Artículo de método

Evaluación del Impacto de la exposición repetida de Organotípicos 3D bronquiales y nasales Modelos Tissue Culture Whole humo del cigarrillo

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DOI:

10.3791/52325

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12 de febrero de 2015

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1Biological Systems Research, Philip Morris International R&D, Philip Morris Products S.A.

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es exponer modelos organotípicos de tejido bronquial y nasal en 3D humanos al humo de cigarrillo (CS) convencional en la interfaz aire-líquido. A continuación, se investiga el impacto de la CS en los tejidos mediante un ensayo de actividad del citocromo P450, una medición del latido de los cilios y un enfoque de biología de sistemas.

Resumen

El humo del cigarrillo (CS) tiene un gran impacto en la biología pulmonar y puede resultar en el desarrollo de enfermedades pulmonares como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica o el cáncer de pulmón. Para comprender los mecanismos subyacentes del desarrollo de la enfermedad, sería importante examinar el impacto de la exposición al CS directamente en los tejidos pulmonares. Sin embargo, este enfoque es difícil de implementar en estudios epidemiológicos porque el muestreo de tejido pulmonar es complejo e invasivo. Alternativamente, los modelos de cultivo de tejidos pueden facilitar la evaluación de los impactos de la exposición en el tejido pulmonar. Los cultivos celulares 2D sumergidos, como los cultivos de células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE), se han utilizado tradicionalmente para este propósito. Sin embargo, no pueden exponerse directamente al humo de manera similar a la situación de exposición in vivo. Los modelos de cultivo de tejidos en 3D desarrollados recientemente reflejan mejor la situación in vivo porque se pueden cultivar en la interfaz aire-líquido (ALI). Sus lados basales están inmersos en el medio de cultivo; mientras que sus lados apicales están expuestos al aire. Además, los cultivos de tejidos organotípicos que contienen diferentes tipos de células, representan mejor la fisiología del tejido in vivo. En este trabajo, se demuestra la utilización de un sistema de exposición in vitro para exponer modelos de tejido bronquial y nasal organotípico humano a la corriente principal de CS. Se midió la frecuencia de latidos ciliares y la actividad del citocromo P450s (CYP) 1A1/1B1 para evaluar los impactos funcionales del CS en los tejidos. Además, para examinar las alteraciones inducidas por CS a nivel molecular, se generaron perfiles de expresión génica a partir de los tejidos tras la exposición. Se observó un ligero aumento en la actividad de CYP1A1/1B1 en los tejidos expuestos al CS en comparación con los tejidos expuestos al aire. Un enfoque de biología de sistemas basado en redes y transcriptómica fue lo suficientemente sólido como para demostrar alteraciones del metabolismo xenobiótico inducidas por CS que eran similares a las observadas en las células epiteliales bronquiales y nasales obtenidas de fumadores.

Introducción

Los pulmones están directa y constantemente expuestos al aire inhalado que puede contener diversos tóxicos como contaminantes y constituyentes del humo del cigarrillo (CS). El estudio del impacto de la exposición a esos tóxicos en los tejidos respiratorios es más informativo cuando se realiza de una manera que se asemeja a la exposición in vivo. En comparación con los cultivos celulares sumergidos en 2D clásicos (por ejemplo, células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE)), los modelos de tejido organotípico en 3D recapitulan mejor los aspectos morfológicos, fisiológicos y moleculares del epitelio de las vías respiratorias humanas in vivo1,2: los modelos de tejido en 3D contienen la diversidad de los tipos de células observados in vivo, incluidas las células epiteliales diferenciadas, las células ciliadas y no ciliadas, las células caliciformes y las células basales. Tienen uniones estrechas funcionales y exhiben un fenotipo mucociliar 1-3. Además, los cultivos pueden cultivarse en una membrana porosa permeable, en una interfaz aire-líquido, lo que permite una exposición directa al aerosol en el lado apical (mientras que el lado basolateral se sumerge en el medio de cultivo) 3-5. Dvorak y sus colegas informaron que los perfiles de expresión génica de los modelos de tejido bronquial eran similares a los obtenidos de los cepillados bronquiales humanos. Además, Mathis y colaboradores demostraron que las respuestas de estos modelos de tejido a la CS eran similares a las diferencias observadas entre las células epiteliales bronquiales obtenidas de fumadores y las células obtenidas de no fumadores 6. Por último, dado que los modelos de tejido bronquial podrían cultivarse durante varios meses 4,5, podrían utilizarse para examinar los efectos de la exposición a largo plazo de los elementos de prueba.

