Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

شعاعي التنقل والسامة للخلايا وظيفة من فيروسات الرجعية تكرار ناقل Transduced، غير ملتصقة Alloresponsive T اللمفاويات

Published: February 11, 2015 doi: 10.3791/52416
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1,2, 1,4,5, 3,5, 1,4,5
1Department of Neurosurgery, UCLA David Geffen School of Medicine, 2Department of Molecular and Medical Pharmacology, UCLA David Geffen School of Medicine, 3Department of Medicine, UCLA David Geffen School of Medicine, 4Brain Research Institute, UCLA David Geffen School of Medicine, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, UCLA David Geffen School of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

نحن الإبلاغ عن التكيف رواية للمقايسة الهجرة خلية شعاعي أحادي الطبقة، لاول مرة لقياس الهجرة شعاعي من الخلايا السرطانية ملتصقة على البروتينات المصفوفة خارج الخلية، لقياس الحركة البشرية غير ملتصقة أو المستجيب الفئران خلايا fluorescently المسمى، المناعية. هذه التقنية تستخدم مشعب الفولاذ المقاوم للصدأ و10-جيدا الشريحة تفلون لإيداع الوزراء البريطانى خلايا T غير ملتصقة في آبار أعدت مع أي متموجة الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية أو البروتينات المصفوفة خارج الخلية. يستخدم الضوء و / أو متعدد القنوات المجهري مضان لتتبع حركة وسلوك الخلايا المستجيب على مر الزمن. الأصباغ الفلورية و / أو ناقلات فيروسية أن يتم استخدام رمز الجينات المحورة الفلورية لتسمية بشكل مختلف أنواع الخلايا للتصوير. هذا الأسلوب هو متميز من نوع مماثل في فحوصات المختبر التي تتبع أفقي أو عمودي الهجرة / الغزو استخدام غرف الشرائح، أجار أو transwell لوحات. مقايسة يسمح بيانات التصوير مفصلة لبالبريد جمعها مع أنواع مختلفة من الخلايا تتميز علامات الفلورسنت محددة؛ يمكن رصدها حتى القطعان معينة من الخلايا (أي transduced / nontransduced). يتم إنشاؤها سطح المؤامرات كثافة مضان باستخدام قنوات محددة مضان التي تتوافق مع نوع من الخلايا المهاجرة. وهذا يسمح لتصور أفضل للتنقل الخلايا المناعية غير ملتصقة في أوقات محددة. فمن الممكن لجمع أدلة عن وظائف الخلية المستجيب أخرى، مثل سمية الخلايا أو نقل ناقلات فيروسية من المستجيب لاستهداف الخلايا، كذلك. وهكذا، فإن الأسلوب يسمح للباحثين لتوثيق مجهريا خلية الى خلية تفاعلات المسمى تفاضلي، وعدم تمسكا مع الخلايا الملتصقة من مختلف الأنواع. قد تكون هذه المعلومات ذات أهمية خاصة في تقييم أنواع الخلايا المناعية بيولوجيا التلاعب بها أو تفعيلها، حيث هو المطلوب برهان البصرية من وظائف مع الخلايا المستهدفة الورم قبل استخدامها لعلاج السرطان.

Introduction

وقد تم تطوير هذا الفحص الهجرة خلية شعاعي واحد رقائق أصلا لقياس خصائص الارتشاحي من الخلايا السرطانية ملتصقة 1-4 على الشرائح المغلفة مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات 5-7 أو مع مكونات ECM الفردية، مثل فبرونيكتين أو laminin 1،2. وشملت تقنية البذر تعليق خلية واحدة من الخلايا السرطانية في وسط الآبار باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ الترسيب خلية متعددة (CSM). بعد الترسيب، فإن الخلايا السرطانية الانضمام إلى قاع البئر والتغيير في قطر من السكان الخلية الأولي مع مرور الوقت كانت تستخدم لإقامة معدل الحركة الأفقية. قدم فحص شعاعي الهجرة الخلية أحادي الطبقة ميزة البصرية على الطرق الأخرى القائمة التي يعملون transwell لوحات لفحص القدرات في المختبر من خلايا المهاجرة. هذه المقايسات غير قابلة للتفضي إلى التصوير 8. كذلك، قدمت أيضا قدرا كبيرا من الحرية في اختيار timepointليالي عندما يتم تقييم الهجرة، مع عدم وجود حد لعدد من timepoints الباحث يمكن أن يختار الصورة بعد الترسيب.

