Evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones

Resumen

Describimos dos métodos para la visualización y cuantificación de la arborización dendrítica en el hipocampo de modelos de ratón: imágenes en tiempo real y de profundidad de campo extendida. Mientras que el primer método permite un sofisticado trazado topográfico y la cuantificación de la extensión de la ramificación, el segundo permite una visualización rápida del árbol dendrítico.

Resumen

Se ha demostrado que la arborización dendrítica es un marcador fiable para el examen de la integridad estructural y funcional de las neuronas. De hecho, la complejidad y el alcance de la arborización dendrítica se correlacionan bien con la plasticidad sináptica en estas células. Se necesita un método fiable para la evaluación de la arborización dendrítica para caracterizar los efectos deletéreos de los trastornos neurológicos sobre estas estructuras y determinar los efectos de las intervenciones terapéuticas. Sin embargo, la cuantificación de estas estructuras ha demostrado ser una tarea formidable dada su naturaleza compleja y dinámica. Afortunadamente, las técnicas de imagen sofisticadas se pueden combinar con los métodos de tinción convencionales para evaluar el estado de la arborización dendrítica, proporcionando un medio de evaluación más confiable y rápido. A continuación se muestra un ejemplo de cómo estas técnicas de imagen se combinaron con métodos de tinción para caracterizar la arborización dendrítica en ratones de tipo salvaje. Estos métodos de imagen complementarios se pueden utilizar para evaluar cualitativa y cuantitativamente la arborización dendrítica que abarca un área bastante amplia dentro de la región del hipocampo.

Introducción

Alteraciones dinámicas en el número y la estructura de las sinapsis son características de desarrollo, el envejecimiento, y numerosos trastornos neurodegenerativos ^1-3. La capacidad de las neuronas para recibir e integrar la información sináptica depende de la morfología dendrítica y alteraciones dinámicas en las conexiones sinápticas. De hecho, existe una correlación positiva entre la espina dendrítica y el número de sinapsis, que tanto el impacto de la función cognitiva ^4. Por lo tanto, no es sorprendente que decrementos en número de la espina dendrítica se han asociado con la disfunción cognitiva en un número de trastornos neurológicos ^5....

Protocolo

NOTA: Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas éticas aprobadas por el Comité de Investigación Animal de la Sistema de Salud de Asuntos de Veteranos de Palo Alto.

1. Golgi-Cox tinción

1. La extracción de cerebro y tinción
   1. En la primera jornada, profundamente anestesiar a los ratones con 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina antes de la eutanasia a través desangrado.
   2. Retire con cuidado la bóveda craneal y diseccionar el cerebro.
      1. Primero quitar la piel en la parte superior del cráneo, la colocación de una tijera curvada en la parte superior del cerebelo y suavemente cortar ....

Resultados

La extensión de la arborización derivada de células granulares dentadas existentes y recién nacidos se analizó en ratones de tipo salvaje utilizando Golgi-Cox o tinción DCX (Figura 1). Se encontraron segmentos dendríticos de células DCX-positivas que ser 13 a 36 micras de largo. La distribución normal de la longitud dendrítica se probó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; las figuras 4 y 5).

Discusión

Aquí, dos métodos se describieron para cuantificar el grado de arborización dendrítica en las neuronas maduras y recién nacidos utilizando métodos de tinción convencionales en conjunción con RTI y EDFI. La adquisición de imágenes de alta resolución de las neuronas proporciona un método extremadamente útil para probar los efectos perjudiciales de los trastornos neurodegenerativos y, a su vez, proporciona un medio para evaluar las estrategias terapéuticas que se dirigen a las neuronas del hipocampo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de tinción de Golgi-cox modificada	Tienda Weill Cornell Medical College	NA	en 4° C hasta el uso
de 1x Solución de desarrollo (stock 10x)	Tienda Weill Cornell Medical College	NA	a 4° C hasta usar
30% de sacarosa,	Sigma	CAS # 57-50-1	hacer fresco   en ddH2O
0.3% Gelatina	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Soluciones de etanol graduadas (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xileno	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medio	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) blanco	Microscopía Electrónica Sciences	71869-10
NA Cubreobjetos 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Anticuerpo	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	Número CAS 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	Número CAS 77-86-1	Na
Microscopio ABC Lite	Vector	PK4000	NA
	Cámara digital Nikon	Eclipse 80i
Cámara Nikon		DS-Ri1
de 12 bits	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Sistema Neurolucida	MBF Bioscience	V.10
Editor de Composición de Imágenes Microsoft		1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00