Abstract
Blandt andre patofysiologiske ændringer, kronisk eksponering for cigaretrøg forårsager betændelse og immunsuppression, som er forbundet med øget modtagelighed af rygere til mikrobielle infektioner og tumorforekomst. Ex vivo undertrykkelse af receptor-medierede immunresponser i humane perifere blod-mononukleære celler (PBMC'er) behandlet med røg bestanddele er en attraktiv metode til at studere mekanismerne og vurdere de sandsynlige langsigtede virkninger af eksponering for tobaksvarer. Her har vi optimeret metoder til at udføre ex vivo-assays under anvendelse af PBMC'er stimuleret med bakterielt lipopolysaccharid, en Toll-lignende receptor-4-ligand. Virkningerne af hele røg-medium (WS-CM), blev et præparat brændbart tobaksvare (TPP), og nikotin undersøgt på cytokinudskillelse og target celledrab af PBMC'er i ex vivo assays. Vi viser, at secernerede cytokiner IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 og IL-8 og intracellulære cytokiner IFN47 ;, TNF-α og MIP-1α blev undertrykt i WS-CM-eksponerede PBMC'er. Den cytolytiske funktion af effektorceller PBMC'er, som bestemt ved en K562 target celledræbende assay blev også reduceret ved udsættelse for WS-CM; nikotin var minimalt effektive i disse assays. Sammenfattende præsenterer vi en række forbedrede analyser for at evaluere effekten af TPPS i ex vivo assays og disse metoder kan let tilpasses til testning af andre produkter af interesse.
Introduction
En betydelig mængde viden peger på de sundhedsskadelige virkninger af kronisk cigaretrygning, herunder hjerte-kar-sygdom (CVD), kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) og kræft 1,2. Kronisk cigaretrygning har været kendt for at forårsage inflammation og immunsuppression, og disse ændringer er rapporteret at bidrage til øget risiko for mikrobiel infektion og cancer hos rygere 3. In vitro og ex vivo teknikker er anvendelige belyse den molekylære basis for de patofysiologiske virkninger af cigaretrøg 4-9 (tabel 1) og er anerkendt som vigtige værktøjer til at lede den nye regulering af forskellige tobaksvarer 10,11.
For eksempel har vi vist, at brændbare tobaksvarer præparater (TPPS) såsom hel røg-medium (WS-CM) og total partikler (TPM) er langt mere cytotoksiske og skadeligt forDNA end ikke-brændbare TPPS eller nikotin 12,13. I overensstemmelse med det offentliggjorte arbejde, blev det for nylig rapporteret, at brændbart TPPS eller nikotin 12,13. I overensstemmelse med det offentliggjorte arbejde, for nylig rapporteret vi at brændbare TPPS forårsagede markant immunosuppression. Dette blev vist ved suppression af Customs lignende receptor (TLR) -ligands, stimuleret cytokinsekretion og målrettet celle (K562) aflivning af PBMC'er i en ex vivo model 14. I betragtning af betydningen af betændelse i cigaretrøg-induceret sygdom processer, er yderligere optimering af assaybetingelserne at evaluere de immunmodulerende virkninger af cigaretrøg præsenteres i denne rapport.
Ex vivo assays måles typisk intracellulære og secernerede cytokiner samt cytolytiske funktion af cytotoksiske T-og NK-celler i K562 celledrabsassays 14. Assayene involveret præinkubation med WS-CM og nikotin og efterfølgende stimulering af PBMCs med TLR agonister over en periode på 3 dage; de endelige aflæsning udføres ved hjælp af enzym-linked immunosorbent assays (ELISA) og / eller flowcytometri. Vi udnyttede bakterielt lipopolysaccharid (LPS), som binder til TLR-4-receptorer og stimulerer PBMC'er resulterer i produktion af intracellulære cytokiner og sekretion af cytokiner. Ud over at optimere de forskellige analysetrin for evaluering af de immunmodulerende virkninger af TPPS vi også nuværende metoder til isolering af PBMC'er, celledødsassays og IL-8 kvantificering. Disse metoder kan anvendes til at løse andre forskningsspørgsmål og yderligere raffineres for at vurdere tobaksvarer i lovgivningen.