Las evaluaciones de citotoxicidad son parámetros comunes medidos después de agresiones químicas o para evaluar la toxicidad de compuestos o mezclas específicas. Por ejemplo, la integridad de la membrana puede medirse mediante un ensayo luminiscente y permite medir un efecto citotóxico dependiente de la dosis en el cultivo celular 7. Sin embargo, para evaluar los efectos fisiopatológicos de los compuestos a concentraciones subtóxicas, deben medirse otros parámetros. Por ejemplo, la integridad del tejido determinada mediante el ensayo de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) garantiza la funcionalidad de las uniones estrechas y monitorea la disrupción de la capa epitelial 8,9. La frecuencia de latidos ciliares también permite medir los efectos relacionados con el CS en los tejidos respiratorios. Una frecuencia normal de latidos para el revestimiento de cilios que bordea el tracto respiratorio superior e inferior es importante para proteger contra las infecciones de las vías respiratorias 10. Cada una de las células epiteliales cilíndricas ciliadas del epitelio respiratorio tiene 200-300 cilios latiendo a una frecuencia determinada para eliminar los agentes infecciosos o las partículas inhaladas atrapadas en el moco liberadas por las células caliciformes intercaladas 11. El CS contiene sustancias químicas que pueden inhibir el latido ciliar 12, lo que reduce la protección de las vías respiratorias. Este trabajo muestra que el latido ciliar se puede medir en modelos de tejido organotípico. Este enfoque permite evaluar si las células epiteliales exhiben su función normal en el cultivo de tejido organotípico. El CS también activa las respuestas del metabolismo xenobiótico en el tracto respiratorio para metabolizar los componentes del humo del tabaco 13. Se puede medir la actividad de las enzimas del metabolismo xenobiótico de fase I, CYP1A1 y CYP1B1, de los modelos tisulares. Además, como se informó anteriormente, la expresión génica global se puede medir en los modelos organotípicos de tejido bronquial 6,14,15. Se aprovecha un enfoque de biología de sistemas basado en redes y datos transcriptómicos para evaluar el impacto de la CS en el metabolismo de los xenobióticos 15.

Las metodologías utilizadas para exponer modelos organotípicos de tejido bronquial y nasal en 3D a la corriente principal de CS utilizando un sistema de exposición in vitro y para medir las respuestas de los tejidos a esta exposición en comparación con la exposición al aire fresco (control) se detallan aquí.

Protocolo

1. La cultura del Modelo bronquial Cultura Organotípicos Tissue

Nota: Los modelos de tejidos reconstituidos fueron comprados como inserciones que están listos para usar. Alternativamente, la cultura podría ser desarrollado a partir de células primarias como se describe por ejemplo por Karp y colegas 16. Tras la recepción de los tejidos en un envase estéril, siempre debe sostener los tejidos organotípicos humanos bajo condiciones estériles.

  1. Añadir 0,7 ml de pre-calentado (37 ° C) medio de ensayo a cada pocillo de una nueva placa de 24 pocillos estéril bajo el capó.
  2. Retire el embalaje de los tejidos debajo de la capilla, y transferir los insertos de cultivo de tejidos a la placa de 24 pocillos preparado nueva (que se describe en el paso 1.1. Anterior).
  3. Mantener y la cultura de los tejidos en una incubadora a 37 ° C (5% de CO2, 90% de humedad).
  4. Sustituya el medio cada 2 días.
  5. Durante un cambio de medio, examinar los tejidos bajo un microscopio de luz para asegurarse de que son contaminati-en libre y que no hay fugas de medio.

2. El humo del cigarrillo (CS) La exposición utilizando un sistema in vitro exposición

  1. Tres días antes de los experimentos de exposición, se lava la parte apical de la cultura de tejido con 200 l de medio de cultivo.
  2. En el día de la exposición, si se planea la medición del movimiento ciliar antes de la exposición, manejar los tejidos para la medición ciliar golpes como se describe en la sección 3.
  3. Pre-calentar la cámara climática de la vitro sistema de exposición y el módulo de base de cultivo a 37 ° C. Rellene el módulo de base de cultivo con 17,5 ml de medio por fila.
  4. Quitar los tejidos de la incubadora y colocarlos bajo el capó para transferir los insertos de cultivo de tejido de la placa de cultivo al módulo de base de cultivo de la vitro sistema de exposición en. Además, cubra el módulo de base de cultivo con una tapa de vidrio.
  5. La transferencia de los tejidos en la cámara climática de la vitro syste exposición enm para la exposición a la corriente principal CS.
  6. Si el sistema de exposición en vitro está equipado con una microbalanza, la configuración de la microbalanza de cristal de cuarzo antes de ejecutar la exposición para medir la deposición de partículas en tiempo real del humo en un cristal de cuarzo usando el software microbalanza.
    1. Vuelva a colocar los cristales en los módulos microbalanza conectados a cada fila del sistema de dilución / distribución.
    2. Conecte el módulo microbalanza al software microbalanza. Ajuste la escala de la medición a cero en el software.
  7. Exponer los tejidos de acuerdo con el procedimiento experimental (por ejemplo, como en la Figura 1.,)
    Nota: Antes de la exposición, los cigarrillos de referencia (3R4F) están condicionadas entre 7 y 21 días bajo condiciones controladas a 22 ± 1 ° C y humedad relativa de 60 ± 3% de acuerdo con la norma ISO 3402 17.
    1. Generar el humo del cigarrillo (por ejemplo., A partir de 3R4F cigarrillos) con un 30-puerto mach carrusel de fumarine según el régimen intenso de Salud de Canadá: El humo de los cigarrillos a una longitud trasero estándar, es decir, aproximadamente 35 mm en 55 ml soplo más de 2 segundos, dos veces por minuto y 8 segundos de tiempo de escape de la bomba.
      Nota: Si es necesario, diluir la corriente principal CS de manera que la dosis no es demasiado tóxico. En resultados presentados aquí, el humo se diluyó hasta 16% (vol / vol).
    2. Usar 60% humidificado al aire para las muestras de control (expuesto aire).
    3. Exponer los tejidos de 6-7 min (es decir., 1 cigarrillo o expuesta al aire) en el sistema in vitro de la exposición en
    4. Poner los tejidos de nuevo en la incubadora a 37 ° C (5% de CO 2, 90% de humedad) durante 1 hr.
    5. Repita los pasos 2.7.3 y 2.7.4 de tres veces más.
  8. Al final del experimento de exposición, detener el software microbalanza. El software generará un archivo que contiene todas las mediciones junto con una representación gráfica de la deposición de partículas.
  9. Traslado de regreso a los tejidos del cultivo bmódulo ase a la placa de cultivo. Coloca los tejidos de nuevo en la incubadora a 37 ° C (5% de CO2, 90% de humedad) hasta que las mediciones de los distintos criterios de valoración en los puntos de tiempo después de la exposición específicas.

