Rigidez mecánica en el microambiente tumoral juega un papel fundamental en el impulso de comportamiento maligno mediante el aumento de la actividad invadopodios y actomyosin contractilidad. Geles de poliacrilamida utilizando (PaaS), ensayos de invadopodios y de la fuerza de tracción se pueden utilizar para estudiar las propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas en respuesta a la matriz rigidez.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Los geles de poliacrilamida para invadopodios y Fuerza de tracción Ensayos sobre las células cancerosas
En este artículo
Resumen
Resumen
Tejidos tumorales rígidos han sido fuertemente implicados en la regulación de la migración celular y la invasión del cáncer. La migración invasiva a través de tejidos reticulados se ve facilitada por los salientes de actina-ricos llamados invadopodios que proteolíticamente degradan la matriz extracelular (ECM). Actividad invadopodios ha demostrado ser dependiente de la rigidez ECM y célula de cáncer de fuerzas contráctiles que sugieren que las señales de rigidez pueden regular estas estructuras subcelulares a través de la contractilidad actomiosina. Propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas pueden ser correlacionados in vitro utilizando ensayos invadopodios y de la fuerza de tracción sobre la base de geles de poliacrilamida (PAA) de diferentes rigideces. Propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas pueden ser correlacionados in vitro utilizando ensayos invadopodios y de la fuerza de tracción sobre la base de geles de poliacrilamida (PAA) de diferentes rigideces. Aunque existen algunas variaciones entre los dos ensayos, el protocolo presentado aquí proporciona un método para crear FCA ésimoa se puede utilizar en ambos ensayos y son fácilmente adaptables a las necesidades biológicas y técnicas específicas de los usuarios.
Introducción
La rigidez de la ECM asociado al tumor ha sido identificado como un factor significativo en la conducción de comportamiento maligno mediante el aumento de la contractilidad actomyosin 1-3. Mientras que este efecto se ha demostrado principalmente con células de cáncer de mama, la rigidez de la matriz se ha encontrado para alterar las propiedades invasivas de las células derivadas de una variedad de cánceres 4-8 lo que sugiere que la rigidez tumor pueden desempeñar un papel en otro tipo de cánceres. Para penetrar en los tejidos entrecruzados durante la migración invasivo, las células cancerosas utilizan protuberancias adhesivas actina-ricos conoci....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de cubreobjetos de vidrio para FCA
- Clean 12 mm cubreobjetos con toallitas bajos pelusa.
- Llama el cubreobjetos mm 12 y el cubreobjetos de 14 mm en la cúpula de cada 35 mm de vidrio plato inferior pasándolos a través de un mechero Bunsen con unas pinzas.
- Tratar los micropocillos con 200 l de NaOH 0,1 N durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirar y aire sequen los pocillos durante 30 minutos.
- Tratar a los pocillos con 50 a 100 l de 3-aminopropiltrimetoxisilano durante 10 min a temperatura ambiente en la campana de humos. Este producto químico reacciona con el plástico; por lo tanto, utilizar pipetas de ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
En el ensayo de invadopodios, invadopodios se identifican típicamente por colocalización de los marcadores como la actina y la cortactin en estructuras punteadas dentro del cuerpo de la célula (Figura 1). Tanto la degradación de forma activa y no degradante invadopodios puede ser contado y se diferencian por si estas estructuras están colocalized con áreas negras que carecen de señal fluorescente en la fibronectina marcada con FITC (Figura 1). Invadopodios se cuentan manualmente, y la d.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Se presenta un método para la fabricación de FCA que se pueden utilizar como la base para los ensayos de invadopodios y fuerza de tracción para correlacionar comportamientos celulares invasivas y contráctiles. Mientras FCA han sido utilizados para observar los efectos de rigidez en las células y calcular las fuerzas de tracción 18,24,27, este protocolo es el primero en desarrollar ensayos paralelos basados en APA con las mismas rigideces correlacionar comportamientos celulares invasivos y contráctiles en re.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el premio número K25CA143412 (Parekh). Nos gustaría reconocer que el apoyo adicional fue proporcionada por el Departamento de Otorrinolaringología. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Agradecimientos
Los autores no tienen nada que revelar.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3-Aminopropiltrimetoxisilano | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrilamida (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Ácido acrílico NHS éster | Sigma-Aldrich | A8060 | preparar fresco en campana extractora 10 mg/ml en DMSO |
| Alexa Fluor 546 faloidina | Life Technologies | A22283 | también puede utilizar rodamina |
| Persulfato de amonio | Bio-Rad | 161-0700 | preparar una solución fresca al 10% en 1x PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | usar 6 gotas para llenar micropocillos |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Albúmina sérica bovina | RPI | A30075 | hacer 3% para la solución de bloqueo en 1x PBS y almacenar en 4 ° C |
| Cubreobjetos (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Sigma-Aldrich | D9777 | preequilibrado en tampón de borato durante 15 - 30 min | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | úselo para hacer medio de invadopodia |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | úselo para hacer ácido acrílico solución de éster NHS |
| Factor de crecimiento epidérmico Vida | Tecnologías | PHG0311 | utilizar para hacer que el medio de invadopodia |
| Etanol | PHARMCO-AAPER | E200 | diluido con agua ultrapura al 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | uso para hacer que el medio de invadopodia |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | proteja de la luz |
| Gelatina | Polysciences | 00639 | Por lo general, prepare 10 ml de solución de sacarosa al 1% / gelatina al 1% en PBS y almacene a 4 grados; C (precaliente PBS para disolver la gelatina fácilmente) |
| Platos con fondo de vidrio (cubreobjetos de 35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | los cubreobjetos no están recubiertos |
| de glutaraldehído (25%) | Polysciences | 01909 | diluido con 1x PBS al 0,5% |
| Anticuerpo anti-ratón de cabra Alexa Fluor 633 | Life Technologies | A21050 | |
| Fibronectina de plasma humano | Life Technologies | 33016-015 | agregue 5 ml de agua ultrapura para hacer 1 mg/ml; alícuota en volúmenes basada en el uso para evitar ciclos excesivos de congelación y descongelación |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | uso para fabricar 10 veces el stock de PBS |
| Anticuerpo anti-cortactina 4F11 para ratones | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | uso para hacer 10x stock de PBS |
| NaCl | RPI | S23020 | se usa para hacer 10x PBS stock y tampón de borato |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | diluido con agua ultrapura a 0.1 N |
| Nu-Serum (suero bajo en proteínas) | BD Biosciences | 355500 | uso para hacer medio de invadopodia |
| Paraformaldehído | Acros | 416785000 | Por lo general, haga un 10% de caldo en 1x PBS, prepare en una campana extractora y agregue unos pocos ml de NaOH fuerte para disolver el paraformaldehído fácilmente y luego vuelva a pH 7.4 con HCl) |
| PBS (estéril) | Cellgro | 21-040-CV | uso para cultivo celular |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | uso para hacer medio de invadopodia |
| Borohidruro de sodio | Sigma-Aldrich | 452882 | preparar fresco en campana extractora 1 mg/ml en 1x PBS |
| Metaborato de sodio tetrahidrato | Sigma-Aldrich | S0251 | se usa para hacer tampón de borato |
| Sacarosa | RPI | S24060 | generalmente hace 10 ml de solución de sacarosa al 1% / gelatina al 1% en PBS y almacene a 4 & grados; C (precaliente PBS para disolver la gelatina fácilmente) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | haga un 10% de caldo en 1x PBS y úselo tal cual para la eliminación de células en el ensayo de fuerza de tracción o diluya con 1x PBS para tinción |
Referencias
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