Tabel 1. Udgivet rapporter om in vitro og ex vivo-metoder anvendt til at undersøge varilus patofysiologiske virkninger af tobaksvarer præparater CS, cigaretrøg medium.; CSC, cigaretrøg kondensat; CSE, cigaretrøg ekstrakt; ELISA, enzymkoblet immunosorbent assay; GADPH, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase; qPCR, kvantitativ polymerase kædereaktion; RT, real time kvantitativ polymerase kædereaktion; TS, tobaksrøg.
| Forfatter (Studieår) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Celler | Humane bronkiale endothelceller (BEAS-2B), humane neutrofiler | Humane alveolære epitelceller (A549) | Humane luftvejenes glatte muskelceller (HASMC) | Humane premonocytic U937-celler, humane monocytter | Alveolær type II epitelceller (ATII) | Menneskelig monocytiskcellelinie (THP-1), human lungemakrofager |
| TPP anvendt | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Anvendt metode | ELISA, qPCR, migration, eltrafik skift | Immunohistokemisk-kemi, elektroforese Arrayscan kit, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforese | Gel-mobilitet skift | Lysmikroskopi elektronmikroskopi, elektroforese ELISA | qPCR, ELISA, E-toxate kit (Sigma), p65 pladeassay (Transam), elektroforese forskellige immunoassay kits |
| Mål | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, migration | Histonacetyltransferaser, histondeacetylaser, NF-KB, IL-8, pI KB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxin | Varmechok / stressproteiner (HSP / Hsp70), HF transskriptionsfaktor NF-KB,TNF-α | Surfactant protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK phosphorylering, cJun: DNA-binding, glutathion, p65: DNA-binding |
| Slutresultat | CSE nedregulerer cytokinproduktion via undertrykkelse af AP-1-aktivering. | H 2 O 2 og CSC øge acetylering af histon proteiner, mindske histondeacetylaseaktivitet, differentielt regulerer proinflammatoriske cytokin frigørelse. | Cigaretrøg kan forårsage frigivelse af IL-8 fra HASMC, forstærket af TNF-α, 20% CSE mindre IL-8 release inhibering af eotaxin og RANTES af cigaretrøg. | TS aktiveret HF transskriptionsfaktor, som var forbundet med Hsp70 overekspression og inhibering af NFkB bindende aktivitet og TNF-α release. | Reduceret ATII celleafledte kemokinniveauer kompromis ALVEOLAR reparation, bidrage til cigaretrøg-induceret alveolær skade og emfysem. | Data giver mekanistisk forklaring på, hvorfor rygere er steget luftvejsinfektioner. Undertrykkelse af den medfødte reaktion ledsages af en stigning i IL-8. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: skriftligt informeret samtykke til at gøre denne undersøgelse blev opnået på en lokal klinisk forskningsenhed under IRB godkendelse pr god klinisk praksis. Forarbejdning af blod, er isolation af PBMC'er og andre cellekultur eksperimenter udført under sterile betingelser ved hjælp af mikrobiologisk sterile forsyninger og reagenser.
1. WS-CM Fremstilling
- Generere WS-CM som tidligere beskrevet 12.
- Forbered WS-CM ved at føre røgen fra fire 3R4F referencepunkter cigaretter gennem Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium uden phenolrødt ved hjælp af følgende rygning regime: 35-60-2, puff volumen i ml, puff interval i sekunder, og pust varighed i sek hhv. Hver forberedelse genererer en 20 ml prøve.
- Label rør (r) med dato, tid afsluttet, og cigaret navn og nummer. Opbevar 500 pi alikvoter ved -80 ° C umiddelbart efter rygning er afsluttet.
- Analyser alikvoter af frosne WS-CM At bestemme niveauerne af nikotin, tobak specifikke nitrosaminer, og polycykliske aromatiske kulbrinter som tidligere beskrevet 12.
2. Isolering af PBMC'er
- Saml frisk blod fra raske donorer (som er ikke-forbrugere af tobaksvarer) Isoler PBMC'er fra frisk blod som beskrevet nedenfor under en særskilt godkendelse fra Wake Forest Baptist Health IRB 15.
- Forud for ankomst blodpose, har en 500 ml flaske, saks, isolation buffer og Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) (RT) klar i en biosikkerhed niveau 2 (BSL-2) cellekultur hætte. Isolation buffer skal beskyttes mod lys.
- Hold blodpose hovedet og skære røret lige under, hvor det er fastspændt forlader mindst 3 cm slange.
- Fjern hætten fra 500 ml flaske og hold røret over flaskens åbning. Saml blod pose og vend det at tillade blodet at strømme frit fra posen i than flaske indtil posen er tom. Lad blodet flyde på den indvendige væg af flasken versus lige ned for at undgå at skabe bobler.
- Hæld isolation buffer i flasken ved en 1: 5-forhold af isolation buffer til blod. Cap flasken tæt og vend forsigtigt det, ende-over-ende, 10 gange. Lad flasken i cellekultur hætte inkubere med lysene slukket, i 1 time ved stuetemperatur.
- En let, stråfarvet lag vil bygge op over blodet. Fjern dette lag ved hjælp af en 25 ml serologisk pipette i 50 ml koniske rør. Det indsamlede beløb kan variere fra 50 til 300 ml, afhængigt af emnet, som donorblod.
