiente de etano por llenar el depósito exterior con nitrógeno líquido hasta que se logre la estabilidad (aproximadamente 10 min). Una vez que el nitrógeno líquido se detiene boiling, coloque la punta del tubo que viene del tanque de etano en la cámara interior y abrir la válvula lentamente. Licuar el etano en la cámara interior y llenarlo hasta 1 mm de la parte superior. Evite congelar el etano. PRECAUCIÓN: etano es extremadamente inflamable y explosivo.
3. Asegúrese de que las pinzas están alineados dentro del aparato de congelación profunda.
4. Encienda la humedad. Cargar una rejilla sobre las pinzas, y cargar 3-5 l de la muestra en la superficie del carbón (lado opaco) de la red llena de agujeros. Espere a que la muestra para adsorber a la red y realizar la transferencia de lograr una capa líquida delgada.
5. Flash congelar la rejilla al sumergirse en el etano líquido. Retire el conjunto de pinzas de la red desde el etano líquido que sostiene las pinzas de manera constante, y transferirlo a la cámara exterior con nitrógeno líquido. Transferir la cuadrícula a un cuadro de cuadrícula pequeña inmerso en el nitrógeno líquido. Asegúrese de mantener la muestra vitrificada en nitrógeno líquido todo el tiempo durante la transferencia con el tanque de almacenamientoo para el soporte de crio.
   NOTA: cajas de la red se pueden almacenar en una gran capacidad (35-50 L) Dewar de nitrógeno líquido durante al menos 1 año. Para el almacenamiento conveniente que pueden ser colocados en un tubo Falcon de 50 ml con dos agujeros perforados en la parte superior y una línea de pesca unido a su tapa que se puede sacar de la boca de la dewar.

4. Transferir el Cryo-red para el TEM

1. Inserte el soporte de la crio en la estación de trabajo crio-transferencia. Tenga cuidado de no dañar la punta del soporte durante la inserción. Verificar la presencia de pequeñas fibras y el polvo en la varilla y la junta tórica del titular crio usando una lupa, si hay alguna quitar con papel para lentes ópticos.
2. Llenar el dewar del titular de la crio y el recipiente de estación de trabajo con nitrógeno líquido. Evite derramar el nitrógeno líquido utilizando el embudo atrapado que viene con la estación de trabajo.
3. Conectar el soporte de crio al controlador etapa fría para controlar la temperatura, y seguir añadiendo nitrógeno líquido y #160; hasta que la temperatura se estabilice en torno a -194 ° C. Asegúrese de que el nivel de nitrógeno líquido es bajo el nivel de la junta de vacío tanto en la estación de trabajo y el vaso Dewar titular crio. Pre-enfriar las pinzas de rejilla, el cono de fijación y el extremo romo de la herramienta de anillo clip en la estación de trabajo. También pre-enfriar un conjunto de grandes pinzas y un destornillador en otro Dewar llena con nitrógeno líquido.
4. Transfiera rápidamente el cuadro de rejilla crio que contiene las rejillas hidratados congelados al nitrógeno líquido en la estación de trabajo utilizando las grandes pinzas. Abra el cuadro de rejilla crio con el destornillador, tome la rejilla hidratado congelado y colocarlo en la ranura soporte de muestra.
5. Coloque el anillo del clip en la parte superior de la parrilla y presione suavemente con el extremo romo de la herramienta clip de anillo hasta que se encaje firmemente en su lugar. Cierre la crio-obturador. Retire la caja de herramientas y la crio rejilla de la estación de trabajo.
6. Mover toda la estación de trabajo con soporte y red para la consola microscopio con el fin de mini-mizar el tiempo de transferencia de la red en aire de la habitación.
7. Rematar la TEM anti-contaminador con nitrógeno líquido, que había sido previamente llenada y enfriado durante al menos 20 min. Pre-inclinar la platina del microscopio a -60 °.
   NOTA: Esto minimizará la pérdida de nitrógeno líquido como el soporte se inserta en la esclusa de aire.
8. Comienza el ciclo de cámara de aire pre-bomba en el microscopio. Asegúrese de que la válvula para el cañón de electrones se cierra (especialmente si se trata de un TEM FEG). Espere a que la secuencia de la esclusa de aire pre-bomba para terminar (unos 2 minutos) antes de insertar el soporte crio.
   NOTA: Esto se indica con la luz roja en el escenario que se extingue.
9. Inserte el soporte en la esclusa de aire y girar 90 ° hacia la derecha; conecte el cable de frío controlador etapa a la titular de la crio para controlar la temperatura. Esperar otra vez hasta que se extinga la luz roja y girar tanto el escenario como el soporte de nuevo en la posición de 0 ° a insertar el soporte en hi del TEMla columna de vacío gh.
10. Asegúrese de que la temperatura nunca sube por encima de -160 ° C para evitar la formación de cristales de hielo.
11. Vuelva a llenar el termo del titular crio. Espere 15 a 45 minutos hasta que el titular haya equilibrado térmicamente y el vacío TEM se ha recuperado antes de grabar las imágenes.
12. Si se detecta de propagación del nitrógeno líquido, cambiar la altura de llenado de nitrógeno líquido, o tocar suavemente el origen burbujeo con un hisopo de algodón.