3. Medición del movimiento ciliar

Nota: De acuerdo con el plan experimental (Figura 1), ficha ciliar vencer antes de la exposición y directamente después de la exposición.

  1. Retire las placas de cultivo de tejidos de la incubadora y se dejan bajo el capó a TA durante 30 min para estabilizar el latido cilios.
  2. Coloca los tejidos bajo el microscopio óptico conectado al Software CiliaMetrix.
  3. Grabe la película y la frecuencia (en hertzios) del movimiento ciliar. Medir la frecuencia de cada 3 s durante 1 minuto.
  4. Devolver los tejidos de nuevo a la incubadora a 37 ° C (5% de CO2, 90% de humedad).

4. resistencia eléctrica transepitelial (TEER) Medición

Nota: La medición de la TEER se lleva a cabo 3 días antes y 48 horas después de la exposición bajo el capó en condiciones estériles usando palillos de electrodos (STX-2) conectado a un voltohmmeter.

  1. Añadir 200 l de medio de cultivo a la superficie apical de los tejidos bronquiales humanos.
  2. Encienda la máquina EVOMX; lavar el electrodo con una solución de etanol al 70%.
  3. Lavar el electrodo con el medio de cultivo.
  4. Medir la resistencia (Ω) mediante la inserción del electrodo en el medio en el lado apical de la cultura del tejido sin tocar el tejido.
  5. Repita el paso 4.4 de cinco veces para obtener mediciones quintuplicado.
  6. Después de las mediciones, eliminar suavemente el medio desde el lado apical de los cultivos de tejidos utilizando un aspirador.
  7. Devolver los cultivos de tejidos a la incubadora a a 37 ° C (5% de CO 2, 90% de humedad) para el cultivo.

5. El citocromo P450 (CYP) 1A1 / 1B1 Activity

  1. Antes del inicio del estudio, preparar el reactivo de detección luciferina mediante la transferencia de todo el contenido de la botella del tampón de reconstitución adecuada a la botella de color ámbar que contiene el reactivo de detección luciferina (de acuerdo con las instrucciones del fabricante). Almacenar alícuotas de 2 ml a -20 ° C durante un máximo de 1 mes.
  2. Para el 48 hr tiempo después de la exposición, incubar los tejidos durante 48 horas después de la exposición CS a 37 ° C.
  3. Calentar la detección de reactivo de luciferina a RT.
  4. Incubar insertos de tejido durante 3 horas o O / N con el sustrato luciferina-CEE (diluido al 1:50) en el medio de cultivo basal.
  5. Transferencia de 50 l de medio de cultivo de cada tejido se insertan a una placa de luminómetro de 96 pocillos blanca opaca a TA.
  6. Añadir 50 l de reactivo de detección luciferina a cada pocillo para iniciar una reacción luminiscente.
  7. Se incuba la placa a temperatura ambiente durante 20 min.
  8. Lea la luminiscencia usando un luminómetro.
    Nota: Para laluminómetro, utilice un tiempo de integración de 0,25 a 1 seg por así como una guía.

