Introduction
动态改变在突触的数量和结构的发展，老化的标志，以及众多的神经变性疾病1-3。神经元的接收和整合突触信息的能力取决于树枝状形态和动态的改变在突触连接。事实上，一个正相关树突棘和突触数目，这既影响认知功能4之间存在。因此，这并不奇怪，在树突棘数目递减已与认知功能障碍相关的一些神经障碍5-7，促使在树突棘量化了极大的兴趣。然而，脊柱密度的量化仍然是一个耗时且繁琐的任务失败，以产生与通过该树突树突触的地形和分布的有用信息。幸运的是，染色方法（ 如高尔基-考克斯和doublecortin（DCX））结合与先进的成像技术可以被用来克服目前的障碍，并以可靠和迅速的方式产生树突分支的高清晰度图像。而高尔基-考克斯染色法可以部署到评估所有神经元树突8树枝状的状态，DCX可以部署鉴于神经发生在这两个标签新生神经元特别是在齿状回和脑室下区9，一个重要的考虑因素这些地区的整个生命周期10,11。
染色后，两个成像方法被部署，以评估树突特性：ⅰ）实时成像（RTI）和场成像（EDFI）的ⅱ）延伸的深度。的RTI技术提供的平均来跟踪和量化树枝状的长度和顺序沿个体树突段和分支。因此，它使一个估算的总面积和每个树突树占据的体积。多个Specifically，在该RTI方法的用户连续地识别段和迭代地重新聚焦为神经元的跟踪软件收集在x，y和z的树枝状结构的坐标和重构树枝状结构在三维的轨迹。相比之下，EDFI方法提供了一种相当简单的，快速的用于通过产生合成图像，从而提供对整个z轴信息评估相当厚的组织标本树突密度的手段。这样做时，用户记录的高清晰度视频文件贯穿部的厚度，然后使用软件来搜索视频帧以识别点，其中一个像素是完全聚焦。随后，将聚焦像素被合并和集成到一个高分辨率，复合2D图像。这种复合图象包含分别在焦，不论其在z轴位置的所有像素。这些2D图像的定性和定量分析随后可以用来确定密度的树枝状分枝中的每个字段。
最后，我们提出了一个全景方法用于产生极高分辨率的图像进行分析和树突的评估在感兴趣的整个区域。这种技术可以被部署到克服缺乏接入的到非常高的分辨率和昂贵的数码相机。使用这种方法，因此一个捕获在沿x轴和y轴的不同位置的序列的图像，然后自动缝合在一起使用免费软件（ 例如 ，图片复合编者）。值得注意的是，可以在一个相当宽的区域被用于树突分支的定性和定量评估此方法。
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Protocol
注：实验按照批准委员会在动物研究在退伍军人事务帕洛阿尔托医疗保健系统的道德标准进行的。
1.高尔基 - 考克斯染色
- 脑提取和染色
- 第1天，通过放血安乐死前，深深地麻醉小鼠100毫克/千克氯胺酮和10毫克/公斤甲苯噻嗪。
- 小心地取出颅骨，并剖析了大脑。
- 首先去除皮肤上的头骨的顶部，放置一个弯曲剪刀对小脑的顶部并轻轻切穿平行颅盖到中央沟与剪刀的尖端指向向外，朝着朝向嗅球的方向。两侧重复此过程。
- 用手术pincet解除颅骨，同时把它朝嗅球，并打破它。然后，翻转头骨倒过来，用一个接通过视神经切神经和放松大脑。最后，使用挑到大脑从脊髓在枕骨大孔的水平分开。
- 立即浸入脑在15毫升市售，未稀释的高尔基体考克斯溶液。存储在大脑中加盖，将20ml玻璃瓶高尔基溶液在室温下在黑暗中。
- 第2天，缓缓倾出溶液，并用15毫升新鲜高尔基考克斯溶液替换。回顾一下含有大脑的瓶子，并留下静置在黑暗中另一个9天。
- 切片和嵌入
- 11日当天，将大脑中30％的蔗糖溶液，准备在DDH 2 O的脱水。 12小时后改变与新配制的30％的蔗糖溶液。孵育3天30％蔗糖溶液的大脑在4℃。
- 在第14天，填的vibratome的贮存用30％的蔗糖溶液，直到刀片被覆盖。设置速度1米米/秒的0.95毫米幅度。
- 吸干大脑用Kimwipe以除去过量的水分并用剃刀刀片切冠除去小脑。
- 使用强力胶牢固地装入整个大脑上的vibratome平台，并允许它为2-4分钟，进行设置。插入与附着脑平台进入储和叶片调整到大脑的顶部。
- 使用的vibratome，切片脑内成150微米厚的切片在室温下，记忆每第三大脑后改变刀片。
- 拿起从储存的部分用小刷子尖和浸入成含有0.3％明胶在双蒸2 O制成的陪替氏培养皿而部分残留在培养皿中，添加0.5毫升0.3％明胶的每个幻灯片上，并用刷子来传播和涂覆的Superfrost +幻灯片。
- 轻轻拿起浸渍部分从培养皿并将其放置到胶凝幻灯片。通过定向脑切片触摸它们只在其两侧，而不是顶部。
- 经过约10分钟，涂上30％蔗糖的章节之前组织完全干燥。然后空气干燥，于黑暗处准备的滑动的滑动架3天。
- 稀释市售10倍显影液至1x使用双蒸2 O.浸泡在显影液7-10分钟的幻灯片。冲洗玻片3次，双蒸2 O.