5. Las dosis bajas de Recolección de Datos

NOTA: La técnica de recolección de datos en dosis bajas se utiliza para minimizar el daño de la radiación de electrones de la muestra mediante la limitación de la exposición a 20 electrones / a ^2. Esto se logra por la alternancia entre tres configuraciones: "Buscar", con bajo aumento (~ 5.000x) y amplio campo de visión, "foco", con gran aumento (~ 150,000X) y pequeño campo de visión, y la "exposición", con el Magni final deseadoficación y que contiene el área de interés para ser registrados. En blanco la viga en entre los modos.

1. Configuración del Programa Las dosis bajas de TEM y
   1. Repliegue la crio-obturador y abrir las válvulas de columna.
   2. Centre el escenario y establecer la altura eucéntrica (Z) con el wobbler alfa para el rock el escenario ± 15 °. Ajuste la posición Z hasta que no haya movimiento apreciable, mientras que el escenario está oscilando. Activar el programa de dosis baja y seleccione el detector para cada modo.
   3. En el modo de exposición encontrar un área de la cuadrícula que no tiene carbono, ajustar la iluminación mediante la selección de la apertura del condensador y la mancha tamaño óptimo de modo que el área a ser grabada está totalmente iluminada. Asegúrese de difundir el haz en la dirección overcondensation.
   4. En modo de búsqueda, encontrar un pequeño rasgo que será fácilmente identificable a mayor aumento. En el modo de exposición, centrar esta función con el joystick (el controlador etapa xy). Comience a menor magnificación si la hazañaUre no está en el campo de visión.
   5. En el modo de búsqueda, llevar esta función para el centro del campo con las dosis bajas xy controles de desplazamiento de imagen. Ir a modo de exposición y mover la característica a lo largo de la inclinación del eje utilizando la palanca de mando hasta que esté fuera de la zona a grabar (0,5-3 micras). Ir a modo de enfocar y centrar la función utilizando los controles de desplazamiento de imagen xy. Comience con un aumento de más baja si la función no está en el campo de visión.
   6. Mantenga el haz centrado en todo momento.
2. Recolección de Datos
   1. Repliegue la crio-obturador y abrir las válvulas de columna. Active el programa de dosis baja.
   2. En modo de búsqueda, identificar una cuadrícula que contiene, hielo homogénea delgada.
   3. Seleccionar un agujero adecuado y colocarlo en el centro del campo. Cambiar al modo de enfocar y enfocar la imagen. Entonces underfocus la imagen entre 0,5 a 4,5 micras.
   4. Cambie a modo de exposición y grabar la imagen.
   5. Cambiar al modo de búsqueda y repita los pasos 5.2.3-5.2.4.Mover a través de la cuadrícula evitando pre-exposición de buenos agujeros que va a grabar.
   6. Termine la cuadrícula y pasar a otra buena.
   7. Vuelva a ajustar la altura (Z) y continuar la recopilación de datos.