لأن القدرة على الهجرة هي وظيفة هامة للخلايا غير ملتصقة، وخاصة في مجال العلاج المناعي أو حيث يمكن أن تستخدم وسائل إيصالها للناقلات فيروسية، ونحن تكييفها استخدام CSM لتقييم هجرة الخلايا غير ملتصقة أنواع على الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية، بالإضافة إلى البروتينات ECM. فائدة إضافية تتمثل في تصور مجهريا هجرة الخلايا غير ملتصقة على الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية قابلة للحياة، على ECM معقدة معزولة عن الورم، أو على مكونات ECM الفردية يجعل هذا الاختبار تنوعا. لا تعكس المقايسات التي تستخدم الآبار المغلفة مع البروتين خارج الخلية واحد بدقة الركيزة الأنسجة ECM أو ورم أن الخلايا تهاجر من خلال في الجسم الحي.

هنا، كنا alloreactive السامة للخلايا T الليمفاوية (alloCTL)، توعيتهم histocomp الرئيسيةمجمع atibility (MHC) البروتينات باستخدام تفاعلات في اتجاه واحد الخلايا السرطانية اللمفاوية مختلطة (MLTR) أو ردود الفعل اللمفاويات مختلطة (MLR) 9، كما لدينا التمثيلي غير ملتصقة نوع من الخلايا. نحن اختبار خلايا المنشأ البشري والفئران على حد سواء. عندما تم قياس الهجرة على الطبقات الوحيدة الورم، وكانت الخلايا السرطانية يعملون الأهداف ذات الصلة إما جزئيا، وعرض بعض من نفس البروتينات MHC وجدت على السكان الخلية المستخدمة لتوعية المستجيبات، أو الأهداف ذات الصلة بشكل كامل، مع مجموعة كاملة من جزيئات MHC أن تم توعية المستجيبات نحو. في بعض التجارب، وكنا CellTracker الفلورسنت الأحمر CMPTX أو تكاثر الخلايا صبغ eFluor 670 إلى التفريق بين الخلايا المستجيب والهدف. كنا أيضا التنبيغ مع ترميز ناقلات فيروسية لالبروتينات الفلورية وسيلة إضافية لتصور الخلايا. بالنسبة لبعض المقايسات، فإننا transduced في alloCTL مع ناقلات تتكاثر فيروسات (RRV) الترميز لالزمرد الأخضر (EMD) البروتين الفلوري 10،11. لأوراسكوم تليكوم القابضةالمتطلبات البيئية، تم transduced الخلايا السرطانية مع ناقلات lentiviral الترميز لmStrawberry.

تم المصنفة في alloCTL من خلال قناة من مشعب في مركز الورم إما الطبقات الوحيدة الخلية أو ECM تحصد من الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية. تم تصور ملتصقة وغير ملتصقة التفاعلات الخلية التي كتبها ضوء و / أو بواسطة المجهر مضان على مر الزمن. كانت اضطراب في أحادي الطبقة الخلية السرطانية في انخفاض القوة، أو ورم الخلايا مع نوى مجزأة في عالية الطاقة مؤشرات إصابة الخلية التي تحلل وموت الخلايا المبرمج، على التوالي. أنشأنا رقميا كثافة سطح خرائط الفلورسنت تبين هجرة الخلايا T الاستشعاع غير ملتصقة على الثقافات أحادي الطبقة. لاحظنا أيضا أفرز السمسة إلى ملتصقة أحادي الطبقة خلية الورم بعد تشكيل مجموعة من alloCTL غير ملتصقة مضافين. كذلك، لوحظ التنبيغ الأفقي للRRV-EMD من alloCTL إلى أحادي الطبقة بالورم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الشريحة التحضير

