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Artículo de método

La transfección de genes hacia células Esferoide sobre placas micropatterned Cultura para el trasplante de células genéticamente modificadas

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DOI:

10.3791/52384

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31 de julio de 2015

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1Graduate School of Medicine, Laboratory of Clinical Biotechnology, The University of Tokyo, 2Graduate School of Engineering, Department of Materials Engineering, The University of Tokyo, 3Graduate School of Engineering, Department of Bioengineering, The University of Tokyo

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un sistema de trasplante de células utilizando esferoides inyectables modificados genéticamente. Los esferoides celulares se cultivan en placas de cultivo con micropatrones y se recuperan después de la introducción del gen utilizando nanomicelas poliplex. Este sistema facilita la expresión prolongada de transgenes de las células trasplantadas en los animales huéspedes, manteniendo la función innata de las células.

Resumen

Para mejorar la eficacia terapéutica del trasplante de células, se desarrolló un sistema de trasplante de genéticamente modificados, esferoides inyectables. Los esferoides de células se preparan en un sistema de cultivo en placas de micropatterned recubiertas con un polímero termosensible. Un número de esferoides están formados en las placas, correspondientes a las áreas de adhesión celular de 100 m de diámetro que están dispuestos regularmente en una forma bidimensional, rodeadas por áreas no adhesivas que están recubiertas por un glicol de polietileno (PEG) matriz. Los esferoides se pueden recuperar fácilmente como una suspensión líquida mediante la reducción de la temperatura de las placas, y su estructura está bien mantenido pasándolos a través de agujas de inyección con un calibre lo suficientemente grande (más de 27 G). La modificación genética se consigue mediante transfección de genes usando la no viral portador del gen original, nanomicelle Polyplex, que es capaz de introducir genes en las células sin interrumpir la estructura esferoide. Para primesferoides de hepatocitos ary transfectadas con un gen de luciferasa que expresan, la luciferasa se obtiene de forma sostenible en animales trasplantados, junto con la función de los hepatocitos conservados, como se indica por la expresión de albúmina. Este sistema se puede aplicar a una variedad de tipos de células incluyendo células madre mesenquimales.

Introducción

Terapia de trasplante de células ha atraído una gran atención para el tratamiento de diversas enfermedades intratables. La actividad y la vida media de los factores bioactivos que son secretadas por las células trasplantadas son esenciales para mejorar la eficacia terapéutica de un sistema de trasplante de células. La modificación genética de las células antes del trasplante es una técnica beneficiosa para regular y manipular las funciones celulares, incluyendo la secreción de los factores bioactivos. También es importante mantener un microambiente favorable para las células para evitar la muerte celular o pérdida de la actividad celular. Tridimensional de cultivo (3D) de células esferoide, en el que las interacciones de célula a célula están bien conservados, es prometedor para este propósito, por ejemplo, para mejorar la secreción de albúmina de los hepatocitos primarios y promoción de la diferenciación multi-linaje de células madre mesenquimales (MSCs ) 1-7.

En este estudio, un nuevo sistema de combinación de spheroid cultura y la transfección de genes se utiliza para servir como una plataforma para el trasplante de células modificadas genéticamente. Para la creación de células esferoides, se utiliza un sistema de cultivo en placas de cultivo esferoide micropatterned. En estas placas, las áreas de adhesión celular de 100 m de diámetro están dispuestos regularmente en una forma de dos dimensiones y están rodeadas por áreas no adhesivas recubiertas por una matriz 3 PEG. Por la siembra de un número adecuado de células, se forman matrices de esferoides en 3D de 100 micras de diámetro correspondiente al lecho de cultivo microestructurada.

Los esferoides se recuperan sin interrumpir su estructura 3D mediante el uso de placas de cultivo celular termosensibles, que se revistieron con un polímero termosensible, poli (iso-propilacrilamida) (PIPAAm) 8-10. La arquitectura micropatterned se construye sobre las placas termosensibles (a medida construido). Por simplemente bajando la temperatura de las placas, los esferoides se separan de la cama de cultivo y se dispersand en tampón fosfato salino (PBS). Por lo tanto, un gran número de esferoides con un tamaño uniforme de 100 micras se puede obtener en la forma de una suspensión inyectable.