Resultados

Ejecución cuidadosa de todos los pasos del protocolo descritos en la Figura 1 permite la visualización de hidratadas macromoléculas congelados, no manchada. Resultados para cuatro muestras representativas con diferentes características estructurales se muestran. Sus imágenes microscópicas obtenidas por los métodos de NS y cryoEM se comparan (Figura 2). Imágenes (i) NS de AAV5 revelan partículas similares al virus de alrededor de 130 Å de diámetro. La coexistencia de estructuras de llenos y vacíos corresponde a roto (que permiten la entrada de manchas) y cápsides estructuralmente intactas, respectivamente. CryoEM muestra estructuras uniformemente vacías; de hecho, estas partículas virales no contienen material genético ^28. NS muestra partículas redondas predominantes mientras cryoEM muestra partículas mayoría hexagonales, lo que refleja su forma icosaédrica. (Ii) Las imágenes de los helicoidales TMV mostrar barras de diámetro 180 Å y longitud variable, a menudo más de 0,1 micras, con una repetición helicoidal de 23 Å visible tantoen NS y en cryoEM. El canal central 40 Å se llena de manchas en las imágenes de NS y vacío en las imágenes cryoEM. (Iii) Nativo KLH, un didecamer de 8 MDa, reúne en barricas característicos de 350 Å de diámetro y 400 de longitud Å. NS y cryoEM revelan KLH de vistas laterales rectangulares y circulares de fin de vistas. Ambas técnicas revelan seis estrías perpendiculares al eje de simetría y las unidades morfológicas igualmente espaciados dentro de cada nivel. CryoEM revela una estructura interior vacío. (Iv) receptor de rianodina, un gran canal intracelular tetramérica de 2,26 MDa, se ve como un cuadrado de 275 x 275 Å ^2. Características de la superficie intrincados, tales como una cruz central y una depresión central se manifiestan como la acumulación de la mancha por NS, y como regiones de densidad más baja por cryoEM. Mientras NS muestra contraste similar en los cuatro muestras analizadas, la comparación de los paneles cryoEM expone la SNR inferior (contraste) de RyR1 debido a la presencia de detergente para solubilizar esta proteína de membrana.

Ejemplos típicos de artefactos cryoEM se muestran para RyR1: hielo cristalino, la contaminación del hielo, el astigmatismo, y estructuras en forma de banda (Figura 3). Sus causas y la prevención se describen con más detalle en la sección de discusión.

Reconstrucción 3D de SPA y congelado-hidratado RyR1 revela su estructura simétrica de cuatro veces, lo que refleja la organización homotetrameric de la proteína (Figura 4A). El dominio citoplásmico forma un prisma cuadrado de 275 x 275 x 120 Å ³ y contiene varios dominios globulares reproducibles que forman una estructura de andamio similares. El dominio transmembrana forma un prisma cuadrado cónico pequeño con dimensiones máximas de 115 x 115 x 60 A ^3. En una resolución de 10 Å es posible visualizar las hélices alfa (Figura 4B). Mapeo diferencia 3D puede revelar la posición de los ligandos importantes, en este caso el mapa 3D diferencia de FKBP12, una proteína de 12 kD considerojo una subunidad de RyR1, se superpone a RyR1 (Figura 4C) ^29. Finalmente, los cambios conformacionales proporcionan una visión dinámica de la macromolécula. En este caso RyR1 estabilizado previamente en condiciones bien cerrados o abiertos revela una translocación masa de la cerrado al estado abierto (Figura 4D) ^27.

Figura 1. Diagrama de flujo de la técnica de microscopía electrónica de crio. El diagrama destaca los principales pasos del protocolo.

Figura 2. Comparación de NS y cryoEM para una variedad de muestras. (A) AAV5, un virus icosaédrica. (B) TMV, un virus helicoidal. El recuadro muestra la repetición helicoidal, de 23 Å. (C) Nativo KLH. RyR1 (D); puntos de vista representativos se destacan (f, ver y s cuádruple, vista lateral). Todas las muestras son imágenes en condiciones de baja dosis y con la misma ampliación de 50,000X un bajo una tensión de aceleración de 200 kV. Las barras de escala, 10 nm. Todas las muestras NS están en soporte de carbono, muestras cryoEM A, C, D están en fina de carbono sobre Quantifoil, y muestra cryoEM B es directamente a través de los agujeros Quantifoil. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Galería de imágenes que muestran artefactos cryoEM comunes sobre una muestra RyR1 cryoEM. (A) cristalina de hielo. Contaminación (B) de hielo (flechas). (C) El astigmatismo. RyR1s en la imagen astigmática son apenas visibles. El recuadro de la derecha muestra el respeto de energíaron de la imagen con anillos asimétricos Thon. El recuadro de la izquierda muestra el espectro de potencia de una imagen no astigmática como referencia. (D) estructuras en la Web similares. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. cryoEM y 3D reconstrucción del receptor de rianodina. . (A) Representación Isosurface (B) de acoplamiento de una estructura cristalina de RyR1 de N-terminal ³⁰ que muestra una buena concordancia entre las coordenadas atómicas y la envolvente cryoEM; flechas apuntan a dos hélices alfa que sobresalen de la estructura. La punta de flecha indica uno de los cuatro hélices que rodean el poro del canal iónico. Las líneas de puntos indican los límites de la membrana. (C) RyR1 y 3D locación del ligando FKBP12 (color naranja). (D) Cambios conformacionales de RyR1 en pasar de la cerrada (naranja) al abierto (negro de malla) conformación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