  1. إدراج الترسيب خلية الشرائح المنوع في الحقائب التعقيم وختم الشريط مع الأوتوكلاف. مواجهة الجانب تفلون المغلفة للانزلاق على جانب ورقة من الحقيبة لتجنب الودائع من البلاستيك على الآبار.
  2. الحقائب الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
  3. إزالة الشريحة من التعقيم الحقيبة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ومكان في العقيمة 150 × 15 مم طبق بتري معقمة. ما يصل إلى أربعة شرائح يمكن أن يصلح لكل طبق. وضع 35 × 10 مم طبق بتري بجانب الشرائح. إضافة 2-3 مل من H 2 O معقمة لتوفير الترطيب.
  4. الشرائح قبل معطف مع بولي-D-يسين بمعدل 100 ميكروغرام / مل باستخدام حجم ما يكفي لتغطية كامل أيضا. بعد ساعة واحدة على RT، نضح الحل وشطف سطح مرتين جيد من قبل pipetting برنامج تلفزيوني 1X على سطح الآبار.
  5. اختياريا، إضافة فبرونيكتين أو مكونات ECM أخرى لضمان أقوى الخلايا السرطانية الالتزام. إضافة فبرونيكتين في 5 ميكروغرام / مل في ما يكفي من حجم ثار الآبار سوف لا تجف في غضون فترة قصيرة من الزمن في RT.
    1. بعد 1 ساعة، نضح الحل بقايا ويغسل مرتين من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع برنامج تلفزيوني 1X.
  6. الحفاظ PBS على الآبار حتى الورم جاهز للطلاء. استخدام الشرائح في نفس اليوم.
  7. حصاد قارورة متكدسة من ملتصقة نوع من الخلايا السرطانية المطلوب. عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق صبغ استبعاد بواسطة المجهر الضوئي و resuspend في 5 × 10 6 خلية / مل في مخزنة على نحو كاف للنمو سبيل المثال المتوسطة ل، Dulbecco والحد الأدنى من المتوسط ​​ضروري (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، L- الجلوتامين والبيروفات الصوديوم.
  8. إذا كان المطلوب تصوير الفلورسنت من السكان خلية ملتصقة، تسمية السكان الخلية ملتصقة مع صبغة الفلورسنت حيويا أو صبغة تكاثر الخلايا عن طريق اتباع بروتوكولات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
  9. ماصة بسلاسة 10 ميكرولتر من المتوسطة الكامل في كل بئر من الرعاية الشريحة باتخاذها لتجنب خلق فقاعات في أهلا وسهلاليرة سورية، وهذه يمكن منع موحد الالتزام الخلايا السرطانية.
  10. إضافة 2،5-5،0 × 10 4 خلايا (5-10 ميكرولتر من تعليق خلية) إلى متوسطة في كل بئر (الشكل 1A). ضبط العدد الأمثل اعتمادا على نوع من الخلايا السرطانية وعدد الأيام من النمو المنشود. الخلايا السرطانية أكبر أو الخلايا السريعة النمو قد تتطلب خلايا أقل في البداية. جلب حجم جيدا ما يصل إلى 40 ميكرولتر بإضافة المتوسطة وماصة صعودا وهبوطا لضمان حتى التوزيع من الخلايا.
  11. بعد كل الآبار هي المصنفة، تسمح للخلايا السرطانية أن تلتزم في RT، ثم وضع غطاء على طبق بتري 150 × 15 ملم وبعناية يتحرك الطبق إلى حاضنة مرطب 37 ° C / 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة على الأقل.
  12. تغيير ثقافة المتوسط ​​يوميا. ماصة بعناية جزء من المتوسط ​​أمضى من أحادي الطبقة المتوسطة واستبدالها مع كامل الطازجة.
    ملاحظة: بسبب التبخر، وسوف تحتاج أكثر من وحدة التخزين التي يمكن ان تضاف مما كان يؤخذ بها. سوف آبار تكون جاهزة للفحص عند حتى، conflطبقة uent الخلايا موجودة. هذا هو عادة بعد 1-3 أيام بذر الأولي.
  13. يغسل مرة واحدة أحادي الطبقة بلطف مع PBS كما هو موضح في الخطوة 1.4 و إما انتقل إلى الخطوة 2 إذا رغبت الطبقات الوحيدة، أو إلى الخطوة 1.13 أدناه لاستخراج البروتينات ECM من أحادي الطبقة.
  14. جعل 0.5٪ تريتون-X (ت / ت) حل في المتوسط ​​كاملة وإضافة 30 ميكرولتر إلى كل بئر. السماح أحادي الطبقة هضم في غطاء محرك السيارة لمدة 2 دقيقة، ثم يغسل مرتين مع المتوسطة كاملة من قبل pipetting كما هو موضح أعلاه.
    ملاحظة: قد تكون طبقة ECM مرئية بواسطة المجهر الضوئي (الشكل 2). استخدام الشرائح على الفور، أو الاحتفاظ بها في المتوسط ​​كاملة في ترطيب CO 2 الحاضنة لمدة 1-2 أيام. لا تسمح الآبار لتجف.