- 脱水
- 用蒸馏水双蒸2 O制备的20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％和95％的乙醇溶液
- 浸泡的幻灯片中越来越高的乙醇溶液，每次10分钟。
- 浸泡的幻灯片在100％的乙醇溶液，每次10分钟，3次。
- 浸泡的幻灯片在100％二甲苯中连续3次，每次5分钟，保持部分在最终溶液中，直到它们盖滑落。
- 将DPX（二正丁酯，邻苯二甲酸酯在二甲苯）的安装介质（AB的大方量出1-1.5毫升）用塑料吸管转移每张幻灯片上。小心地将盖玻片，以避免气泡。
- 空气干燥盖滑脑切片水平3天。
2. Doublecortin染色
- 深深麻醉（见步骤1.1.1）的动物。
- 用新鲜配制的4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液12发进行心脏灌注。
- 提取大脑（见1.1.2），并存储于45ml的4％多聚甲醛在4℃下过夜上的摇床上。
- 大脑转移到30％蔗糖溶液，并等待完整脱水48小时，在4℃。从蔗糖取出大脑，并直接将它们放在置于干冰上的铜块。
- 填具有最佳切割温度（OCT）化合物的块，并使用嗅球作为地标标记的脑的定向。
- 使用低温恒温器，切割70微米厚的切片在-20ºC，并把它们在冷冻保护剂溶液（25％乙二醇，25％的甘油，在0.05M磷酸钠缓冲液，pH 7.4）中，并保持在-20℃直到使用。
- 使50％的冷冻保护剂和50％的甲醇的溶液。向此溶液中添加0.5％过氧化氢（体积/体积）。孵育浮动切片30分钟，在室温下进行。
- 在37ºC的TBS（Tris缓冲盐水）30-40分钟暖段通过将它们放置在一个组织学烘箱。
- 孵育0.3％的Triton和3％正常马血清的章节之前，免疫染色45分钟，在室温下进行。孵育4ºC的部分一夜之间在DCX抗体稀释1 3毫升的解决方案：500 TBS与0.3％的Triton和1％的正常马血清。
- 翌日洗部分连续3次的TBS（各10分钟）。
- 孵育用生物素化的马抗山羊部分（1：200在TBS中）为2小时，在室温下进行。在TBS中洗部分连续3次（每次10分钟）。
- 孵育吨下摆与ABC精简版（1：1,000）1.5小时，在室温下进行。
- 加入5微升30％的H 2 O 2至10毫克DAB的溶解于15ml的1M的Tris-HCl（pH值7.6）的（3,3“二氨基联苯胺）溶液1片剂。在该溶液中5分钟，立即孵育部分。
- 洗涤他们用冰冷的TBS三次随后在TBS中洗涤一次，在室温下使反应终止。
- 脱水用一系列乙醇溶液（50％，60％，70％，80％，90％，95％，100％，每5分钟），明确在二甲苯的部分，然后用覆盖的DPX滑移如在步骤1.3。
3.可视化
- 继部分完全干燥，去除用锋利的刀片幻灯片上面多余的DPX，并把他们放在显微镜扫描阶段。该系统由装备有扫描阶段，控制杆，和一个彩色12位相机的显微镜的。
- 启动该程序。打开一个新的数据文件。
- 地方通过点击鼠标指针在任何地方在屏幕上的参考点。这将激活所有从程序窗口的工具面板的图标。
- 点击工具栏上的“摇杆自由”图标，然后用操纵杆来定位海马齿状回的第一部分。
- 在程序窗口的“工具”选项卡，选中“序列部门经理”。点击在窗口的左下角的“新科”图标。这将打开“串行科设置”窗口。
- 选择的串行部分设置窗口，然后输入包含海马区切片的总数。选择评估间隔。输入部分切割厚度（70微米的DCX和150微米的高尔基染色切片）。
- 首先点击工具栏中的“写意轮廓图”图标，跟踪齿状回区。概述齿状颗粒细胞层。</ li>
- 从“放大”菜单中选择“100X”。添加一滴浸油的部分和切换目标100X。在找到这一目标的齿状颗粒细胞体和树突。
- 专注于一个选定的神经元，然后单击工具栏上的“神经元跟踪”图标。跟踪齿状颗粒细胞体的周长。当跟踪完成后，单击鼠标右键，选择“完成胞体”。
- 开始的x，y和z方向手动跟踪的树突和使用操纵杆和z马达旋钮按照每个分支。在分叉或三叉节点，选择在右键下拉菜单中选择相应的选项。跟踪每个源于这些节点的分支。在每个分支末端单击鼠标右键，从下拉菜单中选择“结束”。
- 在软件窗口中使用箭头键图标随机选择另一齿状颗粒细胞，并按照同样的程序DESCRIBED步骤3.9-3.10。保存整个跟踪。
- 启动神经跟踪软件。
- 从实验组的第一鼠标打开第一NRX数据文件。追加实验组的第二只老鼠的NRX文件。继续下去，直到该组所有的NRX文件被追加。
- 在分析选项卡，选择“范在-图”。这将打开风扇在分析窗口。查马克“树突”，然后单击显示，描绘树突的长度和分支模式这组小鼠（ 图1）。