6. Extracción de ARN.

  1. Antes de recoger los insertos de tejido organotípicos 3D, preparar 1) una caja con hielo seco, 2) cantidad suficiente de cuchillas (uno por inserción 3D), 3) PBS frío sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, 4) un 25 ml pipeta de vidrio, y 5 ) agujas de vidrio estériles para la aspiración.
    1. Tubos de etiquetas llenas de bolas de cerámica para homogeneizar muestras celulares sólidos y añadir 700 l de Qiazol.
    2. Encienda la máquina de aspiración.
    3. Recoja la placa de los insertos de tejido organotypic 3D a partir de la incubadora.
    4. Lavar cada inserto en la placa 3 veces con PBS frío. Entre los lavados, aspirar PBS con la aguja de vidrio. Después del tercer lavado, aspirado con PBS y la placa de cubierta para prevenir el secado de la pieza de inserción.
    5. Para cada inserción de la placa, corte la membrana de inserción (en el que reside inserto tejido 3D) hasta que el membrane quede plana hacia abajo en la hoja.
    6. Transferir el tejido (junto con la membrana de inserción) de la hoja al tubo de homogeneización debidamente etiquetado y el tornillo de la tapa en el tubo, agitar y agitar ella.
    7. Congelar la muestra en hielo seco y almacenar a -80 ° C o continuar la extracción de RNA.
      Nota: Antes de la extracción de RNA, etiquetar todos los tubos y columnas según el diseño de la aleatorización (si es aplicable). Preparar todos los reactivos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y sacar muestras de -80 ° C congelador y descongelar en hielo hasta que estén completamente descongelados.
  2. Homogenización
    1. Muestras Grind con homogeneizar instrumento en 6000 Hz durante 45 segundos. Repetir si las muestras no son correctamente homogeneizada y dejan las muestras durante 5 min a RT.
    2. Añadir 140 l de cloroformo a la muestra y agitar durante 10-15 seg.
    3. Transferir el sobrenadante del tubo de homogeneización a un tubo de bloqueo de fase y agitar en unatermoagitador durante 2 min a 1400 rpm y RT.
    4. Además incubar las muestras durante 2 min a RT y las muestras de centrifugación a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  3. ARN precipitación, lavado, suspensión y purificación en QIAcube.
    1. Pasar la fase acuosa superior en un nuevo tubo de 2 ml.
    2. Cargue todos los reactivos necesarios en el robot de extracción de acuerdo con la hoja de protocolo del fabricante, seleccione el protocolo apropiado, ajuste el volumen de elución (30 l) y ejecutar el robot de extracción.
    3. Una vez finalizada la carrera, retire los adaptadores del rotor y mantener los tubos de elución inmediatamente a 4 ° C para su posterior análisis o a -80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
  4. Control de calidad del ARN aislado
    1. Determinar la cantidad del ARN aislado usando un lector de UV de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Compruebe la calidad del ARN y la integridad del ARN usando microfluidos-gel a base de lab-on-a-chip y un lector de UV, according a las instrucciones del fabricante.

7. Microarray Workflow

Nota: El proceso se describe a continuación se centra en el método para el kit de Affymetrix GeneChip alto rendimiento 3'IVT Express, que se utiliza para la síntesis de destino para la hibridación en los cartuchos de expresión de genes Affymetrix 3 'a partir de la preparación del ARN para el uso del un complejo sistema de tratamiento de líquidos (por ejemplo., pipeteo, dilución, dispensación o de integración).

  1. Preparación
    1. Selección aleatoria de muestras para evitar efectos lotes. El número de muestras procesadas por lotes es de 1 a 96, incluyendo uno positivo (Human RNA Comercial universal de referencia) y uno negativo (RNasa libre de agua) de control por lote.
    2. Inicie el objetivo de síntesis utilizando 100 ng de ARN total en 3 l de RNasa libre de agua. Para 100 ng de ARN total, utilizar un 16 h de tiempo de incubación.
  2. Amplificación del ARN
    1. Prepare el Poly-A ARN espiga-en solución de control por una dilución en serie de la poli-A ARN Stock con poli-A de control de tampón de dilución:
      1. Para la dilución 1, prepare 2 l control de stock poliA en 36 tampón de dilución l.
      2. Para la dilución 2, preparar 2 l de dilución de 1 en 98 l de tampón de dilución.
      3. Para la dilución 3, preparar 4 l de dilución de 2 en 196 l de tampón de dilución.
      4. Para la dilución 4, preparar 20 l de dilución de 3 en 180 l de tampón de dilución.
    2. Diluir el ARN en RNasa libre de agua para obtener una concentración de 33,3 ng / l.
    3. Añadir 2 l de la solución de control de poliA a los 3 l de muestra de ARN total directamente en una placa de 96 pocillos. Este paso se realiza por el sistema de manejo de líquidos.
    4. Prepare el sistema de manejo de líquidos y la síntesis de destino. Coloque las placas en el robot. Colocar todos los reactivos necesarios y el material de laboratorio en la cubierta. El robot se iniciará el procedimiento de preparación de la appropriate mezclas maestras e incubar las muestras en el bloque de PCR control remoto automatizado.
    5. Primero de Control de Calidad Comprobar: Control del proceso de amplificación
      1. Si la calidad de ARNa es aceptable, realizar el paso de la fragmentación mediante la adición a cada muestra de 8 l de tampón 5X fragmentación (Este paso se realiza por el sistema de manejo de líquidos). De lo contrario, realice el paso anterior de nuevo a partir de la ARN. Utilice fragmentada Arna inmediatamente o almacenar sin diluir y fragmentada Arna a -20 ° C (o -70 ° C para el almacenamiento a largo plazo).
      2. Realizar un segundo análisis de control de calidad por recoger aleatoriamente 12 muestras en la placa y la transferencia de 1 l en el sistema basado en gel de microfluidos para comprobar la eficiencia de la fragmentación.
  3. Procedimiento de hibridación
    1. Analizar los códigos de barras de chips y registrar cada muestra en el software del fabricante de acuerdo con las instrucciones.
    2. Preparar la mezcla de hibridación comosigue para una sola reacción y añadirlo a 33 l de la ARNa fragmentado y marcado: 4,2 l de oligonucleótido de control B2 (3 nM), 12,5 l de 20x controles de hibridación eucariotas, 25 l de DMSO al 100%, 125 l de tampón de hibridación 2X y 50 l de H 2 O para un volumen final de 216,7 l
      Nota: Hibridar, lavar y escanear los controles positivos y negativos antes de procesar las muestras.
    3. Pre-humedecer la matriz con 200 l de mezcla pre-hibridación que contiene el kit de hibridación de lavado y las manchas.
    4. Coloque el chip en la hibridación horno a 45 ° C y 60 rpm durante 10 min.
    5. Mientras tanto, desnaturalizar la placa (que contiene la mezcla de hibridación cóctel final) en un bloque de PCR a 99 ° C durante 5 min y 45 ° C durante 5 min.
    6. Retire la mezcla pre-hibridación de la matriz y reemplazarlo con 200 l de la meta de cóctel de hibridación (una muestra por chip).
    7. Coloque la matriz en la Hybridization establece horno a 45 ° C durante 16 hr (O / N) con una velocidad de rotación de 60 RPM.
  4. Lavado y tinción
    1. Ejecutar "Fluidics" de la barra de menú del software. En el cuadro de diálogo de fluidos, seleccione el módulo de interés (1-4), a continuación, seleccione el programa Prime_450 a todos los módulos. Coloque el tubo de tampón de lavado A en una botella (400 ml) y para el tampón de lavado B en una botella (200 ml), así como para milliQ agua en una botella (500 ml).
    2. Posteriormente, siga las instrucciones de la pantalla LCD. Levante las agujas y colocar 600 l mancha cóctel 1 (SAPE Solución Mix) y 600 l mancha cóctel 2 (solución de anticuerpos de la mezcla) que contiene tubos de microcentrífuga en las posiciones # 1 y # 2, y 900 l arreglo que contiene la solución tampón en la posición # 3.
    3. Después de la O / N de incubación en el horno, aspirar el cóctel en el chip y llenar el microarray con 250 l de tampón de lavado A. Asignar el chip derecho de cada módulo, seleccione el protocolo FS450-001 y ejecutar cada module, siguiendo las instrucciones que aparecen en pantalla. Este proceso dura 90 min.
    4. Una vez que la pantalla LCD indica mensaje de "expulsión del cartucho", retire el chip e inspeccionar si hay burbujas. Si hay burbujas, llenar la matriz en su totalidad con el tampón de arreglo que contiene. Aplicar pegatinas en los tabiques para evitar cualquier fuga en el escáner y limpiar la ventana de microarrays antes de la carga en el escáner.
  5. Escaneo.
    1. Caliente el escáner. Cargue el chip en el cargador automático del escáner y comenzar a escanear.
      Nota: Después de ~ 12 min por chip, se genera un archivo .cel por chip.
    2. Compruebe la imagen y alinear la red (si es necesario) hasta el lugar para identificar las celdas sonda.
      Nota: El conjunto de datos se ha presentado a ArrayExpress (código Adhesión = E-MTAB-1721).