- Centrifuger rørene ved 200 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer det gennemskinnelige supernatant, forlader mørkt blod-farvet pellet. Pelleten bliver løs, men tyktflydende.
- Der afpipetteres 3 ml isolation buffer i 15 ml koniske rør.
- Til Resuspender pellet, tilsættes 20 ml DPBS for hver 50 ml strågul væske indsamlet i sTEP 2.1.5. Vortex at blande grundigt, og konsolidere opblandede væske fra flere rør. Denne væske indeholder suspenderet blodlegemer.
- Med en overførsel pipette, overføres 5 ml af de suspenderede blodceller på 3 ml isolation buffer i trin 2.1.8. Vip 15 ml konisk rør, der indeholder cellesuspensionen langsomt og forsigtigt for at skabe to adskilte lag. Centrifuger rørene ved 400 xg i 40 minutter ved stuetemperatur med minimal acceleration og uden bremse.
- Brug en overførselspipette for at fjerne den resulterende uklare midterste lag (buffy coat) indeholdende PBMC'er i en 50 ml konisk rør. Undgå at trække andre klare lag nedenunder. Overfør ikke mere end 25 ml i hver 50 ml konisk rør.
- 25 ml koldt buffer (eller mere for at fylde hele den resterende volumen af 50 ml konisk rør) til at vaske cellerne. Centrifugeres cellerne ved 400 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender pellet med 10 ml kører buffer. Dette indeholder PBMC'er. Tæl cellerne og bruge imbart eller sted på is til frysning.
3. nedfrysning og optøning af PBMC'er
- Centrifuger PBMC'erne, der blev opsamlet i trin 2.1.13 i 10 minutter ved 400 x g.
- Fyld frysning beholder med isopropylalkohol pr producentens anvisninger. ADVARSEL: Isopropylalkohol er brandfarligt og akut giftige.
- Pelleten resuspenderes med RPMI 1640-medium (4 ° C) indeholdende 20% føtalt bovint serum (FBS) og 10% dimethylsulfoxid (DMSO). Dette er RPMI 1640 frysemedium. Pelleten resuspenderes med en mængde af frysemedium, som vil resultere i en suspension med ca. 5 x 10 7 celler / ml. Antallet af celler er til rådighed for frysning, vil variere.
- Dispenser 1 ml portioner af cellesuspension i 2 ml kryorør og placere kryorør i indefrysning container. Placer indefrysning beholder med kryorør i en fryser ved -80 ° C til at gemme O / N og derefter fjerne kryorør og overføre til at gemme i enkryogene fryser mellem -150 ° C til -190 ° C.
- Fjern kryorør fra kryogene opbevaring og tø den hurtigt under forsigtig omrøring i et vandbad ved 37 ° C.
- Umiddelbart overføre optøede PBMC'er i kryorør i et 15 ml konisk rør med 10 ml RPMI 1640 komplet medium (4 ° C) indeholdende 10% FBS, 1% Pen / Strep og 1% L-glutamin. Indholdet af den optøede kryorør skal overføres så hurtigt som muligt at opnå levedygtighed 15 maksimal celle.
- Centrifuger PBMC'er ved 400 xg i 10 min.
- Resuspender pellet med 5 ml RPMI 1640 komplet medium og tælle cellerne.
- Mål cellelevedygtighed ved etablerede fremgangsmåder, såsom trypanblåteksklusion metode. Generelt cellelevedygtighed med denne metode er omkring 90-95%. PBMC'erne er nu klar til brug i forsøg.
4. Cell Død Bestemmelse
BEMÆRK: Fortyndinger anført her, er i forbindelse med denne study. Fortyndingerne kan ændres i overensstemmelse hermed.
- Fortynd WS-CM eller nikotin i en 96-brønds plade under anvendelse af RPMI komplet medium til et samlet volumen på 100 pl / brønd, som angivet nedenfor.
- Fortynd WS-CM til følgende koncentrationer: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 og 5 ug / ml equi-nikotin enheder (baseret på nikotinindholdet i WS-CM) 12.
- Fortynd nikotin i RPMI-medium til følgende koncentrationer: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 og 3000 pg / ml. ADVARSEL: Nikotin er akut giftigt og miljøfarligt.
- Tilsæt 100 pi PBMC'er suspenderet i RPMI komplet medium til hver brønd i en koncentration på 1 x 10 6 celler / brønd. Den samlede mængde af celler plus WS-cm eller nikotin vil være 200 pi / brønd.