2. الترسيب للخلايا T غير ملتصقة على الشريحة

  1. إذا كان المطلوب تصوير الفلورسنت من السكان الخلايا غير ملتصقة، تسمية السكان الخلية غير ملتصقة مع صبغة الفلورسنت الحيوية، مثل CFSE، خلية المقتفي الأحمر CMPTX، أو eFluor670 باتباع بروتوكولات المقدمة من قبل الشركة المصنعة لا يقل عن 1 ساعة قبل الفحص. بدلا من ذلك، والتلاعب خلايا للتعبير عن البروتينات الفلورية المشفرة بواسطة ناقلات فيروسية.
  2. الأوتوكلاف مشعب الترسيب خلية في الحقيبة الأوتوكلاف كما هو موضح في 1.2 أعلاه.
  3. إزالة غرفة ترطيب تحتوي على الشرائح تفلون المغلفة من الحاضنة ومكان في خزانة السلامة البيولوجية.
  4. غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني 1X قبل pipetting صعودا وهبوطا، ثم إضافة 45 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة تحتوي على 10٪ على الأقل المصل.
  5. إزالة متعددة من المغلف التعقيم والشريحة بعناية في أكثر من الآبار حتى "هوك" في نهاية مشعب تلامس أسفل الشريحة (الشكل 1B).
  6. تأكد من أن مستنبت مرئيا في كل من القنوات. إذا رأيت أحدا، خلع متعددة وإضافة المزيد من متوسطة إلى المقابلة جيدا، ثم استبدال والتحقق مرة أخرى.
  7. كرر الخطوة 2.5 لكل تشاننيل من مشعب، أو العديد من الآبار كما تريد.
  8. عدد الخلايا غير ملتصقة و resuspend في ما لا يقل عن 1.0-2.0 × 10 5 / ميكرولتر. وضع 1 ميكرولتر من الخلايا وببطء ماصة لهم في قناة (الشكل 1C). هل كل هذا لالمرجوة بشكل جيد.
  9. ترك الخلية بأكملها جهاز تحميل، أي جوانب متعددة والشرائح، داخل غطاء محرك السيارة الحيوي لمدة 20-30 دقيقة للسماح للخلايا في القناة ليستقر.
  10. إزالة متعددة عن طريق لمس طرفي ورفعه على التوالي من الشريحة حتى لا تعكر صفو خلايا المصنف الوزراء البريطانى في وسط الآبار (الشكل 1D) بلطف.
  11. تفقد كل بئر لضمان أن الخلايا غير ملتصقة تم المصنف بنجاح في مركز البقاء البئر داخل محيط القناة المتعددة. فإن الخلايا غير ملتصقة بشكل مثالي تلتزم قليلا إلى أحادي الطبقة أو ECM ومع بعضها البعض، وبالتالي تتحرك بلطف الشريحة في جميع أنحاء لن يتسبب في بيلي خليةر لتفريق. لا تصدم الشريحة.

3. المجهر مضان

  1. مع المعدات التجريبية المناسبة، نفذ التصوير بعد تأكيد الترسيب. ومن الناحية المثالية، واستخدام المجهر التي هي مجهزة تجهيزا مع غرفة CO 2 والرطوبة. صورة في الطاقة المنخفضة، أي 4X أو 10X، للسماح للصور متعددة الواجب اتخاذها من مساحة أكبر بحيث يمكن أن ينظر إلى مجمل البئر.
  2. الحصول على صور رقمية باستخدام التقاط الصور البرمجيات. أداء brightfield و / أو متعدد القنوات التصوير مضان.
  3. إذا رغبت في ذلك، وإنشاء الفاصل الوقت لتسجيل الصور في قنوات مختلفة على منطقة معينة، أو الاحتفاظ الشريحة ترطيب وفي / 5٪ CO 2 حاضنة 37 درجة مئوية ويدويا إخراج لصورة عند نقاط الوقت المطلوب (الشكل 1E & F، وأوصت لنقطة زمنية أطول).

