Aquí presentamos un protocolo para medir de forma sencilla y fiable la curva presión-volumen pulmonar en ratones, demostrando que es lo suficientemente sensible como para detectar cambios fenotípicos en el parénquima en dos patologías pulmonares comunes, la fibrosis pulmonar y el enfisema. Esta métrica proporciona un medio para cuantificar los cambios estructurales del pulmón con la patología en desarrollo.
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Artículo de método
Medición de la curva de presión-volumen en mouse Pulmones
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Resumen
Resumen
En las últimas décadas el ratón se ha convertido en el modelo animal primario de una variedad de enfermedades pulmonares. En los modelos de enfisema o fibrosis, los cambios fenotípicos esenciales se evalúan mejor mediante la medición de los cambios en la elasticidad pulmonar. Para entender mejor los mecanismos específicos que subyacen a tales patologías en ratones, es esencial para realizar mediciones funcionales que pueden reflejar la patología en desarrollo. Aunque hay muchas formas de medir la elasticidad, el método clásico es el de la pulmonar total presión-volumen (PV) curva de hecho en todo el rango de los volúmenes pulmonares. Esta medición se ha realizado en los pulmones de adultos de casi todas las especies de mamíferos que datan de hace casi 100 años, y tales curvas PV también jugó un papel importante en el descubrimiento y la comprensión de la función de surfactante pulmonar en el desarrollo pulmonar fetal. Por desgracia, estas curvas totales PV no han sido ampliamente reportado en el ratón, a pesar del hecho de que pueden proporcionar información útil sobre la macroscOPIC efectos de los cambios estructurales en el pulmón. Aunque las curvas PV parciales que miden sólo los cambios en el volumen pulmonar En ocasiones se presenta, sin una medida de volumen absoluto, la naturaleza no lineal de la curva total de PV hace que estos parciales muy difíciles de interpretar. En el presente estudio, se describe una forma estandarizada para medir la curva total de PV. A continuación, hemos probado la capacidad de estas curvas para detectar cambios en la estructura de pulmón de ratón en dos patologías pulmonares común, enfisema y fibrosis. Los resultados mostraron cambios significativos en varias variables consistentes con los cambios estructurales esperados con estas patologías. Esta medición de la curva de PV de pulmón en ratones de este modo proporciona un medio sencillo para controlar la progresión de los cambios fisiopatológicos en el tiempo y el efecto potencial de los procedimientos terapéuticos.
Introducción
El ratón es ahora el modelo animal primario de una variedad de enfermedades pulmonares. En los modelos de enfisema o fibrosis, los cambios fenotípicos esenciales se evalúan mejor mediante la medición de los cambios en la elasticidad pulmonar. Aunque hay muchas formas de medir la elasticidad, el método clásico es el de la curva de presión-volumen total (PV) medida desde el volumen residual (RV) a la capacidad pulmonar total (TLC). Esta medición se ha realizado en los pulmones de adultos de casi todas las especies de mamíferos que datan de hace casi 100 años 1-3. Tales curvas PV también jugaron un papel importante en el descubrimiento y la comprensión de la función de surfactante pulmonar en el desarrollo pulmonar fetal 4-7. A pesar de la importancia de la curva de PV como una medida del fenotipo del pulmón, no ha habido una manera estandarizada para realizar esta medición. Se ha hecho simplemente inflar y desinflar el pulmón con pasos discretos (a la espera de un tiempo variable para el equilibrado después de cada) o con bombas quepuede inflar y desinflar de forma continua el pulmón. La curva de PV se hace a menudo en un rango de volumen entre cero y alguna capacidad pulmonar usuario definir, pero la duración de tiempo de cada bucle de volumen de la presión reportado por diferentes laboratorios ha sido extremadamente variable, variando desde unos pocos segundos a 8 hr 2. Algunos investigadores se refieren a esta curva total de PV de pulmón como estática o casi estático, pero estos son términos cualitativos que ofrecen poca información, y no se utilizan aquí. Además, la curva de PV no se ha informado ampliamente en el ratón, a pesar del hecho de que puede proporcionar información útil sobre los efectos macroscópicos de cambios estructurales en el pulmón.