8. Sistemas basados ​​en la red Análisis Biología para una evaluación de impacto

  1. Procesamiento de datos de microarrays.
    Nota: el procesamiento de datos de unamétodos de calificación d se implementan utilizando la versión R entorno estadístico 2.14.
    1. Abra una sesión de R 18 y cargar los affy 19, gcrma y paquetes affyPLM instalados ejecutando los comandos: biblioteca (affy)> library (GCRMA)> Biblioteca (affyPLM)
    2. Leer archivos de datos brutos que ejecutan el comando: data.affybatch <-ReadAffy ("ruta de la carpeta donde se almacenan los archivos de la CDA")
    3. Restar la corrección de fondo y normale cuantil para generar valores de expresión sonda conjunto con el paquete gcrma, ejecutando el comando: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. El control de calidad.
    1. Generar parcelas de degradación del ARN con el comando: deg <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. Extraer el coeficiente de la pendiente degradación del ARN ejecutando el comando: pendiente = deg $ pendiente
    3. Trazar el coeficiente de la pendiente e identificar posibles valores atípicos.
    4. Generar nuse y RLE parcelas ejecutando los siguientes comandos: Pset <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (juego de parámetros)> NUSE (juego de parámetros).
    5. Identificar si algunos de los diagramas de caja generados son valores atípicos: un array se considera atípico si al menos 2 de los 3 parámetros de control de calidad se definen a continuación se desvían de las otras matrices:
      - Deg $ pendiente es diferente de la pendiente promedio de $ deg
      - NUSE trama: un array se considera atípico si el cuartil superior cae por debajo de 0,95 o el cuartil inferior por encima de 1,05, es decir, si el diagrama de caja es enteramente por encima de 1,05 o totalmente por debajo de 0,95..
      - RLE parcela: una matriz de valores atípicos se considera si la mediana de la distribución RLE es mayor que 0,1 o menor que -0,1.
    6. Si un conjunto se identifica como una de las demás, luego descarta, y empezar de nuevo desde el paso 8.1.2.
    7. Montar un modelo lineal general a los datos para los contrastes específicos de interés (es decir., Las comparaciones de las condiciones de "control" "tratado" y) la generación de valores de P primas para cada sonda establecido en el microarray, que puede ser furtella ajustó mediante el procedimiento Benjamini-Hochberg del paquete Limma. Seleccionar un probeset por gen para mantener como representante del gen para análisis adicionales como se describe en 20.
      Nota: Un factor de bloqueo (la placa de la exposición) desde el diseño experimento se representó en el modelo de procesamiento de datos.
  3. Análisis basados ​​en la red.
    Nota: El método tal como se aplica aquí se describe en detalle en Martin et al. (En revisión en la bioinformática BMC).
    1. Para cada comparación por parejas de interés, empezar desde el computarizada (log2-) cambios veces (tratamiento versus control) para cada gen bajo la red (desde el paso 8.2).
    2. Calcule la matriz laplaciana firmado L de la red definida por L (i, j) = - signo (i ~ j) w (i, j) si hay una ventaja de peso w (i, j) entre el nodo i y j, L (i, j) = deg (i) es el grado ponderado de i y L (i, j) = 0 más. El peso w (i, j) son igual a 1 si i y j son en la columna vertebral y w (i, j) = 1 / n Si i es un nodo de red troncal y j es uno de sus n neighbors en la capa de transcripción.
    3. Calcule calificaciones de la columna vertebral por f = L3-1L2Tx donde L3 es la sub-matriz de L a los nodos troncales y L2 es la sub-matriz de L cuyas filas corresponden a los nodos de la capa de la transcripción y la columna a los nodos troncales
    4. Calcule el firmado Laplaciano, Q, de la red definida por la red troncal donde se invierten todos los signos de borde.
    5. Calcule el puntaje NPA por NPA = fTQf.
    6. Calcule el intervalo de confianza, la columna vertebral de permutación borde p-valor y la transcripción de permutación capa p-valor.
      Nota: (. Por ejemplo, la variación biológica entre las muestras en un grupo experimental) Además de los intervalos de confianza de las puntuaciones del NPA, que representan el error experimental, las estadísticas de compañía fueron derivados para describir la especificidad de la puntuación NPA a la biología descrita en la red. Debido NPA es una forma cuadrática de las veces los cambios, su varianza se puede computarizada basada en el pliegue del cambio estimado variances. Un intervalo de confianza se deriva posteriormente utilizando el teorema del límite central. Dos pruebas de permutación se implementaron 21 por el que en primer lugar, evalúa si los resultados eran específicos de la evidencia subyacente (es decir., Gen factores de cambio) en el modelo, lo que lleva a un valor P de permutación (denotado por * S en las figuras cuando P -valor <0,05). En segundo lugar, para evaluar si la capa de "causa y efecto" de la red contribuyó significativamente a la amplitud de la perturbación de la red (denotado por K * en las cifras cuando valor de p <0,05).
    7. Considere la red como afectado por el tratamiento si el intervalo de confianza no contiene cero y los dos de permutación los valores de p <0,05.
    8. Calcule los nodos principales que se definen como los nodos clave en la columna vertebral que contribuye hasta el 80% de la puntuación NPA.