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Figura 1. Representación esquemática del sistema de cultivo esferoide en una placa microestructurada. La modificación genética se consigue mediante transfección de genes usando la no viral portador del gen original, nanomicelle Polyplex. Se compone de ADN de plásmido (pDNA) y polietilenglicol (PEG) copolímeros de bloque -polycation 11. Estos tienen una estructura de núcleo-corteza característica que consiste en una cáscara de PEG y un núcleo interno de pDNA condensada, lo seguro y eficaz introducción de genes en células con fines terapéuticos 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de this figura.

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Figura 2. Estructura de la nanomicelle Polyplex formado por el complejo de ácidos nucleicos y copolímeros de bloque de PEG-bloque-policatión. En este estudio, la principal ventaja de esta técnica es que la estructura de esferoide no se interrumpe durante transfección de genes por los nanomicelles. Después de transfecciones nanomicelle mediada de rata esferoides de hepatocitos primarios, prolongada expresión del transgen se obtiene durante más de un mes con la secreción de albúmina continua de los hepatocitos en un nivel comparable a la de esferoides no transfectadas 12. La expresión del transgén y la secreción de albúmina a partir de los esferoides también se mantienen después de la recuperación de las placas termosensibles. Es evidente que nanomicelles pueden facilitar de manera segura la introducción de genes sin perjudicar las funciones innatas de la hepatocytes. Por lo tanto, la combinación de células esferoides cultivadas en placas micropatterned termosensibles con la introducción de genes usando nanomicelles es una plataforma prometedora para el trasplante de células modificadas genéticamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

Se realizaron todos los estudios en animales con la aprobación del Comité de Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Tokio, Tokio, Japón.

1. Preparación de la célula

  1. Para hepatocitos primarios, seguir el protocolo para el aislamiento de hepatocitos de rata por un proceso de digestión con colagenasa de dos etapas modificado 13,14.
    1. Anestesiar Sprague Dawley (SD) ratas (macho, 5 semanas de edad) con anestesia por inhalación con isoflurano. Coloque una rata en una cámara conectada a una máquina de anestesia para proporcionar isoflurano para la cámara. Saque la rata después de quedarse dormido, y la puso sobre la mesa de operaciones con ventilación usando una máscara. Controlar el flujo de la isoflurano en aproximadamente desde 0,4 hasta 0,7 L / min mediante la comprobación de las condiciones de la rata. Perfundir los hígados de ratas Sprague Dawley (SD) ratas (macho, 5 semanas de edad) de la vena portal hepática con una solución especial compuesta de cloruro de sodio 8 g / L (NaCl), 400 mg / L de cloruro de potasio (KCl), 78 mg / Lde sodio dihidrato de fosfato de dihidrógeno (NaH 2 PO 4 · 2H 2 O), 151 mg / L de hidrógeno fosfato disódico dodecahidrato (Na 2 HPO 4 · 12H 2 O), 2,38 g / L 2- [4- (2-hidroxietil) -1 piperazinil] etanosulfónico (HEPES), 190 mg / L de ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), 350 mg / L de carbonato de hidrógeno de sodio (NaHCO 3), y 900 mg / L de glucosa.
    2. Circular solución de colagenasa a través del hígado.
      NOTA: La solución se compone de 500 mg / L colagenasa, / sal tamponada de L Hank 9,8 g, 2,38 g / ml HEPES, 556 mg / ml de hidrato de cloruro de calcio (CaCl 2 · H 2 O), 350 mg / L de NaHCO3, y el inhibidor de tripsina / L 50 mg, con el pH ajustado a 7,2.
    3. Retire cuidadosamente el hígado, y picar suavemente sobre un plato usando una hoja de bisturí, añadir medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), y filtrar la suspensión celular a través de un 100 micrasde malla de nylon. Para eliminar cualquier desecho adicional, centrifugar la suspensión celular a 20 × g durante 1 min. En este paso, los hepatocitos son en el sobrenadante.
    4. Repetir la etapa de centrifugación dos veces (un total de tres centrifugaciones). Finalmente, centrifugar los hepatocitos a 50 × g durante 3 min para recuperar ellos en la forma de un pellet.
    5. Vuelva a suspender los hepatocitos a una concentración de 4 × 10 5 células / ml en un medio de cultivo especial compuesto por DMEM suplementado con 10% FBS, 1% de Pen-Strep-GLUT (PSQ), 1% de sulfóxido de dimetilo (DMSO), 0,1 mol / L de dexametasona, 0.5 mg / ml de insulina, 10 mmol / L de nicotinamida, 0,2 mmol / L ascorbato fosforilada (Asc-2P), y 10 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF) 15. Este medio especial es obligatorio para la preservación de la función hepática en condiciones in vitro.
  2. Para la obtención de MSC de rata, la eutanasia Sprague Dawley (SD) (varones, 5 semanas de edad) por la administración excesiva de isoflurane. Resecar el fémur y la tibia, y recoger las médulas óseas mediante la inserción de una aguja G 22 en el eje del hueso para tirar de la cadena a cabo con 10 ml de DMEM suplementado con 10% FBS. Recoger las células por filtración a través de una malla de nylon 100 micras.
  3. Semilla las células en 10 platos cm de cultivo utilizando DMEM que contenía 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina. Para los experimentos de esferoide, utilizar las MSC dentro de 5 pasajes.