- Med henblik på denne undersøgelse forberede to sæt plader som ovenfor. Dække pladerne og inkuberes én plade i 24 timer og én plade i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Juster tidspunkter efter behov. Vask cellerne ved stuetemperatur ved centrifugering ved 300 xg i 3 min, opsugning af supernatanten, vortex bunden af pladen med pladen dækkes og endelig resuspendering af celler med 200 pi iskold løbebuffer, og gentag vasketrinnet en gang mere.
- Tilføj 95 pi løbebuffer efterfulgt af 5 pi af 7-aminoactinomycin D (7AAD) til hver brønd til et samlet volumen på 100 pl / brønd. Inkubér pladen i mørke ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Tilsæt 100 pi løbebuffer til klynge rør. Overfør hele mængden af cellesuspension fra hver brønd i pladen til klyngen rør og erhverve prøverne på flowcytometer.
- Bestemme procentdelen af 7AAD-positive celler ved anvendelse af flowcytometri analyse software.
5. EC50 Bestemmelse
- EC 50 værdier af WS-CM og nikotin bestemmes af 7AAD-positiv farvning af PBMC'er.
- The EC50-værdi er defineret som koncentration ved hvilken 50% af cellerne ikke længere var levedygtige i en 24 timers assay, og værdierne er udtrykt som ug equi-nikotin enheder / ml.
- Med henblik på denne undersøgelse blev EC 50 værdier bestemt til at være 1,56 ug / ml og 1.650 pg / ml for WS-CM og nikotin hhv.
6. Secernerede Cytokiner
BEMÆRK: Fortyndinger anført her, er i forbindelse med denne undersøgelse. Fortyndingerne kan justeres i overensstemmelse hermed.
- Fortynd WS-CM i en 96-brønds plade under anvendelse af RPMI komplet medium til et samlet volumen på 100 pl / brønd i en koncentration på 0,3, 1,56, 3 og 5 ug / ml equi-nikotin enheder.
- Fortynd nikotin til følgende koncentrationer: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 og 3000 pg / mL. ADVARSEL: Nikotin er akut giftigt og miljøfarligt.
- Tilsæt 100 pi PBMC'er suspenderet i RPMI komplet medium til hver brønd i en koncentration på 1 x 10 6 celler / brønd.Den samlede mængde af celler plus WS-cm eller nikotin vil være 200 pi / brønd.
- Dæk pladen og inkuber i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask cellerne ved stuetemperatur ved centrifugering ved 300 xg i 3 min, opsugning af supernatanten, vortex bunden af pladen med pladen dækkes og endelig suspension celler med 200 pi iskold løbebuffer og gentage vasketrinet en gang mere.
- Tilsæt 200 pi RPMI komplet medium, og gentag vasketrinnet en gang mere.
- Tilsæt 200 pi af 10 ug / ml LPS medium til hver brønd.
- Dæk pladen og inkuberes i 4 timer, 24 timer, 48 timer eller 72 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Juster inkubationstider nødvendigt.
- Centrifugeres pladen ved 300 x g i 3 min.
- Tag 175 pi supernatant fra hver brønd og opbevares i en fryser ved -80 ° C til at udføre analyserne i trin 7 og 8.
7. cytometrisk Bead Array Assay
<ol>8. IL-8 ELISA
- Optø cellesupernatanterne fra trin 6.10 og anvendelse i IL-8 ELISA. Udfør ELISA-assayet i henhold til fabrikantens anvisninger.
9. Intracellulært Farvning og flowcytometri
BEMÆRK: Fortyndinger anført her, er i forbindelse med denne undersøgelse. Fortyndingerne kan justeres i overensstemmelse hermed.
- Fortynd WS-CM i en 96-brønds plade under anvendelse af RPMI komplet medium til et samlet volumen på 100 pl / brønd i en koncentration på 0,3, 1,56, 3 og 5 ug / ml equi-nikotin enheder.
- I den samme plade, fortyndes nikotin til følgende koncentrationer: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 og 4000 pg / ml. ADVARSEL: Nikotin er akut toksisk og miljømæssigt HazarDous.
- Tilsæt 100 pi PBMC'er suspenderet i RPMI komplet medium ved en koncentration på 1 x 10 6 celler / brønd. Den samlede mængde af celler plus WS-cm eller nikotin vil være 200 pi / brønd.
- Dæk pladen og inkuberes i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask cellerne ved stuetemperatur ved centrifugering ved 300 x g i 3 minutter, opsugning af supernatanten, vortex bunden af pladen med pladen dækkes og endelig resuspendering af celler med 200 pi iskold løbebuffer, og gentag vasketrinnet en gang mere.
- Tilsæt 200 pi RPMI komplet medium til pladen, og gentag vasketrinnet en gang mere.
- Forbered arbejder koncentrationer på 2 pl / ml GolgiPlug og 10 ug / ml LPS anvendelse af RPMI komplet medium og tilsættes 200 pi til hver brønd.