Resultados

En los resultados se describen a continuación, los tejidos organotípicos fueron células epiteliales humanas primarias aisladas de saludable, no fumar, donantes de raza blanca y se reconstituyeron utilizando fibroblastos 15.

Modelos de tejidos nasales bronquial 3D y
En bronquial vitro y modelos organotípicos nasales parecerse a nivel celular del epitelio del tracto respiratorio humano (Figura 2).

Exposición CS
Modelos de tejidos nasales bronquial organotípicos y pueden estar expuestos repetidamente a la corriente principal de CS en la interfase aire-líquido. El procedimiento experimental utilizado para la exposición al humo de los resultados ilustrados aquí se representa en la figura 1.

Grabación de movimiento ciliar
Los cilios golpiza fue grabado en los tejidos expuestos al aire, como se ilustra en los videos. La exposición CS se asoció con una reducción de la frecuencia de latido ciliar: el pico más fuerte observado alrededor4 Hz en el simulacro expuestas y antes de la exposición no se observa por más tiempo después de la exposición CS (Figura 3). Esta frecuencia reducida haría los cilios latir menos eficiente para eliminar el moco y agentes infecciosos 22.

La medición de la TEER y CYP1A1 / actividad 1B1
TEER se midió 48 horas después de la última exposición a garantizar el tejido sigue siendo funcional. CYP1A1 / 1B1 actividad también se midió 48 h después del final de la exposición como se ilustra en la Figura 1. Los valores de TEER en los tejidos expuestos-CS no fueron significativamente diferentes en comparación con los tejidos expuestos al aire, confirmando que no hay ningún efecto citotóxico principal de humo a esta concentración. En la 48 h después de la exposición, CYP1A1 / 1B1 actividad de los tejidos se incrementó ligeramente, lo que indica un aumento modesto del mecanismo de defensa del tejido después de la exposición (Figura 4).

Los perfiles de expresión génica y sistemas basados ​​en la red bilogía enfoque para estudiar el impacto de la exposición CS en la alteración del metabolismo de xenobióticos
Los tejidos se recogieron a las 48 h puntos de tiempo después de la exposición. Posteriormente, se llevó a cabo el análisis de microarrays para generar perfiles de expresión génica de la CS- y tejidos expuestos al aire. Impacto de la exposición CS sobre el metabolismo de xenobióticos se investigó mediante un enfoque de la biología de sistemas basados ​​en la red que pueda traspasarse de los perfiles de expresión génica y como se informó anteriormente 15. Utilizando un enfoque de biología de sistemas basados ​​en la red muestra que los impactos de exposición CS en el nivel de los nodos de red troncal en el modelo de red de metabolismo de xenobióticos estaban bien correlacionados entre la in vitro y en conjuntos de datos in vivo (Figura 5). En contraste, en el nivel de cada individuo cambios de expresión génica, se observaron correlaciones entre el pobres in vitro (CS expuestos al aire vs. expuesta) e in vivo (fumadores vs. no fumadores).

