Los efectos linfodepletorios e inmunomoduladores de la quimioterapia y la radiación estándar pueden aprovecharse para mejorar la eficacia antitumoral de la inmunoterapia con células T. Describimos un método para generar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas de EGFRvIII y administrarlas en el contexto del tratamiento estándar del glioblastoma.
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Artículo de método
Generación de células T CAR para realizar la terapia adoptiva en el contexto de Glioblastoma estándar de cuidado
En este artículo
Resumen
Resumen
La inmunoterapia adoptiva de células T ofrece una estrategia prometedora para atacar y eliminar específicamente los gliomas malignos. Los linfocitos T pueden modificarse ex vivo para expresar receptores de antígenos quiméricos específicos para los antígenos del glioma (linfocitos T con CAR). La expansión y la función de las células CAR-T transferidas por adopción pueden verse potenciadas por los efectos linfodepletivos y tumoricidas de la quimioterapia y la radioterapia de tratamiento estándar. Describimos un método para generar células T con CAR dirigidas a EGFRvIII, un antígeno específico del glioma, y evaluamos su eficacia cuando se combinan con un modelo murino de tratamiento estándar para el glioblastoma. Las células T se modifican mediante transducción con un vector retroviral que contiene el gen CAR anti-EGFRvIII. Los animales portadores de tumores se someten al condicionamiento del huésped mediante un ciclo de temozolomida e irradiación de todo el cerebro a regímenes de dosis diseñados para modelar el estándar clínico de atención. A continuación, las células CAR-T se administran por vía intravenosa a los huéspedes preparados. Este método se puede utilizar para evaluar la eficacia antitumoral de las células T con CAR en el contexto del tratamiento estándar.
Introducción
El glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral maligno primario más común y es invariablemente fatal. La resección quirúrgica junto con estándar no específica de la quimioterapia y la radioterapia cuidado de no eliminar completamente las células malignas, que resulta en un pronóstico sombrío de menos de 15 meses en los pacientes con esta enfermedad 1. En contraste, la inmunoterapia ofrece un enfoque preciso para apuntar específicamente a las células tumorales, y por lo tanto tiene el potencial para servir como una plataforma de tratamiento altamente eficaz con menor riesgo de toxicidad colateral 2-4. Células T diseñadas ex vivo para expresa....
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Protocolo
Este protocolo se basa en un diseño experimental donde 10 los ratones se tratan con 10 7 CAR células T cada uno. Esto significa que se necesitarán 10 8 células CAR T; el rendimiento debe ser sobrestimada por 5 x 10 7 -1 x 10 8 a la cuenta de la pérdida de viabilidad. El siguiente protocolo se escala para generar aproximadamente 200 x 10 6 células. Las células se administran por vía intravenosa a la hembra C57BL / 6 ratones con 9 días tumores intracraneales EGFRvIII positivos singénicos establecidos, desarrollado a partir de los astrocitoma KR158B o líneas celulares de melanoma B16 existentes. Concomitantemente co....
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Resultados
Las células T CAR son generados por la transducción con el vector retroviral EGFRvIII CAR 11. Este vector, MSGV1, se desarrolló a partir del vector SFGtcLuc_ITE4 35, que contiene el virus de células madre murinas (MSCV) repeticiones terminales largas, la extendida región gag y sitio de empalme sobre (donador de empalme, sd, y aceptor de empalme, sa), y viral señal de empaquetamiento (ψ). El CAR EGFRvIII que contiene el fragmento humano anti-EGFRvIII de una sola cadena variable (scFv) 139, en tándem.......
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Discusión
La línea de tiempo de tratamiento descrito aquí fue diseñado para modelar estándar clínico de atención y potenciar sus efectos para la terapia adoptiva CAR. CAR dosis de células T, los regímenes de TMZ, y la administración de la radioterapia pueden ser modificados para mejorar la actividad in vivo de células T, lymphodepletion, y el asesinato del tumor en. Regímenes de TMZ se puede aumentar para producir mielosupresión de host y una mayor expansión de las células transferidas adoptivamente 30.
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Dra. Laura Johnson y al Dr. Richard Morgan por proporcionar la construcción retroviral CAR. Los autores también agradecen a Giao Ngyuen por su ayuda con la dosimetría para la irradiación de todo el cerebro. Este trabajo fue financiado por una subvención del NCI de los NIH 1R01CA177476-01.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vector de empaquetado de retrovirus pCL-Eco | Imgenex | 10045P | Vector auxiliar para generar retrovirus CAR |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Mitógeno no específico para inducir la proliferación de células T y la transducción viral |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilita la transducción retroviral de células T |
| Lipofectamina 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Reactivo de transfección |
| DMEM, alta glucosa, piruvato | Life technologies | 11995-065 | HEK293 medio de cultivo |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Medios de cultivo de células T |
| Opti-MEM I Medio de suero reducido | technologies | 11058-021 Medios de | transfección |
| 200 mM L-Glutamina | Life technologies | 25030-081 | suplemento de medios para cultivo de células T |
| 100 mM Piruvato de sodio | Life technologies | 11360-070 Suplemento de | medios para cultivo de células T |
| 100X MEM Solución de aminoácidos no esenciales | Life technologies | 11140-050 | Suplemento de medios para cultivo de células T |
| 55 mM 2-Mercaptoetanol | Life technologies | 21985-023 | Agente reductor para eliminar los radicales libres |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml) | Life technologies | 15140-122 Suplemento de medios de | cultivo de células T |
| Gentamicina (50 mg/ml) | Life technologies | 15750-060 Suplemento de medios de | cultivo de células T |
| GemCell Suero bovina fetal de origen estadounidense | Gemini Bio Products | 100-500 | Proporciona factores de crecimiento y nutrientes para el crecimiento celular in vitro |
| Albúmina sérica bovina (BSA), fracción V– Productos | Gemini Bio de | 700-100P | Bloquea la unión no específica del retrovirus a placas recubiertas de retronectina |
| Pharm Lyse (concentrado 10x) | BD Biosciences | 555899 | Lisa los glóbulos rojos durante el procesamiento de los esplenocitos |
| 70 μ m Filtros de células estériles | Corning | 352350 | Filtra las partículas de tejido grandes durante el procesamiento de esplenocitos |
| Placas de cultivo BioCoat de 100 mm con Poly-D-Lisina | Corning | 356469 | Promueve la adhesión de las células HEK293 para maximizar la proliferación después de la transfección |
| [header] | |||
| Temozolomida | Best Pharmatech | N/A | Polvo liofilizado preparado el día de la administración |
| Dimetilsulfóxido Sigma | Life Sciences | D2650 | Necesario para la disolución completa de la temozolomida |
| Salina | Hospira | IM 0132 (5/04) | Disolvente para temozolomida y ketamina/xilacina |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Solución de ketamina |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Solución estéril de xilacina 100 mg/ml |
Referencias
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N ....
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