4. التحليل والعرض

  1. باستخدام برامج تحرير الصور، دمج الضوء وفلوريداويمكن رؤية الصور uorescent إلى أنواع الخلايا طبقة واحدة متعددة بحيث وعلامات في نفس الصورة. سحب وإسقاط الملفات على الصورة لعرض كل لون على حدة في البرنامج، وعند المطالبة، حدد الخيار "إضافة طبقة" لإنشاء ملف صورة مع طبقات متعددة.
    1. في أعلى التكبير، واتخاذ، محاذاة، وغرزة معا الصور عبر البئر رقميا. محاذاة الملفات من خلال النظر في المناطق الحفظ بين اثنين من الصور وتتراكب صورة واحدة على رأس الآخر حتى يتم إنشاء صورة كاملة.
  2. إضافة أشرطة ميكرون إلى صور خلال الاستحواذ باستخدام برنامج التقاط لتحديد المسافة هاجروا الخلايا الفردية.
  3. لتحديد الهجرة الخلية في أوقات مختلفة، وجعل خرائط كثافة سطح مضان مع برنامج صورة، أي يماغيج، لقياس الفلورسنت تجميع الخلايا T أو نشر على مر الزمن.
    1. لتوليد المؤامرات السطح، وتأخذ صورة الطبقات إنشاؤها في الخطوة 4.1 وتحت نافذة الطبقات،إلغاء جميع الطبقات ما عدا تلك المقابلة إلى القناة المطلوبة. على سبيل المثال، إذا كان المطلوب مؤامرة سطح لتصور EMD التعبير، يجب فقط الطبقات الخضراء المقابلة لتصفية المستخدمة لهذه العلامة تكون مرئية.
    2. تتسطح الصورة وحفظه في تنسيق ملف معترف بها (على سبيل المثال، بابوا نيو غينيا) وتحميل الصور إلى البرنامج. لتوليد مؤامرة السطح، تغيير نوع الصورة ل8 بت، تغيير السطوع / التباين حسب الحاجة للحد من الخلفية، وحدد الخيار "تحليل قطعة أرض / سطح". وقد تم توليد الصور في الشكل 5 عن طريق التحقق من "الظل '،' رسم المحور '،' المضلع واحدة لكل خط، وخانات" السلس ".
    3. بدلا من ذلك، أخذ قياسات باستخدام نصف قطر أو القطر من إيداع خلية التنسيق في وقت الصفر وقارن بين الخلايا في أبعد نقطة في أوقات مختلفة. قطر تفلون الآبار هو 6.0 ملم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النواقل الفيروسية ترميز لالبروتينات الفلورية يمكن استخدامها بالإضافة إلى، أو بدلا من صبغة الفلورسنت. يجب أن يتم تنفيذ تنبيغ الفيروسية في وقت سابق للفحص الحركة. كل من أنواع الخلايا الملتصقة وغير ملتصقة يمكن أن توصف بشكل مختلف. سوف بروتوكول لالتنبيغ تعتمد على نوع من ناقلات المستخدمة. هنا، فإننا transduced في alloCTL في أرقام 3 و 5 و 6 مع RRV-EMD يومين على الأقل قبل الفحص باستخدام بروتوكول صفها 12. كنا أيضا ناقلات lentiviral، CMV-الفراولة-IRES-FLUC2، لتنبيغ الخلايا السرطانية للتعبير عن mStrawberry البروتين الفلوري الأحمر (الشكل 4). وقد أنجز هذا التنبيغ بإضافة ناقلات إلى قارورة من الخلايا لمدة 48 ساعة، وعند هذه النقطة، تم إضافة المتوسطة الطازجة. بعد السماح للخلايا لاسترداد لمدة يومين، والحد من التخفيف أجريت لتوليد يبلغ عدد سكانها 100٪ خلايا transduced.

"jove_content"> قدمت alloCTL الإنسان مع مشجعا المعطل 13-06-MG خلايا الورم الخبيث الإنسان من قبل MLTR. وalloCTL ثم تم transduced مع الترميز RRV لEMD (RRV-EMD) والمصنف في وقت لاحق إلى وسط الطبقات الوحيدة المعمول بها خلايا الورم U-87MG مع جزئية MHC مباراة إلى 13-06-MG (أرقام 3 و 5). المجهري الإسفار معارض الخلايا المصنفة في البداية في مركز البئر، تهاجر بعيدا عن المركز مع مرور الوقت. تشكيل alloCTL المجاميع بعد 4 ساعات (الشكل 3، السهام البيضاء) هي تعكس على الأرجح من أنماط النمو autocrine التي أظهرتها تفعيلها، IL-2-إنتاج T السكان الخلية 13.