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Figura 1. Esquema de procedimiento de la exposición repetida de CS a los modelos de tejidos bronquiales organotypic Abreviaturas:. CYP, citocromo P450; CS, el humo del cigarrillo; TEER, resistencia eléctrica transepitelial.

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Figura 2. organotípicos bronquial y modelos de cultivo de tejidos epiteliales nasales. Historieta que ilustra la bronquial (A) y el inserto de cultivo nasal (B) tejido en la interfase aire-líquido. Los modelos in vitro contenían células ciliadas que se muestran en la capa apical de las células teñidas con hematoxilina y eosina (C durante bronquial, nasal para D) como se informó anteriormente 15. Los modelos fueron co-cultivadas con fibroblastos que son importantes para el crecimiento y diferenciación de células epiteliales (indicado por las flechas). La tinción de los marcadores de linaje de las vías respiratorias: p63 (E para bronquial, F para nasal) y Muc5AC (G para bronquial, H para nasal) se muestran como se informó anteriormente 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Los cilios Beating frecuencia. Cilios frecuencia de latidos (CBF) se midió en aire expuesto y en el cultivo antes y después de la exposición. La disminución de la CBF fue visto después de la exposición CS (resultados representativos de dos inserto se muestran como réplica 1 (R1) y se replican 2 (R2)).

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Figura 4. Medición de CYP1A1 / actividad CYP1B1 y TEER paneles de izquierda. Indican la actividad CYP1A1 / CYP1B1 en el bronquial (A) y nasal (b) modelos de tejido. Paneles de la derecha indican la medición TEER en el bronquial (C) y nasal (D) los modelos de tejido. Se muestran las medias ± SD. Abreviaturas: CS, el humo del cigarrillo; CYP, el citocromo P450; TEER, resistencia eléctrica transepitelial; RLU, unidad de luminiscencia relativa.

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Figura 5. Los sistemas basados ​​en la red enfoque de la biología de la evaluación de impacto de la exposición al CS en el contexto del metabolismo de xenobióticos. Los cambios de los niveles de expresión de los genes se utilizaron para calcular la activación del nodo columna vertebral del modelo de red xenobióticos Metabolismo (A) strong> como se informó en una publicación previa 15. La figura de la derecha ilustra el concepto de la cuantificación de los nodos troncales, también conocidos como "valor de la red troncal diferencial", utilizando el enfoque de NPA. Los óvalos azules representan la actividad de los nodos de la red principal (es decir., La capa funcional) y las bolas verdes representan la expresión de genes (es decir., La capa de la transcripción). Impactos de la exposición CS en los tejidos bronquiales organotypic (in vitro, CS-expuestos vs aire expuesto) a las 48 h de post-exposición se compararon con los de fumar en epitelio bronquial humano recogido por broncoscopia y nasal epitelial por burshing cornete inferior (GSE16008 ) (in vivo, los fumadores frente a los no fumadores) (B). Inserciones, correlación de la expresión génica cambios entre la in vitro e in vivo de datos. Abreviaturas: CS, el humo del cigarrillo; NPA, red amplitud perturbación.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Aquí, hemos demostrado la aplicabilidad de los modelos de tejidos nasales bronquial y organotípico humano para evaluar el impacto de la exposición repetida CS. Como alternativa a la experimentación con animales, se han desarrollado una serie de sistemas de exposición para las evaluaciones toxicológicas de la exposición al aerosol in vitro (por ejemplo., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Estos módulos de exposición también se pueden utilizar para una evaluación toxicológica de los contaminantes del aire, partículas en el aire, nanopartículas, etc. En este estudio, hemos utilizado el sistema Vitrocell que puede acomodar hasta 48 muestras diferentes de forma simultánea, lo que permite más grandes experimentos a escala y una menor variabilidad entre tratamientos. Para cada exposición al aerosol in vitro, el riesgo de contaminación de cultivo de tejidos sigue siendo un riesgo importante cuya mitigación exige un manejo cuidadoso de los cultivos de tejidos a lo largo de los experimentos.

Medición de la deposición de partículas en tiempo real en la microbalanza durante el eexperimento Xposure permite monitorear que las dosis CS generados por el sistema de exposición son conformes a las expectativas. Para asegurar la exactitud de la deposición de partículas medido, creación de la medición en línea correctamente antes de la exposición es critial, por ejemplo, el establecimiento de la escala a 0. Además, debido a la diferencia entre las áreas de la microbalanza (2 cm) y la inserción de cultivo de tejido (0,33 cm 2), se ajustó el cálculo final de la zona de la inserción de cultivo: sólo el 33% de la deposición sobre la microbalanza refleja la deposición real en el inserto de cultivo.