TEM seguido de SPA ha contribuido muchas estructuras 3D macromoleculares, acercándose a 2.000 entradas en el EMDB a mediados de 2014. En general, para una macromolécula dada, una estructura 3D de baja resolución se determina primero a partir de datos NS, que puede ser seguida por una de mayor estructura resolución cryoEM 3D. El alto contraste de los límites moleculares proporcionadas por NS, que facilita la primera reconstrucción 3D, es posteriormente refinado por cryoEM con su capacidad para mapear la estructura interna de la macromolécula en su estado completamente hidratado, y la posibilidad de alcanzar una resolución mucho mayor. Otra ventaja de cryoEM es la eliminación del estrés deshidratación que podría resultar en el colapso de la macromolécula. Además, existe la posibilidad de omitir el soporte de carbono, lo que elimina los efectos de absorción posible de la superficie y muestra la conformación que adopta la macromolécula en solución. Tinción Cryo-negativo, una combinación de cryoEM y NS, ofrece un alto contraste en una totalmente hydespécimen nominal y también puede conducir a la reconstrucción 3D usando SPA, sin embargo, ha sido utilizada con menos frecuencia, con menos de 10 entradas EMDB, en parte porque la propia mancha puede interferir con la integridad de la macromolécula ^31. Otras dos técnicas TEM conducentes a la reconstrucción 3D son cristalografía de electrones 2D y tomografía electrónica. Cristalografía de electrones 2D requiere un cristal plano o tubular; difracción de electrones del cristal se utiliza para la reconstrucción 3D que podría dar lugar a la resolución atómica ^32. En la tomografía de electrones de las muestras fijadas vitrificados o Tradicionalmente, un componente macromolécula o sub-celular se hace girar dentro de la TEM para la reconstrucción tomográfica posterior ^33, con la ventaja de que los objetos singulares pueden ser reconstruidos; Sin embargo en la actualidad esta técnica tiene un límite de resolución que van de 40 a 20 Å ^34,35. Entre todas estas técnicas moleculares TEM, SPA de NS y cryoEM datos ha sido el más ampliamenteutilizado. El protocolo se ilustra aquí se dedica a la obtención de imágenes cryoEM adecuados para el análisis de SPA; sin embargo, la mayor parte del protocolo es aplicable también a cryoEM de 2D cristales y muestras tomográficas.

Una sesión cryoEM éxito depende del éxito combinado de muchos pasos críticos; aspectos importantes a tener en cuenta, la explicación de los artefactos cryoEM comunes y cómo evitarlos se describen en los siguientes párrafos. Esta sección también describe las directrices de recopilación de datos para obtener reconstrucciones en 3D de alta calidad utilizando el método de SPA.

Evitar la transición a cristalino hielo. Un aspecto central es que la muestra necesita para mantenerse en el estado vítreo desde el momento de la crio-TEM hundiendo largo de observación. Así, después de sumergirse la muestra en etano líquido todas las etapas posteriores se realizan en nitrógeno líquido (-196 ° C) o helio líquido (-269 ° C) temperaturas. El calentamiento por encima de -135 ° C transforma el agua vítrea enal agua cristalina; entonces reordenamientos macromoleculares pueden tener lugar y los cristales de agua dominar la imagen (Figura 3); la muestra debe ser desechada. Accidental muestra de calentamiento podría ocurrir si la crio-hundimiento, la transferencia de la red congelado entre contenedores (incluso si está protegido por un gridBOX), y / o crio inserción soporte en el TEM son demasiado lentos, o si las pinzas de manipulación fueron insuficientemente pre- enfriado. Deterioro de vacío significativo en el TEM en la crio-transferencia (aire entrante las trampas muestra fría más caliente) también puede calentar la muestra. Finalmente, el exceso de irradiación de la muestra podría resultar también en la transición a cristalino hielo.