في تجربة أخرى، أدلى المستجيب الفئران alloCTL من قبل في اتجاه واحد MLR باستخدام النمط الفرداني-H 2D BALB / ج splenocytes الرد والنمط الفرداني H-2B / ك splenocytes مشجعا من الفئران B6C3F1، ​​السلالة التي تكون دبقي TU-2449 هو مسانج. مباشرة قبل البذر عبر قناة تيانه المنوع على أحادي الطبقة الخلية السرطانية، كانت ملطخة alloCTL مع eFluor 670. وalloCTL (خلايا البنفسجية) والمصنف في وسط الطبقات الوحيدة المعمول بها خلايا الورم TU-2449 (الحمراء) التي كانت 100٪ transduced مع CMV-Straw- IRES-FLUC2 ناقلات فيروسية، ومطلي على الآبار قبل يوم الفحص. 4A الشكل وباء عرض الصور المجهرية التي اتخذت من نفس الربع من نفس البئر في 1 و 48 ساعة. تم إنشاؤها الشكل 4C وD باستخدام يماغيج لتحويل مضان الأرجواني رقمية شدة إلى قطع السطح الكمية التي يتم عرضها في شكل ثلاثي الأبعاد.

وأخيرا، أدلى alloCTL البشرية مع خلايا الدماغ استوائية الإنسان مشجعا المعطل المستمدة من النقيلي خط خلية الورم الثدي MDA-MB-231BR التي كتبها MLTR الشكل 6 يظهر الضوء والمجهر مضان الصور مع مرور الوقت من غير ملتصقة CMPTX المسمى alloCTL، جزئيا transduced مع RRV-EMD، المهاجرة على البروتينات المستخرجة ECM وROM تلك الخلايا السرطانية. في (A) تظهر صورة مجهرية الحقل مشرق وضع البؤري للalloCTL مباشرة بعد الترسيب. في (B و F) تظهر photomicrographs الحقل مشرق، في 4 و 8 ساعة، على التوالي، alloCTL المهاجرة شعاعيا على ECM. يقلل من كثافة alloCTL مع المسافة من وسط البئر (مركز البئر أعلى الزاوية اليسرى من الحقل في BI). لوحات (C و G) المعرض إعداد alloCTL كامل ملطخة CMTPX، (D و H) تظهر التنبيغ الجزئي للalloCTL مع RRV-EMD كما يتبين من أعداد صغيرة من الخلايا EMD + T، و (E و I) تظهر الصور المدمجة من RRV-EMD transduced alloCTL المهاجرة على ECM مع alloCTL untransduced.