2. Preparación de esferoides de células 3D

  1. Comercialmente obtener placas de cultivo de micropatterned, en el que las zonas adhesivas celulares están dispuestos regularmente en 100 m de diámetro en una forma bidimensional, rodeado de zonas no adhesivas recubiertas por la matriz de PEG.
    NOTA: Para el trasplante de células, un recubrimiento adicional con el PIPAAm polímero termosensible es necesario para permitir el desprendimiento de células por el enfriamiento de las placas (véase el paso 5.1). Las fluctuaciones de temperatura pueden inducir cambios en la química de este polímero8-10. A 37 ° C, PIPAAm es ligeramente hidrófobo, permitiendo que las células a ser cultivadas bajo condiciones normales. Una disminución de la temperatura por debajo de 32 ° C resulta en una rápida hidratación del polímero, que conduce a la separación espontánea de las células.
  2. Seed los hepatocitos o MSC en placas de 12 pocillos micropatterned a una densidad de 4 × 10 5 células / pocillo andincubate ellos a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2. Las células se acumulan en las áreas de adhesión micropatterned y formar gradualmente esferoides redondas en 2 días.
    NOTA: Para la preparación de las células de control en un cultivo en monocapa, utilizar placas normales 12 pocillos y sembrar las células en una densidad idéntica, siguiendo un procedimiento similar al descrito anteriormente.

3. Preparación de Polyplex Nanomicelles

  1. Sintetizar un copolímero de bloques, PEG-pAsp (DET) (poli [N '- [N - (2-aminoetil) -2-aminoetil] aspartamida]) (PEG Mw = 12,000, grado de polimerización (DP) de la PSAP (DET) segmento = 59), y un homopolímero que se compone de sólo el segmento catiónico [PSAP (DET)] (DP = 55), siguiendo los procedimientos descritos previamente por los autores 11, 16, 17.
  2. Preparar una solución mixta del copolímero de bloque PEG-pAsp (DET) y el PSAP (DET) homopolímero con una relación molar igual de grupos amino residuales en 10 mM de tampón HEPES (pH 7,3) mediante el ajuste de la concentración de polímero de 33,3 mg / ml y 19,1 g / ml, respectivamente.
    NOTA: Las concentraciones de polímero descritas anteriormente son valores representativos para la preparación de nanomicelles con una relación molar residual de los grupos amino totales en los dos polímeros a los grupos fosfato en el (N relación A / P) pDNA de 10. La relación N / P puede variar dependiendo del tipo de célula y el propósito (para más detalles, véase la discusión). El uso combinado de los dos polímeros puede lograr tanto blindaje PEG efectiva y el funcionamiento de la PSAP (DET) para mejorar endosomalescapar (para más detalles, véase la discusión) 18.
  3. Preparar la luciferasa Gaussia pDNA que codifica, GL4 luciferasa, o eritropoyetina por clonación del segmento de la expresión de los respectivos genes en el plásmido pCAG-GS (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) para obtener la expresión bajo el CAG promotor / potenciador utilizando un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Amplificar el pDNA en una cepa competente de Escherichia coli y purificar usando un sistema de purificación de ADN plásmido libre de endotoxinas. Determinar la concentración de pDNA a una absorbancia de 260 nm para obtener una solución / ml 150 mg en 10 mM de tampón HEPES (pH 7,3).
  4. Para preparar los nanomicelles Polyplex, mezclar a fondo la solución pDNA (150 g / ml en 10 mM de tampón HEPES) y la solución premezclada de los dos polímeros en una proporción de 2: 1 (en volumen).