Varias cuestiones han dado lugar a la variabilidad en la adquisición de la curva PV incluyendo: 1) la tasa de inflación y la deflación; 2) las excursiones de presión para la inflación y la deflación; y 3) los medios para determinar una medición del volumen pulmonar absoluto. En el método aquí presentes, una velocidad de 3 ml / min fue elegido como un compromise, siendo no demasiado corto como para reflejar la elasticidad dinámica asociada con la ventilación normal y no demasiado lenta como para hacer la medición poco práctico, sobre todo cuando el estudio de cohortes grandes. Desde una capacidad pulmonar total nominal en un / 6 de ratón C57BL saludable es del orden de 1,2 ml 9, esta tasa típicamente permite dos completa cerrado PV bucles que ser hecho en aproximadamente 1,5 min.
En la literatura extendida donde se han reportado las curvas PV, la presión de inflado de pico utilizado ha sido extremadamente variable, variando desde tan bajo como 20 a más de 40 cm H 2 O. Parte de esta variabilidad puede estar relacionada con las especies, pero el objetivo principal de establecer el límite de presión superior para curvas PV es para inflar el pulmón a la capacidad pulmonar total (TLC), o el volumen pulmonar máximo. El TLC en los seres humanos se define por el esfuerzo voluntaria máxima de un individuo puede hacer, pero desafortunadamente esto nunca se puede duplicar en cualquier modelo animal. Así, el volumen máximo en curvas experimentales PV es disuadirminado por una presión máxima establecido arbitrariamente por el investigador. El objetivo es establecer una presión donde la curva PV es plana, pero desafortunadamente la extremidad de la inflación de una curva de PV de pulmón de mamífero es nunca plana. Así que la mayoría de los investigadores establecen una presión donde la curva de la inflación comienza a aplanarse sustancialmente, normalmente de 30 cm H 2 O. En el ratón, sin embargo, la curva PV es aún más complejo con un doble joroba en la extremidad de la inflación, y donde esta parte la inflación es a menudo sigue aumentando vertiginosamente a 30 cm H 2 O 10, por lo que 30 no es un buen punto final para el curva PV. Por esta razón, utilizamos 35 cm H 2 O como el límite de presión para la curva PV del ratón, que es una presión a la que los miembros de inflación de todas las cepas que hemos examinado empiezan a aplanarse.
Dado que la propia curva de PV es muy no lineal, la aparición de un bucle de PV dependerá del volumen desde donde la curva comienza. Algunos ventiladores comerciales permiten a los usuarios hacer grandes bucles PV, a partir de FRC, pero si el volumen FRC es desconocida entonces es imposible interpretar los cambios en tales curva de PV con cualquier patología, ya que estos cambios podrían simplemente el resultado de un cambio en el volumen de partida, y no alteraciones estructurales en el pulmón. Por lo tanto, sin una medición de volumen absoluto, las curvas PV son casi imposibles de interpretar y por lo tanto tienen poca utilidad. Aunque, hay varias formas de medir los volúmenes pulmonares, estos son a menudo engorrosos y requieren equipo especial. En el caso simple descrito aquí, la curva PV comienza a volumen cero después de un procedimiento de desgasificación en vivo.
En resumen, este trabajo muestra un método sencillo para homogeneizar la medición curva PV pulmonar en el pulmón de ratón, y define varias métricas que se pueden calcular a partir de esta curva que están vinculados a la estructura pulmonar. Por tanto, la curva de PV proporciona una prueba de función pulmonar que tiene aplicación directa en ser capaz de detectar cambios estructurales fenotípicas en ratones con commen patologías pulmonares como el enfisema y la fibrosis.
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Protocolo
El Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins aprobado todos los protocolos de los animales.