الشكل (1)
عملية الترسيب الشكل 1. خلية. (A) ويلز التي يجري إعدادها لالترسيب، (B) مشعب الترسيب خلية وضعها على شريحة، (C) الخلايا الليمفاوية المستجيب غير ملتصقة يجري تحميلها في مشعب، (D) الإزالة اليدوية لل مشعب الترسيب خلية، (E) غرفة الرطوبة، (F) الشرائح وضعه في حاضنة مرطب. يستخدم هذا الرقم بإذن حقوق الطبع والنشر العلمي من العمل الإبداعي (http://www.creative-sci.com/). انقر هنا للحصول على نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. ورم الطبقات الوحيدة الخلية وECM مطلي على الآبار الشريحة CSM. Photomicrographs من الآبار الشريحة أعدتمع (A) متكدسة U-87MG الطبقات الوحيدة خلية الورم، أو البروتينات (B) ECM المستخرجة من متكدسة U-87MG ملطخة Coomassie صبغة زرقاء. شريط = 200 ميكرون. انقر هنا للحصول على نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الهجرة وسمية الخلايا من RRV-EMD الخلايا الليمفاوية transduced في المركز وحافة الرائدة في مجال إيداع الخلايا مع مرور الوقت. photomicrographs الفلورسنت التي اتخذت في أوقات مختلفة على حافة الرائدة وفي مركز alloCTL-RRV-EMD التالية الترسيب على أحادي الطبقة من الخلايا دبقي U-87MG ملتصقة. المصنف المستجيب alloCTL كما الخلايا واحد، تشكل عناقيد كروية ضمن 4 ساعة (السهام البيضاء) الإيداع. فقد هاجر واحد CTL-fluorescently المسمى من وسط البئر لحان الوقت تقدم. بعد 24 ساعة، والبقع خلية فارغة في أحادي الطبقة ملتصقة مرئية يفترض بسبب alloCTL انحلال خلوي من الخلايا المستهدفة الورم (انظر منطقة داخل شرطات). شريط = 200 ميكرون. انقر هنا للحصول على نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. شعاعي هجرة alloCTL الفئران ملطخة eFluor 670 على خلايا الورم mStrawberry المسمى عرضه في 1 و 48 ساعة. photomicrographs الفلورسنت من رباعي واحد من نفس البئر في (A) 1 ساعة و (B) 48 ساعة بعد الترسيب من fluorescently -labeled alloCTL غير ملتصقة على أحادي الطبقة من الخلايا دبقي TU-2449. تعكس photomicrographs طاقة منخفضة المنطقة الواردة في رباعي واحد من CSM جيدا (دائرة نصف قطرها 3 مم). في الطاقة العالية (A و B، إدراجات) ألووتظهر CTL (السهام البيضاء) في القرب أو المرتبطة الخلايا السرطانية الفردية؛ واحد لديه مظهر تفككت مع نوى مجزأة وغير أفكارك. (C و D) سطح كل منها خرائط كثافة مضان التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج يماغيج يظهر القيم بكسل للصور الفلورسنت الأرجواني الرقمية في شكل رسوم بيانية ثلاثية الأبعاد وضعت على شبكة يمثلون نصف قطرها جيدا 3 مم. شريط = 500 ميكرون. انقر هنا للحصول على نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. هجرة alloCTL وانتشار الأفقي للRRV-EMD من alloCTL transduced إلى الخلايا السرطانية. photomicrographs الفلورسنت متسلسل مخيط معا لتغطية نصف قطرها من البئر باستخدام برامج تحرير الصور. هجرة RRV-EMD transducedويظهر alloCTL (السهام البيضاء) على أحادي الطبقة من الخلايا السرطانية U-87MG في 0 و 72 ساعة التالية الترسيب. RRV-EMD تنبيغ الخلايا السرطانية في أحادي الطبقة هو أيضا واضح في 72 ساعة بعد إضافة alloCTL EMD transduced، مشيرا إلى أن انتقال الأفقي للRRV عدوى من الخلايا الليمفاوية إلى خلايا الورم قد حدث (مربع أبيض، وأقحم). شريط = 200 ميكرون. انقر هنا للحصول على نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. شعاعي هجرة alloCTL transduced مع RRV-EMD وملطخة CellTracker الأحمر CMTPX. تم الرسوبية الخلايا على مقتطفات ECM المستمدة من الخلايا MDA-MB-231BR. تم تصوير هجرة alloCTL من قبل مشرق مجال المجهر الضوئي في 0، 4 و 8 ساعة (A، B، F العمود 1، على التوالي). Fluoreصور رائحة CMPTX (أحمر) وصفت alloCTL (C، G، العمود 2)، وRRV-EMD (الأخضر) transduced alloCTL (D، H، العمود 3)، والصور المدمجة (E، I، العمود 4) هم يعرض في 4 و 8 ساعة. الحانات = 200 ميكرون. شريط هو مبين في B ينطبق على الصور CI. انقر هنا للحصول على نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم pipetted الخلايا السرطانية في تعليق خلية واحدة في الآبار من الشريحة ملثمين تفلون. سمح للخلايا التمسك ومن ثم تشكيل الطبقات الوحيدة في ترطيب 5٪ CO 2، 37 ° C الحاضنة (الشكل 1A). الطبقات الوحيدة التي أنشئت أو البروتينات ECM المستمدة من أحادي الطبقة يمكن أن تحصد لهذه المقايسات (الشكل 1B). وكانت المصنفة الخلايا الليمفاوية التائية المستجيب المسمى مع الأصباغ الفلورية الحيوية أو transduced مع ناقلات ترميز لEMD في وسط البئر باستخدام CSM. قدرة غير ملتصقة الخلايا الليمفاوية التائية المستجيب للهجرة على أحادي الطبقة أو ECM البروتينات مع مرور الوقت ثم تم تقييمها وكميا مع الضوء والمجهر مضان. هنا، قمنا بتقييم هجرة وسمية الخلايا من المستجيب غير ملتصقة alloCTL على أحادي الطبقة من الهدف جزئيا ذات الصلة خلايا U-87MG دبقي (أرقام 3 و 5). هذه الخلايا المستهدفة، وعرض فقط بعض من خلايا الدم البيضاء مستضد الإنسانواستخدمت (HLA) جزيئات (HLA-A2، B44) وجدت على التحفيز والتشجيع الأصلية، للحد من النشاط التحللي قوية التي سيتم عرضها من قبل alloCTL إلى الخلايا المستهدفة 13-06-MG ذات الصلة (HLA-B44 A1،2 و ، 57). نحن أيضا لاحظت التنقل من alloCTL على ECM تحصد من أحادي الطبقة من MDA-MB-231BR الخلايا السرطانية الثدي (الشكل 6). تم إنشاء alloCTL من قبل في اتجاه واحد MLTR وفقا للأساليب المنشورة سابقا 9. كانت تحصد المستجيب alloCTL 4-5 أيام بعد في اتجاه واحد MLTR وtransduced مع RRV-GS4-EMD (أرقام 3 و 5) أو RRV-ACE-EMD (الشكل 6) 10،11. وقد حققت مستويات أعلى التنبيغ مع ناقلات GS4 الاستفادة من القرد سرطان الدم المغلف فيروس جيبون من مع ACE ناقلات amphotropic. باستخدام هذا الاختبار الهجرة شعاعي، لاحظنا أن كلا transduced وnontransduced كان fluorescently المسمى-alloCTL قدرة المهاجرة. علينا أن نظهر أيضا أنها تحتفظ قدرتها على أن CYTotoxic بعد خضوعه التلاعب لRRV التنبيغ.