- Inkubér pladen i 6 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Ved afslutningen af trin 9.8, vaske cellerne med rindende puffer (4 ° C) og centrifugering ved 300xg i 3 minutter ved 4 ° C.
- Tilsæt 100 pi Cytofix til hver brønd og inkuberes i 20 minutter ved 4 ° C.
- Vask cellerne 3 gange som beskrevet i trin 9.9 med 1x Permwash (4 ° C) ved 300 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
- Tilføj 45 pi 1x Cytoperm til hver brønd efterfulgt af 5 pi af hver af en af de følgende antistoffer til hver brønd: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Inkuber ved 4 ° C i 30 minutter.
- Vask cellerne to gange som beskrevet i trin 9.9 med 1x Permwash (4 ° C) og én gang med rindende puffer (4 ° C) ved 300 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender cellerne med 200 pi 2% paraformaldehyd (4 ° C). Overfør celler i 12 × 75 mm rør, og analysere prøverne på flowcytometer. ADVARSEL: Paraformaldehyd er ætsende, akut giftigt og sundhedsskadeligt.
10. K562 Killing Assay
BEMÆRK: K562-celler skal dyrkesi kultur ved 37 ° C og 5% CO 2 med RPMI komplet medium, indtil de når 80% konfluens før analysen.
- Forbered en 5 mM carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) stamopløsning ved at tilsætte 18 pi DMSO til hætteglasset.
- Fortynd WS-CM eller nikotin i en 96-brønds plade under anvendelse af RPMI komplet medium til et samlet volumen på 100 pl / brønd for at opnå de ønskede equi-nikotin enheder eller nikotin koncentrationer for hver brønd. ADVARSEL: Nikotin er akut giftigt og miljøfarligt.
- Tilsæt 100 pi af PBMC'er i RPMI komplet medium ved en koncentration på 1,5 x 10 6 celler / brønd. Den samlede mængde af celler med WS-CM eller nikotin vil være 200 pi / brønd.
- Dæk pladen og inkuberes i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask K562-celler ved tilsætning af 10 ml DPBS og centrifuger ved 400 xg i 8 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender cellerne med 10 ml DPBS og tæller K562-celler.
- Forbered CFSE working opløsning ved tilsætning 1 pi CFSE stamopløsning til 1 ml DPBS.
- Tilsæt 1 ml af CFSE brugsopløsning til 1 ml K562 cellesuspensionen indeholdende 1 - 2 x 10 7 celler. Vortex og inkuber netop i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Straks tilføje 200 pi FBS. Vortex og inkuber netop i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 10 ml RPMI komplet medium og centrifugeres røret ved 400 xg i 8 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern RPMI supernatanten og bryde pellet og resuspender cellerne med 10 ml RPMI komplet medium og tælle CFSE-mærkede K562-celler.
- Vask PBMC'erne ved centrifugering af pladen ved 300 x g i 3 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten ved dekantering af væsken. Sæt dækslet og vortex bunden af pladen. Tilsæt 200 pi RPMI komplet medium og gentage vasketrinet en gang mere.
- Tilføj CFSE-mærkede K562-celler i et forhold på 01:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMC'er) til hver prøvebrønd PBMC plade og yderligere incubate i 5 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask cellen mix ved centrifugering ved 300 xg i 3 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten ved at kassere væsken. Placer dækslet og vortex bunden af pladen.
- Tilsæt 200 pi løbebuffer og gentag vasketrinnet beskrevet i trin 10.14 en gang mere.
- Tilføj 95 pi løbebuffer efterfulgt af 5 pi af 7AAD til hver brønd til et samlet volumen på 100 pl / brønd. Inkubér pladen i mørke ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Tilsæt 100 pi af rindende buffer til hver brønd og overføre hele volumen af cellesuspension fra hver brønd i pladen til klyngen rør og erhverve prøverne på flowcytometer.
- Bestemme procentdelen af 7AAD-positive og CFSE-positive celler ved anvendelse af flowcytometri analyse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien (fire donorprøver). Den T-test mellem behandlede og ubehandlede kontrolprøver blev udført under anvendelse Excel software samt t-test sammenligninger for alle behandlinger med deres tilsvarende kontroller. Den statistiske signifikans blev angivet med: *, p <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005.