La medición de la TEER para determinar la funcionalidad de barrera apretado nudo y para evaluar la interrupción de la capa epitelial es un procedimiento relativamente fácil de implementar, que se informó aquí. Sin embargo, debido a que los modelos de tejidos bronquiales y nasales contienen células caliciformes intercalados productoras de moco, lavado apical debe realizarse antes de las meas TEERmedi-. El lavado apical es crítico debido a la presencia de la capa de moco y la variabilidad de su espesor puede sesgo de la medición de la TEER, interferring con el impacto de la exposición CS. Esta noción está de acuerdo con lo reportado por Hilgendorf y sus colegas, en el que la permeabilidad de las células Caco-2 se vio afectada por el co-cultivo con la línea de células caliciformes productoras de moco HT29 23. El moco necesita ser lavada antes de la medición TEER, porque el lavado apical justo antes de la exposición puede interferir con las respuestas de los tejidos a CS. Por lo tanto, la medición se lleva a cabo tres días antes de la exposición, y no justo antes de la exposición.

Hemos demostrado que la actividad de CYP1A1 / CYP1B1 podría medirse a partir de los modelos de cultivos organotípicos tras la exposición CS aunque la actividad se incrementó sólo modestamente por CS. Esta señal débil puede ser amplificada por una incubación más largo del sustrato CYP1A1 / 1B1 (es decir., Luciferina-CEE), por ejemplo para24 h (datos no mostrados). Una de las limitaciones de la medición de la actividad de CYP en el presente trabajo es la ausencia de normalización a nivel de la proteína CYP o para el recuento de células, lo que podría ser tomada en consideración para futuros estudios para garantizar que la alteración en la actividad de la enzima no se ve influenciada por la alteración de ya sea el nivel de proteína o el recuento de células.

Nos informó que la exposición CS inhibe la ciliar superando tanto en los modelos de tejido bronquial y nasal. Observaciones similares se realizaron en diversos modelos de mamíferos y no mamíferos 12. Para ciliar batiendo medición, asegurando que los tejidos son manipulados y tratados de manera similar es crítica, por ejemplo, si se implementa el cambio medio, debe ser aplicado en todas las muestras. Sutto y sus colegas informaron que el pH afecta la ciliar mamíferos latiendo frecuencia 24. Por lo tanto, al comparar superando frecuencias entre las células tratadas con diferentes COMPUESTOS / mezclas, pHajuste debe ser considerado para minimizar la variabilidad de la medición latido ciliar. Además, la temperatura a la que se lleva a cabo la medición es también crítico como la frecuencia de golpeo ciliar disminuye con la disminución de la temperatura. Para minimizar la variabilidad debida a estos cambios, una incubadora de etapa superior, equipadas con la temperatura, CO2 y de la humedad se utilizó en este estudio. A pesar de ello, se observó que el ciliar batiendo frecuencias en los tejidos bronquiales después de la exposición CS eran muy variables (es decir., Aumentar en un inserto y disminuir en el otro inserto), lo que sugiere que el movimiento ciliar es correcto altamente perturbado después de la exposición. En contraste, se observó la ausencia de frecuencias de batido ciliar medibles en el tejido nasal después de la exposición CS, lo que sugiere que la respuesta del tejido nasal es más sensible y consistente. Esto está de acuerdo con una publicación anterior que demuestra que el tejido de la nariz tiene una menor capacidad para desintoxicar comoen comparación con el bronquio 25.

Por último, hemos demostrado que la expresión de genes de perfiles del bronquial organotípico y modelos de tejidos nasales expuestos a CS podría demostrar un impacto de CS en el metabolismo de xenobióticos. Curiosamente, la alteración observada en el metabolismo de xenobióticos en el organotípicos bronquial y nasal en modelos in vitro expuestos a CS asemejan a la de la situación in vivo en los fumadores como se discute en mayor detalle en una publicación anterior 15. Para los análisis de la expresión génica, usando el instrumento robótico hace un análisis de alto rendimiento posible. Por otra parte, el manejo robótico automático aumenta aún más la consistencia y exactitud de los resultados de la expresión génica. Sin embargo, la recogida rápida de las muestras de tejido era crítico para evitar la degradación del ARN durante la extracción de RNA. El procesamiento del ARN y los enfoques transcriptomic descritos aquí también se pueden aplicar a in vivo muestras de tejido.

Divulgaciones

Este estudio fue financiado por Philip Morris International.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Maurice Smith y Marja Talikka para su revisión del manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MucilAir-fibroblastos humanos-bronquiosEpithelix Sá rl, Ginebra, Suizahttp://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Culture MediumEpithelix Sá rl, Ginebra, Suizahttp://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELLVITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Alemaniahttp://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=
3R4F cigarrillo de referenciaUniversidad de Kentuckyhttp://www2.ca.uky.edu/refcig/
30 puertos máquina de fumar carrusel SM2000 PhilipMorris, Int.
Cámara y software CiliaMetrixLa Haute É cole de Gestion (HESGE), Ginebra, Suiza
Microscopio Leica DMIL Leica, Heerbrugg, Suiza
Fuente de luz LEDTitan Tool Supplies, Buffalo, NY
Electrodo de palillo STX-2World Precision Instrumentshttp://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
Voltohmímetro epitelial EVOMXTM World Precision Instrumentshttp://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
Reactivo de detección de luciferina 
Instrumento MagNA Lyser Rochehttp://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
cloroformo Sigma-Aldrichhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=
QIAcube Qiagen9001882
NanoDropThermo Scientifichttp://www.nanodrop.com/
Bioanalizador Agilent 2100 Agilenthttp://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip Alto rendimiento 3' IVT Express KitAffymetrixhttp://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G Affymetrixhttp://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G
,

Referencias

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