4. transfección de genes en esferoides

  1. Se incuban las células (hepatocitoso MSCs) durante 72 horas después de la siembra en las placas micropatterned para permitir la formación de esferoides maduros. Para la transfección génica, añadir 100 l de la solución nanomicelle Polyplex (que contienen 10 g de pDNA) a cada pocillo después de sustituir el medio de cultivo con 1 ml de medio fresco. Continuar la incubación con la solución nanomicelle durante 24 hrs.
  2. Para un control usando un reactivo de transfección a base de lípidos, mezclar las soluciones de pDNA con el reactivo en una relación en peso de reactivo / pDNA de 3. Ajuste de la dosis final de pDNA a ser igual tanto para el reactivo a base de lípidos y métodos nanomicelle.

5. Recuperación y Trasplante de esferoides celulares

  1. Sustituir el medio de cultivo con 200 l de PBS frío y colocar las placas en hielo.
    NOTA: Por lo general, los esferoides pueden desprenderse en aproximadamente 15 minutos y pueden ser recuperados en forma de una suspensión para el trasplante.
  2. Aspirar suavemente las células en el 200 lsuspensión con una jeringa con un 23 G 27 G o aguja para inyecciones in vivo.

6. Evaluación de la expresión transgénica

  1. Para la evaluación in vitro de la expresión de luciferasa Gaussia secretada en el medio de cultivo, recoger 50 - 100 l de medio de precisamente 24 hrs después de reemplazar con medio fresco. Estimar la expresión de luciferasa usando un sistema de ensayo de luciferasa de Renilla comercial y un luminómetro según el protocolo del fabricante.
    NOTA: La luciferasa Gaussia se mantiene estable en el medio de cultivo durante más de una semana. Por lo tanto, para evaluar la eficiencia en tiempo real de la expresión de los transgenes, sustituir el medio con uno fresco antes de recoger el medio de muestra. El momento del cambio de medio puede ser flexible.
  2. Para la evaluación in vivo de la expresión del transgén en animales huésped después del trasplante de células, anestesiar BALB / c ratones nude (hembra; 7 semanasde edad) bajo anestesia por inhalación con isoflurano.
    1. Coloque un ratón en una cámara conectada a una máquina de anestesia para proporcionar isoflurano para la cámara. Saque el ratón después de quedarse dormido, y lo puso sobre la mesa de operaciones con ventilación usando una máscara. Controlar el flujo de la isoflurano aproximadamente a 0,2 hasta 0,5 L / min mediante la comprobación de las condiciones del ratón.
    2. Inyectar 200 l de la suspensión celular que contiene esferoides transfectadas con el pDNA de luciferasa que expresan GL4 (como se describe en 4.1) en el tejido subcutáneo de la región abdominal.
    3. Inmediatamente después de la inyección de D-luciferina (150 mg / kg; vía intravenosa), medir la expresión de luciferasa usando el sistema de formación de imágenes IVIS según el protocolo del fabricante.
  3. Para la evaluación de los efectos terapéuticos de la trasplante de células, inyectar 200 l de la suspensión celular que contiene esferoides transfectadas con el pDNA que codifica eritropoyetina en eltejido subcutáneo de la región abdominal.
    1. Recoger muestras de sangre por hemorragia submandibular obtener aproximadamente 200 l de sangre 19. Medir la hemoglobina y el hematocrito utilizando un analizador de muestra de sangre.
      NOTA: El número de células para el trasplante está regulada por el número sembradas en las placas. Desafortunadamente, es difícil determinar el número exacto de células porque el número dentro de esferoides no se puede medir.
  4. Después de los experimentos, coloque los ratones en una almohadilla eléctrica conectada con un controlador de temperatura hasta que el despertar de la anestesia.