Reducir al mínimo la contaminación de hielo. Dado el volumen de muestra pequeño (3-5 l) aplicada a la rejilla de TEM, la evaporación se podía concentrar los componentes del tampón (sales, detergentes) y por lo tanto afectar la integridad macromolecular incluyendo la pérdida de estado multimérico. Una alta humedad relativa (RH) microambiente o cámara eludirs este problema. Alternativamente crio-hundimiento se puede hacer en una habitación fría del medio ambiente suficientemente ventilado. Después de RH crio-hundiendo debe ser lo más bajo posible para evitar la contaminación de hielo, o la condensación de la humedad ambiental en el crio-rejilla, ya que la crio-rejilla sí mismo actúa como una trampa de frío. Contaminación del hielo consiste en partículas con alto contraste y sin subestructura con tamaños que oscilan entre ~ 5 nm y varias micras que interfieren con o incluso bloquean totalmente la imagen. Evite las corrientes de aire, hablar / respirar hacia la crio-red durante la transferencia de aire, y reducir la humedad relativa ambiente. Abrir los recipientes de nitrógeno líquido con agua condensada (visible en forma de partículas en suspensión blancos) también deben ser desechados.

Maximizar orientaciones macromoleculares / puntos de vista. Para el apoyo de la muestra, una decisión que debe tomarse es entre las redes verdaderamente holey y fina de carbono sobre rejillas holey. Esto depende de (i) la forma en la muestra se extiende sobre película de carbón frente a los agujeros de carbono, (ii) conce muestra disponiblentration, como agujeros desnudas pueden requerir una concentración más alta que 100X soporte de carbono para una densidad de partícula similar en la imagen (de ~ 0,02 a 2 M), y (iii) cómo aleatoria es la distribución de orientaciones macromolécula. Tenga en cuenta que descarga luminiscente, que hace que el hidrófila de carbono, tendrá un efecto importante en los tres aspectos y que esto será dependiendo de la muestra. En cuanto a la orientación de la macromolécula, mientras que una visión recurrente es deseable para la determinación estructural inicial de la reconstrucción cónica azar, aleatoriedad de puntos de vista macromoleculares es deseable cuando se refina la reconstrucción 3D a resoluciones más altas. En nuestro ejemplo, RyR1 interactúa con el carbono con el fin favorito "cuádruple '(Figura 2D) y requiere rejillas perforadas para la aleatoriedad de las orientaciones y mayor resolución ^36.

Maximizar SNR. La mejor estrategia para aumentar la SNR es para reducir las fuentes de ruido de fondo. Excesiva de hieloespesor y (si la hay) de espesor de película de carbono más allá de lo que se necesita para apoyar e integrar la proteína añadirá ruido extra. Por lo tanto el espesor del hielo se debe reducir a la mínima necesaria mediante el control de secante tiempo, la presión, RH, y la calidad del papel de filtro. Para el soporte de carbono, un (~ 5 nm) de película fina de carbono se acoda sobre la película de carbono holey más grueso: el carbono holey gruesa proporciona la resistencia mecánica mientras que la muestra se forma la imagen sobre el agujero de carbono cubierto delgada. Por otro lado, tenga en cuenta que el hielo extremadamente delgada y / o de carbono puede resultar en un soporte fácil de romper que puede convertirse en una web (Figura 3D). Para maximizar la SNR, cualquiera de los componentes de amortiguamiento innecesarias deben ser evitados. Para las proteínas de membrana, el detergente tiene un peaje significativo en contraste (véase la Figura 2D, panel derecho). Además mediante la reducción de la tensión superficial del detergente cambia la forma en la que la muestra se extienda sobre el soporte. Algunas proteínas de membrana requieren la presencia de lípidos, además de detergent, lo que reduce aún más el contraste. Para superar esta La muestra puede ser diluida en un tampón con concentración de detergente inferior y sin lípido justo antes de la ^crio-37 hundiendo. Nuevos detergentes alternativos ¹⁶ y el uso de nanodiscos ³⁸ para estabilizar el componente de dominio transmembrana parecen ser los enfoques eficaces para proteínas de membrana de formación de imágenes por cryoEM.