1. Equipos
El sistema compuesto de configurar, listo para medir la curva de PV se muestra en la Figura 1.
- Medición del volumen:
- Generar una tasa constante de la inflación y la deflación mediante el uso de una bomba de jeringa con un interruptor que permite al usuario para revertir rápidamente la bomba después de alcanzar los límites de presión. Para las curvas PV ratón, usar una jeringa de vidrio de 5 ml muy ligeramente engrasado con el volumen inicial (antes de la inflación), fijado en 3 ml de aire. 3 ml es suficientemente grande para medir los volúmenes en casi todas las curvas PV ratón.
- Medir el volumen suministrado por la bomba uniendo un transformador diferencial lineal a la carcasa de la bomba, con una varilla de sensor pequeño conectado al émbolo de la jeringa en movimiento.
Nota: Un medio empíricos para corregir la compresión de gas en el sistema que se describen en el cu PVsección de grabación rve.
- Medición de la presión:
- Utilice un medidor de presión de bajo costo de serie con un rango de 0 a 60 cm H 2 O (0-1 PSI).
- Grabación de medición:
- Para grabar la curva PV utiliza ningún grabador digital con capacidades XY (por ejemplo, PowerLab). Establecer un canal para grabar la señal de volumen corregido y otro canal para grabar la presión transpulmonar (PTP), con el fin de trazar la curva PV. Utilice un preamplificador puente que se conecta a la Powerlab principal para medir la presión. Calibrar el canal de presión 0-40 cm H 2 O, y calibrar el canal de volumen 0-3 ml.
2. Corrección de Compresión de Gas
Nota: Este es un paso inicial crítico en la puesta en marcha, ya que como la presión aumenta, las disminuciones de volumen de gas, y así el volumen de aire entregado al ratón será cada vez menor que el desplazamiento de la syrbarril inge.
- Cierre la llave de paso que conectará la instalación fotovoltaica a los pulmones, por lo que no hay gas puede salir del sistema. Iniciar la infusión y observar si el canal de volumen corregido en la grabadora muestra los cambios mensurables como la presión aumenta a aproximadamente 40 cm H 2 O. Si es así, entonces correcta como en los pasos siguientes.
- Correcta para la compresión de gas empíricamente restando de la medición de desplazamiento del émbolo (es decir, el volumen no corregido) de un término proporcional a la presión de inflado. Haga esto en un canal Powerlab (llamado Vc) para mostrar la señal de volumen menos unos tiempos de coeficientes de la presión.
- Determinar el coeficiente en la ecuación. En primer lugar, hacer una estimación inicial, gire el gráfico grabación en, y arrancar la bomba. Desde el tubo de inflación está sellado, ajustar el multiplicador de coeficiente de presión para que el canal Vc leer cero como la presión aumenta 0-40 cm H 2 O. Si sube o baja, sólo tiene que ajustar el factor de corrección hasta quese mantiene plana en este intervalo de presión. Este factor de corrección siempre será la misma, si no se cambia las mismas 3 ml volumen de partida en la jeringa.
3. Pruebas experimentales en ratones
- Procedimiento para la medición de la curva de PV en ratones. Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins.
- Anestesiar a los ratones (C57BL / 6 ratones a los 6-12 semanas de edad) con ketamina (90 mg / kg) y xilazina (15 mg / kg), y confirmar la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo.
Nota: La curva de PV se puede completar en ratones anestesiados en menos de 10 min y es un procedimiento terminal. - Tracheostomize los ratones con un 18 G cánula de la aguja trozo. Haga esto haciendo una pequeña incisión en la piel que cubre la tráquea, la localización de la tráquea, a continuación, hacer una pequeña abertura en la tráquea, donde se puede insertar la aguja trozo. Fije la cánula mediante la vinculación con hilo.
- Permitir a los ratones para respirar 100% de oxígeno durante al menos 4 min. Esto puede ser a través de la respiración espontánea de una bolsa o con un ventilador nominalmente conjunto con un volumen corriente de 0,2 ml a 150 respiraciones / min.