For at måle effekten af eksponering for WS-CM og nikotin, blev PBMC'er behandlet med forskellige koncentrationer af WS-CM og nikotin i 3 timer eller 24 timer. Celledød blev målt ved robuste og pålidelige 7AAD farvning metode, som 7AAD interkalerer i dobbeltstrengede nukleinsyrer og kan penetrere cellemembraner af døende eller døde celler 16. En dosis-afhængig stigning i celledød blev observeret med WS-CM på 24 timer, med en nær 80% celledød detekteret ved 4 ug / ml equi-nikotin enheder (figur 1A). En tilsvarende grad af celledød varbemærkes kun 3.000 pg / ml nikotin (figur 1B). Da vi udsatte PBMC'er i 3 timer med WS-CM og nikotin for at vurdere deres virkning på cytokininduktion og evne til at dræbe målceller, var det nødvendigt at fastslå, om WS-CM medfører væsentlig cytotoksicitet efter 3 timer behandling. PBMC'er behandlet med 5 ug / ml equi-nikotin enheder af WS-CM ikke opleve væsentlig toksicitet (<5%, figur 1A). Behandling med nikotin i 3 timer forårsagede målelig (8%) celledød kun 2.000 ug / ml (figur 1b). Således har eksponering for WS-CM eller nikotin i de angivne doser og behandlingsperioder ikke forårsage betydelig cytotoksicitet under de eksperimentelle betingelser.
Til måling af immunmodulerende virkninger, blev PBMC'er stimuleret med LPS i forskellige tidsperioder, og de udskilte cytokiner blev målt ved CBA assay. For at optimere LPS-stimulering tid, vi udsat PBMC'er til LPS-stimulering i 4 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer, og udskilles cytokiner blev målt. For eksempel LPS-stimulering i 24 timer gav maksimal sekretion af cytokinerne IL-6 og IL-8 (figur 2), og udvidede tidsperioder resulterede ikke i yderligere stigninger (IL-6) eller aftager (IL-8) i cytokin sekretion. Lignende resultater blev opnået med andre secernerede cytokiner, såsom IL-10, IL-1β og TNF-α (data ikke vist).
De pilot tid-kursus eksperimenter foreslog, at maksimal produktion af cytokiner i reaktioner på TLR-4 stimulering med LPS sker ved 24 timer, og derfor blev der udskilte cytokiner målt til 24 timer i alle efterfølgende eksperimenter. Behandling med WS-CM og nikotin, efterfulgt af stimulering af TLR-4-receptor med LPS, resulterede i en dosisafhængig reduktion af udskilte cytokiner (figur 3). Behandling med WS-CM resulterede i store fald i IFN-γ (figur 3A), TNF (figur 3B), IL-10 (figur 3C </ Strong>) og IL-6 (figur 3D) ved lave equi-nikotin enheder (1,56 ug / ml). Undertrykkelse af cytokiner var også tydeligt med nikotin. Men undertrykkelse af cytokiner med nikotin forekom ved betydeligt højere doser, og graden af undertrykkelse varierede mellem de enkelte cytokiner. For eksempel IFN-γ syntes at være signifikant undertrykt med nikotin ved 50 ug / ml, mens IL-6 blev undertrykt ved den højeste koncentration (4 mg / ml) testes (Figurie 3D). Dernæst målte vi IL-8-niveauer i de samme prøver under anvendelse af et ELISA-assay. IL-8 sekretion reelt undertrykt i WS-CM-eksponerede PBMC'er; mens nikotin er undertrykkende virkninger var signifikante ved 2 mg / ml (figur 4).
Niveauerne af intracellulære cytokiner blev kvantificeret i WS-CM- og nikotin-behandlede celler efter stimulering med LPS. Tidligere vi stimulerede PBMC'er i 3 dage og tilføjede Golgiplug under den sidste 6 timer inkubation til at måleintracellulære cytokiner 14. Vi har nu væsentligt reduceret inkubationstiden ved at kombinere stimulering med LPS og Golgi stik til i alt 6 timer og måles intracellulære cytokin-positive celler (figur 5). Figur 5 illustrerer en dosisafhængig procent reduktion i IFN-γ-positive celler ( figur 5A), TNF-α-positive celler (figur 5B) i både nicotine- og WS-CM- udsat PBMC'er, medens en dosisafhængig procent reduktion i MIP-1α-positive celler (figur 5C) blev observeret i WS-CM -exposed PBMC'er. I dette assay observerede vi et fald i antallet af intracellulære cytokin-positive celler efter udsættelse for WS-CM ved lavere equi-nikotin enheder (1,56 ug / ml). Både secernerede cytokin og intracellulære cytokinassays viste lignende resultater i form af IFN-γ niveauer eller IFN-γ-positive celler.