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Resultados

Transfección de genes de la luciferasa que expresan pDNA Gaussia se realizó en los esferoides formados por los hepatocitos o MSCs utilizando nanomicelles Polyplex o el reactivo de transfección basado en lípidos de control 12. Los nanomicelles inducidos casi ningún cambio en la estructura esferoide en comparación con esferoides no transfectadas en las placas micropatterned, mientras que el reactivo de control interrumpe significativamente la estructura de un día después de la transfección (Figura 3).

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Discusión

En este protocolo, es fundamental para mantener la estructura 3D de esferoides durante las etapas de introducción de genes y la recuperación esferoide. Es esencial mantener una microambientes favorables para las células para evitar la muerte celular o la pérdida de la actividad celular. Por ejemplo, la secreción de albúmina, una función innata representante de los hepatocitos, está bien conservado en los esferoides de hepatocitos, mientras que los hepatocitos en el cultivo monocapa convencional pierden rápidamente su ca...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Apreciamos profundamente Dr. Takeshi Ikeya y personal técnico en Toyo Gosei, Tokio, Japón para proporcionar placas de cultivo micropatterned termosensibles, así como el asesoramiento científico. También agradecemos a la Sra Satomi Ogura, Sra Sae Suzuki, la Sra Asuka Miyoshi y la Sra Katsue Morii para la asistencia técnica con los experimentos con animales. Este trabajo fue apoyado financieramente en parte por las JSP KAKENHI subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica, el Centro del Programa de Innovación (COI) y el programa de innovación S- de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (JST), y las JSP Core- a-Core Programa, A. Redes Avanzadas de Investigación.

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Materiales

Escherichia coli
Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pluma-estreptococo-glutGIBCO
DexametasonaWako Industrias Químicas Puras041-18861
NicotinamidaWako Industrias Químicas Puras141-01202
Hank' Sal tamponada y ácido L-ascórbico 2-fosfato (Asc-2P)Sigma-AldrichA8960
Factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF)ToyoboPT10015
Placas multipocillos aptas para célulasToyo GoseiPP-12
Placas de cultivo celular termosensibles (Upcell)CellSeed IncLa arquitectura micromodelada se construye sobre las placas termosensibles (construidas a medida por Toyo Gosei)
Reactivo de transfección a base de lípidos (FuGENE HD)PromegaE2311
RenillaPromegaE2810
pGL4 Luciferasa Reporter VectorPromegaE6651
ADNp que expresa Gaussia luciferasaNueva Inglaterra BioLabsN8082S
Vector de expresión de erhtropoyetina de ratónOrigeneMC208445
pCAG-GSAmablemente proporcionado por el Laboratorio de Estudios de Células Pluripotentes, Centro de Biología del Desarrollo, RIKEN
alfa;Takara9057
Sistema de purificación de ADN plasmídico libre de endotoxinasNippon GeneticsNucleoBond Xtra EF
ColagenasaWako Pure Chemical Industries639-00951
Inhibidor de tripsinaGIBCOR-007-100
LuminómetroPromegaGloMax™ 96 Microplaca Luminómetro
IVIS Sistema de imagenXenogen Corp.Sistema de imagen in vivo Xenogen IVIS Spectrum
de sangreSysmexpocH-100i Analizador
Sistema de ensayo de luciferasa DH5 y células competentes Analizador de muestras de hematología automatizado

Referencias

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