- Cierre la cánula traqueal y permitir 3-4 minutos para el ratón para absorber todo el oxígeno. Este procedimiento de absorción de oxígeno como resultado la muerte de los animales y en una desgasificación casi completa del pulmón 11. Confirmar la muerte del ratón mediante la medición del cese de los latidos del corazón con electrodos de ECG o la observación directa.
- Una vez que la desgasificación del pulmón es completa y el volumen de pulmón es cero, comenzar inflar el pulmón con aire de la habitación en la bomba de jeringa a una velocidad de 3 ml / min. Supervisar el trazado de la presión en la grabadora digital, y cuando llega a 35 cm H 2 O, invierta la bomba.
- Siga la curva de la deflación hasta que la presión alcanza negativo 10 cm H 2 O, momento en el cual las vías respiratorias se han derrumbado, atrapando el aire en los alvéolos que impiden una mayor reducción de volumen. Revertir Inmediatamente tque la bomba de nuevo, lo que permite que el pulmón se vuelva a inflar como las vías respiratorias colapsadas abrir. Esta abertura es normalmente heterogénea aparente por el ruidoso mirando extremidad de inflación en la parte inicial de esta segunda inflación.
- Cuando la presión vuelve a alcanzar 35 cm H 2 O, invertir la dirección de la bomba, y continuar para desinflar el pulmón hasta esta segunda extremidad deflación llega a 0 cm H 2 O. Luego parar la bomba.
- Ver el registro gráfico de PowerLab de presión y el flujo y la curva PV. Luego de analizar la curva PV para detectar cambios fenotípicos en parénquima pulmonar que se presentan con diferentes patologías pulmonares.
- Anestesiar a los ratones (C57BL / 6 ratones a los 6-12 semanas de edad) con ketamina (90 mg / kg) y xilazina (15 mg / kg), y confirmar la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo.
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Resultados
Aunque el procedimiento para las curvas PV se demuestra en el vídeo sólo para los ratones sanos de control, se analizó la capacidad de la curva de PV para detectar cambios funcionales y patológicos en los ratones con dos patologías comunes diferentes, enfisema y fibrosis. Los detalles de estos modelos tradicionales describen en otra parte 12,13. Muy brevemente, después de la anestesia con 3% de isoflurano el enfisema fue causado por 3 o 6 U elastasa pancreática porcina inculcado en la tráquea y estudió 3 sema...
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Discusión
En este documento un método reproducible sencillo se ha descrito para medir en ratones un método clásico de la elasticidad pulmonar fenotipificación, la curva total de PV de pulmón. Estas curvas fueron fundamentales en el descubrimiento de surfactante pulmonar y su importancia en el suministro de la estabilidad de pulmón. Aquí se muestra cómo la curva de PV también es útil para proporcionar un medio para medir varias variables relacionadas con la elasticidad pulmonar en los pulmones de ratón adulto. Hubo cambios muy sig...
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene intereses financieros que estén en conflicto con el material presentado en este artículo.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido apoyado por NIH HL-1034.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bomba de jeringa | Harvard Apparatus | 55-2226 Bomba de | jeringa de infusión/extracción |
| Bomba 22 interruptor de inversión | Harvard Apparatus | 552217 | Incluido con bomba |
| Transformador de desplazamiento lineal | Trans-Tek, Inc. | 0244-0000 | |
| Jeringa de vidrio de 5 ml | Becton Dickenson | Varios otros posibles proveedores | |
| Grabadora digital | ADInstruments | PL3504 | Varios otros posibles proveedores |
| Acondicionador de señal de amplificador | puente ADInstruments | FE221 | |
| Tanque de gas, 100% oxígeno | Airgas, Inc | Cualquier proveedor o fuente hospitalaria funcionará | |
| Transductor de presión: 0 - 1 psi Salida de mV | Omega Engineering | PX-137 | Rango ≈ 0 - 60 cm H2O |
Referencias
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