Som en funktionel foranstaltning evne WS-CM- og nicotine-behandlede PBMC'er at dræbe target K562-celler blev bestemt. 6A afbilder repræsentativt flowcytometriske rådata fra 7AAD-positiv farvning af mål (CFSE-mærket K562) celledrab ved kontrol, WS-CM-eksponerede, og nikotin-behandlede PBMC'er. Tal i boksen repræsenterer procent 7AAD-positive CFSE-mærkede K562-celler. Udsættelse for 1,56 ug / ml WS-CM reducerede signifikant drab evne effektorcellerne i PBMC'er sammenlignet med kontrollen og de lavere doser. Nikotin behandling ved lave og høje doser ikke interferere med celledrab. Figur 6B viser et dosisafhængigt fald i procent K562 celledræbende fra flere donorer i et enkelt eksperiment.
Figur 1. Celledød af PBMC'er efter eksponering for stigende koncentrationer af equi-nikotin enheder af WS-CM (ug / ml) og nikotin (ug / ml). (A) og med nikotin i 3 timer og 24 timer (B). Celledød blev målt ved 7AAD farvning. Hvert punkt repræsenterer middelværdien ± SD fejllinjer fire donorer fra et repræsentativt eksperiment. Den statistiske signifikans er angivet ved: * P <0,05; ** P <0,005, *** p <0,0005.
Figur 2. Sekretion af IL-6 og IL-8 ved PBMC'er stimuleret med LPS på forskellige tidspunkter. PBMC'er blev stimuleret med LPS i 4 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer. Niveauer af IL-6 og IL-8 cytokiner i cellekultursupernatanterne blev bestemt under anvendelse af humane inflammatoriske cytokin Kit (CBA kit) og flowcytometri. Disse data repræsenterer middelværdien ± SD fejllinjer fra en af de to uafhængige eksperimenter under anvendelse af PBMC'er fra tre forskellige donorer. Den statistiske significance angives med: * P <0,05; ** P <0,005.
Figur 3. Reduktion af cytokinsekretion af PBMC'er blev behandlet med stigende koncentrationer af equi-nikotin enheder af WS-CM (ug / ml) og nikotin (pg / ml) efter LPS-stimulering. PBMC'er blev udsat for forskellige koncentrationer af WS-CM og nikotin i 3 timer og stimuleret med LPS i 24 timer. Niveauer af IFN-γ (A) blev TNF (B), IL-10 (C), og IL-6 (d) cytokiner i cellekultursupernatanterne bestemt under anvendelse af en Th1 / Th2 CBA assay og flowcytometri. Disse data repræsenterer middelværdien ± SD error stænger fra en af de tre uafhængige eksperimenter under anvendelse af PBMC'er fra fire forskellige donorer. Den statistiske signifikans er angivet ved: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Højere con trationer af WS-CM var også statistisk signifikant med *** P <0,0005.
Figur 4. Dæmpning af IL-8-sekretion af PBMC'er behandlet med stigende koncentrationer af equi-nikotin enheder af WS-CM (ug / ml) og nikotin (pg / ml) efter LPS-stimulering. PBMC'er blev udsat for WS-CM og nikotin, stimuleret med LPS i 24 timer, og secerneres IL-8 blev målt ved ELISA. Disse data repræsenterer middelværdien ± SD fejllinjer fra en af de tre uafhængige eksperimenter under anvendelse af PBMC'er fra fire forskellige donorer. Den statistiske signifikans er angivet ved: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Højere koncentrationer af WS-CM var også statistisk signifikant med *** P <0,0005.
.jpg "/>
Figur 5. Reduktion af intracellulære cytokin-positive celler i PBMC'er behandlet med stigende koncentrationer af equi-nikotin enheder af WS-CM (ug / ml) og nikotin (ug / ml). PBMC'er blev udsat for varierende koncentrationer af WS-CM og nikotin i 3 timer og stimuleret med LPS og Golgiplug i 6 timer. Køretøjet kontrol for WS-CM og nikotin var RPMI komplet medium. Intracellulær IFN-γ-positiv (A), TNF-α-positive (B), og MIP-1α-positive (C) celler blev kvantificeret ved flowcytometri. Disse data repræsenterer middelværdien ± SD fejllinjer fra en af de fire uafhængige eksperimenter under anvendelse af PBMC'er fra fire forskellige donorer. Den statistiske signifikans er angivet ved: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Højere koncentrationer af WS-CM var også statistisk signifikant med *** P <0,0005.