Luchar por imágenes de alta calidad y se preparan para la corrección del FTL. Especímenes vitrificados requieren altos valores de desenfoque para generar suficientes imagen (fase) de contraste en el que el CTF, la función que relaciona la intensidad de la frecuencia, tiene varias transiciones cero, momento en el que no hay información. Mientras corrección CTF no es necesario para la reconstrucción 3D de baja resolución, para aspirar a una resolución más alta, para recuperar una representación exacta del objeto 3D, las imágenes con diferentes defoci necesario recopilar de manera que la corrección CTF computacional se puede hacer.Determinación CTF y la corrección se incluye en los principales paquetes de software SPA ^4-7; detalles se pueden encontrar en otro lugar ^39. Para la corrección óptima CTF, utilizar una gama de defoci. Una buena estrategia es alternar entre 3-4 valores de desenfoque. Los valores dependen del tamaño de la macromolécula (tamaños más grandes requieren menos desenfoque), el espesor del hielo / carbono (muestra más delgado requiere menos desenfoque), y la tensión (voltaje inferior requiere menos desenfoque). Para 200 kV, una buena gama de partida de los valores es de 2,5, 3, 3,5 y 4 micras desenfoque. El CTF se manifiesta como anillos de alta y baja intensidad alterna (Thon suena ⁴⁰⁾ en el espacio de representación recíproca, el espectro de potencia. Viendo el espectro de potencia permitirá conocer el potencial de resolución; la frecuencia de la mayor cantidad de anillo visible Thon es el más cercano una estimación a priori de la resolución alcanzable. El espectro de potencia se debe revisar periódicamente, y astigmatismo (no circular) anillos Thon (Figura 3C) debe ser corregido con la astigmador objetivo. Anillos Thon deben ser visibles por lo menos hasta la resolución deseada.

Un conjunto de datos cryoEM obtenidos utilizando este protocolo puede ser procesado directamente por SPA a fin de generar una reconstrucción 3D. Incluso con una muestra ideal, la calidad de la reconstrucción 3D dependerá del rendimiento y especificaciones del equipo de TEM, y en el procesamiento de imágenes. Con las continuas mejoras en ambos frentes, y con mención especial a los detectores de electrones directas desarrolladas recientemente, la posibilidad de obtener reconstrucciones en 3D a resolución atómica de manera más consistente está más cerca de lo que ha sido nunca.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
El gas aire de etano		371745	pureza del 99,99% muy importante, las impurezas pueden provocar contaminantes de alto contraste en la red. ATENCIÓN:
inflamable Nitrógeno líquido	Airgas	27135	99% de pureza. ATENCIÓN: la manipulación de nitrógeno líquido en una cámara frigorífica supone un grave peligro de asfixia, ya que el nitrógeno desplaza al oxígeno sin ninguna señal de advertencia.
Dumont n.º 5 Pinzas antimagnéticas	Ted Pella	5326
Hojas de mica, 1 x 4 cm	Ted Pella	54
Varillas de grafito, tamaño preafiladas 1/8" de diámetro x 2 y frac14; ” punta larga 0.039" diámetro tipo cuello	Electrónica Microscopy Sciences	70220-45
350 ml cryo-dewars	Pope	8600
Cu 400 malla rejillas agujereadas  Quantifoil	Quantifoil	Q10525
Cu 400 malla rejillas perforadas C-Flat	Protochips	CF-1.2/1.3-4C
Dispositivo de descarga incandescente	Ciencias de la Microscopía Electrónica Modelo	E7620
Estación de bombeo	turbo Gatan	Modelo 655
Evaporador de carbono	Denton Vaccum	Modelo 502B
Émbolo de congelación	FEI	Vitrobot Mark IV
Microscopio electrónico de transmisión 200 kV	FEI Cámara CCD	Tecnai F20
4k x 4k	Gatan	UltraScan 4000 UHS Software de procesamiento de
procesamiento de imágenes EMAN			http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Software de procesamiento de imágenes Spider			http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
software de procesamiento de imágenes Freealign			http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
software de visualización 3D Chimera			http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Lapa Hemocianin	Biosyn