4. EDFI
注意：此方法使用户通过每个场的z轴快速记录大量图像并生成包含所有的聚焦像素整个z轴2D图像。其结果将是一个包含从收集到的图像都聚焦像素的合成图像。
- 显微镜连接到数字凸轮时代。首先将部分在连接到显微镜扫描的阶段，然后切换到10倍的目标。移动台到感兴趣的区域。
- 启动视频捕捉程序。
- 按下录制按钮。只要记录按钮被按下时，使用宏对焦旋钮从顶部移动到段的底部，总共4秒。保存生成的视频文件。
- 使用ImageJ的免费软件来打开文件并将其保存在非压缩文件格式的AVI视频文件转换成压缩格式。
- 开始图像分析程序并打开该AVI文件。进入“进程”菜单中，单击“扩展景深”。选择相应的视频文件。在“输出”选项中，选择“生成复合的最佳聚焦图像”。
- 在“焦点分析”选项中，选择“归照明”和“最大局部对比度”选项。然后，选择“酶Cre吃了“。所产生的图像代表所有的聚焦像素在整个Z轴（ 图2）。
- 保存生成的图像。
5.生成极其高清晰度图片
注：此方法允许用户自动生成低倍率和高倍率高分辨率图像非常高分辨率的图像在一个自动化的方式。
- 第一放置部分上连接到所述显微镜的扫描阶段。在显微镜被连接到一台数码相机。移动台到感兴趣的区域。
- 启动图像采集程序。
- 使用10X物镜和取得并保存的高分辨率（4076 X 3116）图片来自感兴趣的区域并确保至少有10％的重叠。
- 运行图像编辑复合缝合图像。
- 转到文件菜单，然后单击“新建全景”。选择其中的图像是ST的文件夹或运算。选择属于同一区域，然后按“确定”按钮图像。
- 按“导出到磁盘”按钮，保存图像。此图像表示感兴趣，可以用来分析和/或演示（ 图3）的区域的超高分辨率图像。
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Representative Results
从现存的和刚出生的齿状颗粒细胞产生树枝状的程度用两种高尔基-考克斯或DCX染色（ 图1）在野生型小鼠进行分析。 DCX阳性细胞的树突状段被发现是13-36微米长。使用Kolmogorov-Smirnov检验树突长度的正态分布进行了测试（D = 0.1217，P <0.01，Liliefors P <0.001; 图4和5）。
在每个订单树枝状的长度段的分析，最长的片段被发现在树枝状（38.38 + 1.45微米）的第一顺序。被发现的表面（111.98 + 3.93平方微米）和体积（27.93 + 1.03立方微米）类似的模式。段由这些段占据的长度和表面面积和/或体积之间的线性关系也进行了测试。这两个面（P = 0.001，R 2 = 0.873）和体积（P = 0.001，R 2 = 0.621）C与每个树枝状段的长度显著orrelated。
图1：在此范图是用来评估齿状回颗粒细胞在海马的树突长度这样的可视化工具，可以用来比较对树突状长度不同的治疗性干预或基因型的影响。测量的单位是微米。
图2：树突树枝状的可视化无（A）和与EDFI（B）的方法。寻找最佳聚焦平面的传统方法与EDFI进行比较（数据未显示），并发现树突面积使用EDFI方法（p值= 0.02）显著更高的值。比例尺= 100微米。
图3：在小鼠的海马区的高分辨率图像这种极其高分辨率图像被自动构造从缝合10（4076 X 3116）-pixel图像。规模裸= 100微米。
图4：长度和体积的通过在分支的不同阶树突占用的量化的最大长度和体积的顺序1得以实现。
图5：齿状回颗粒细胞的树突长度的直方图大多数的D树突段CX-染色树突长度为13-26。红色虚线描绘呈现的数据的正态分布。
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Discussion
这里，两个方法被描述以量化在使用中与RTI和EDFI结合常规染色方法成熟和新生神经元树突分支的程度。采集的神经元的高分辨率图像提供了一个非常有效的方法，用于测试的神经变性疾病的有害影响，并反过来，提供了一种方法来评估靶向海马神经元的治疗策略。
而RTI方法用于捕获深度数据有关树枝状和地形的程度，所述EDFI方法不能提供有关该个体的段或树木的复杂度信息。尽管如此，EDFI方法的好处在于这一事实，它不要求购买昂贵的硬件和较少耗时。