Figur 6. Reduktion af PBMC'er target dræbe evne med eksponering for stigende koncentrationer af equi-nikotin enheder af WS-CM (ug / ml) og nikotin (ug / ml). PBMC'er blev behandlet med angivne koncentrationer af WS-CM og nikotin for 3 time og CFSE-mærkede K562-celler blev derefter tilsat som målceller og inkuberet i yderligere 5 timer. Celler blev farvet med 7AAD og flowcytometri blev brugt til at måle dræbe evne. Figur 6A viser den repræsentative flowcytometri resultater med procent drab vist i låge bokse. Pil angiver reduceret procent drab i 1,56 ug / ml udsat WS-CM. Figur 6B viser repræsentative gennemsnit ± SD fejllinjer fra fire uafhængige forsøg med PBMC'er fra fire forskellige donorer. Den statistiske signifikans er angivet ved: ** P <0,005; *** P <0,0005. Højere koncentrationer af WS-CM var også statistisk signifikant with *** P <0,0005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi og andre har tidligere demonstreret, at behandling af PBMC'er med TPPS undertrykker flere reaktioner, herunder ekspression og sekretion af cytokiner og funktionelle foranstaltninger såsom målcelle dræbe 14. De eksperimentelle metoder beskrevet i det tidligere arbejde kræver længere inkubationsperioder og var beskedne i størrelse 14. I betragtning af de potentielle anvendelser af denne attraktive ex vivo model for grundlæggende og anvendt forskning, undersøgte vi, om nogen af de assay-parametre i disse multi-trins biologiske assays kan optimeres. Her præsenterer vi forenklede metoder til at måle TLR-medierede immunreaktioner ved hjælp af en TPP-behandlet ex vivo PBMC model.
Isolering af levedygtige PBMC'er er en afgørende forudsætning for disse ex vivo assays. I betragtning af den individuelle variation og fysiologiske status i potentielle donorer, er det ideelt at opnå PBMC'er, der er lydhør. Med henblik på denne undersøgelse har vi isolered PBMC'er fra generelt raske voksne forsøgspersoner ved hjælp af en tidligere publiceret metode 15. Endvidere i denne undersøgelse for at minimere variabilitet blandt donorerne, vi udelukkede dem med allergi, infektioner, eller som tog nogen recepter eller over skranken narkotika, såsom aspirin. Derudover isolering af PBMC'er fra frisk indsamlede blod er ønskelig, da den sikrer optimal levedygtighed og funktionalitet af cellerne i de efterfølgende eksperimenter.
Tidligere fremgangsmåder anvendte stimulering med TLR agonister for 67-72 timer for at måle intracellulære cytokiner og secernerede cytokiner 14. En tidsforløbet for cytokinsekretion i TLR-stimulerede celler (under kontrolbetingelser uden WS-CM eller nikotin) foreslog at maksimal sekretion forekom ved 24 timer. Endvidere har vi kombineret inkubation med TLR agonister og Golgiplug og reducerede inkubationstid til i alt 6 timer til måling af intracellulære cytokiner. Mens dette kræves en særskilt assay til at målecytokin-positive celler, dataene er mere robuste i forhold til den tidligere metode 14. I overensstemmelse med tidligere resultater, WS-CM kraftigt undertrykt induktion af intracellulære og secernerede cytokiner. Således er disse modifikationer førte til væsentligt reduceret assaytider og gav meget lignende resultater som dem, der er beskrevet i litteraturen. Mens vi har anvendt flowcytometri og ELISA-metoder for at vurdere cytokinniveauer, kan andre teknikker, såsom kvantitativ realtids polymerasekædereaktion (RT-qPCR) også anvendes som en supplerende teknik.
Historisk målrette celledrab ved effektor PBMC'er anvendte radiomærkede metoder (fx 51 Cr-release assay). Den i denne rapport metode eliminerer brugen af radioaktivitet og beskæftiger loading celler med et fluorescerende farvestof, hvis tilstedeværelse kunne overvåges ved flowcytometri. En anden fordel ved den beskrevne fremgangsmåde heri er, at den er relativt hurtig og kan være adaptéd high-throughput assays. Da inkubationstiden for mål- og effektorceller er 5 timer, kan dette assay afsluttes i 8 timer. Dette kontraster med andre offentliggjorte metoder, som er mere involveret, da de kræver isolering af undertyper af PBMC'er og aktivering / stimulering over en periode på flere dage, eller analyse af NK-celle og K562 celle konjugater til overvågning cytotoksicitet 17,18. En anden fordel ved den nuværende metode er, at den anvender kryopræserverede PBMC'er direkte som effektorceller, som giver større fleksibilitet.
Sammenfattende vi beskrevet adskillige assays for at bestemme virkningen af immunresponset TLR-medieret brændbare TPP-behandlede PBMC'er, som let kan anvendes til at teste forskellige forbindelser. Brugen af kryopræserverede komponenter giver mulighed for stor fleksibilitet, og sammen med etablerede teknikker som flowcytometri, CBA assays og ELISA-prøver, robust og ensartede resultater kunne opnås hurtigt på tværs af forskellige laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde er finansieret af RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) under en samarbejdsaftale forskning med Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad er en fuld tid medarbejder i RJRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