图像分析程序被用来在视频文件执行EDFI。高分辨率和快速访问有相机允许大量图像的集合贯穿每个字段的厚度，并产生真正代表在x，y和z维度的图像。所述EDFI方法的一个缺点涉及这样一个事实，即可以有一个以上的像素（相同的x和y）聚焦在不同的平面上整个z轴。一种方法是设想以不同的颜色分配给这些像素精确代表的2D图像三维轮廓的程度。应当注意的是，也可以使用用于蜂窝型材（ 例如 ，突触小胶质细胞，和星形胶质细胞）进行分析的EDFI方法。此外，这种方法可用于分析整个部分7的厚度小胶质分布的程度。这里描述的两种方法可以在互补的方式被使用。而RTI方法提供关于分支图案的地形的确切信息，所述EDFI给我们带来了相当简单的，快速的方法，以评估在一个地区树突密度terest。值得注意的是，部分可与EDFI获取的厚度为的Z-焦点在与的显微镜物镜的光学聚焦组合的显微镜载物台的范围内高度可变口授EDFI的边界。
本文描述的方法必须被部署在多个上下文的潜力。在这项研究中，我们所提供的评估变化树突分支前后的干预的装置，而EDFI用于定量小胶质细胞活化7。因此，该技术是适合于任何应用，其中所述最终的目标是要评估的变化小型材，可在多个层中找到。
最后，这些技术可以克服无法获得非常高的分辨率和昂贵的数码相机。在本质上，该方法显示出，关于如何一个试样中捕获的不同点处的位置的序列图像，然后它们拼接在一起使用一个免费的，最终yieldin克高分辨率图像的方式，更为可靠和迅速地比常规方法。
关键步骤
高尔基染色
高尔基的库存数量及发展溶液保持在4℃下贮存，但该染色和培养协议需要将溶液在室温下被利用。冷却高尔基和发展在冰上或在冰箱中的解决方案的树突状染色的质量产生不利的影响。此外，应该指出的是，我们使用了快速发展的高尔基解决方案。而高尔基体考克斯溶液在这项研究中所用的确切组合物是专有的，有多个来源列表详细协议可用于执行高尔基体考克斯染色13。然而，利用其它高尔基体的解决方案将显著改变染色持续时间和修改这些步骤应当相应地做出。此外，我们与其他人一起让我们编150微米厚的切片进行分析DGC神经元14,15，因为它是普遍认为切割该厚度冠和平行于齿状回颗粒细胞arborizations各款最小切割树枝状分枝的风险。
DCX染色
在DCX染色协议需要明确注意温度。故障期间的预培养期间加热该溶液至37℃，将显著损害染色和导致树突可视的损失。此外，注意部分的厚度是必要的。在这项研究中，我们使用70微米厚的部分，以捕捉DGCS树突分支的最大程度。根据我们的经验，使用0.3％的Triton是必要的，因为它有利于显著整个浮动部分的厚度的抗体的穿透。确实，以前的研究已经使用仓鼠穿透70微米厚的16个或甚至更厚（120微米）17当部分标签DGC树突。请参阅Hussaini为DCX染色18的全部细节。
最后，应该注意的是，替代性的开放源码的程序（ 例如 flNeuronTool或Simple_Neurite_Tracer）与记录阶段中的x，y和z方向上的运动的能力存在。这样的程序可以，只要它们被启用与扫描阶段进行通信用于树突跟踪。
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Disclosures
这篇文章发表费由医疗保险基金生命科学赞助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified Golgi-cox staining solution | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 1x Developing Solution (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 30% Sucrose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | make fresh in ddH2O |
| 0.3% Gelatin | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) white | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | CAS Number 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS Number 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Digital Camera | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Camera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
References
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