قدرة alloCTL الفئران إلى الهجرة وأيضا تقييم (الشكل 4). alloCTL توعيتهم النمط الفرداني H-2B / ك المعروضة من قبل خلايا TU-2449 كانت ملطخة مع eFluor 670 (اللون الأرجواني) وتم إجراء فحص الهجرة باستخدام TU-2449 transduced مع CMV-سترو-IRES-FLUC2 (الحمراء). عند استخدام المستهدفة ذات الصلة تماما، وكانت المصنفة عدد أقل من خلايا المستجيب alloCTL لمنع تحلل السريع للأهداف الخلية السرطانية. باستخدام 1 ساعة كأساس، يتم ترجمة خلايا T إلى حد كبير في ارتفاع الكثافة في وسط كذلك تعليق خلية واحدة. وتظهر الميكروسكوب ساعة 48 الهجرة واسعة من الخلايا T نحو الحافة الخارجية من البئر وتجميع وalloCTL غير بادية للعيان مع تدمير الخلايا السرطانية في موقع إيداع الأولي. ويتجلى انتشار الخلايا TU-2449 باسم mStrawberry زيادة الخلايا المسمى في كثافة على البئر. هذا هو ينظر على نحو أفضل في السطحالمؤامرات مضان التي تم إنشاؤها لتصور توزيع خلايا الأرجواني في الآبار (الشكل 4، اللوحة السفلية). AlloCTL التنقل هو أكثر وضوحا بكثير في البئر في 48 ساعة مقارنة بخط الأساس 1 ساعة. على غرار ما كان ينظر في المقايسات باستخدام خلايا alloCTL ودبقي الإنسان، وإزالة الخلايا السرطانية في جميع أنحاء المنطقة إيداع الأولي من المستجيبات الملاحظ في 48 ساعة، مما يدل على تحلل الخلايا المستهدفة الورم.

خطوة حاسمة في هذا الاختبار هي نمو الطبقات الوحيدة صحية والحصاد لاحق من ECM "الهيكل العظمي". البذر من الخلايا السرطانية في 2،5-5،0 × 10 4 خلايا لكل بئر، وفقا إلى الخطوة 1.9 أعلاه، أسفرت عادة في حوالي حتى أحادي الطبقة لأنواع الخلايا السرطانية كنا. وجدنا أنه من الضروري للسماح للخلايا السرطانية أن تلتزم في RT، وإلا فإن الحمل الحراري الذي يحدث عند 37 درجة مئوية ودفع الخلايا نحو وسط الآبار. كذلك، ما قبل طلاء واي الآبارال بولي-D-يسين و / أو البروتين ECM مثل فبرونيكتين أو الكولاجين ويمكن زيادة كبيرة في معدل النجاح. بالإضافة إلى ذلك، كان لدينا أفضل النجاح مع هذه المقايسات باستخدام المستمدة أحادي الطبقة ECM "الهيكل العظمي" من مع مكونات ECM الفردية (أي.، فبرونيكتين، والكولاجين)، والتي ثبت أقل موثوقية من ذلك بكثير. ومن المهم أن التجربة مع عدد الخلايا غير ملتصقة على أن تودع من خلال مشعب الترسيب كذلك، وإذا باستخدام نوع من الخلايا النقي، يمكن للمرء أن يكون نظريا قادرة على تحديد معامل الحركة مع هذا الاختبار. لأن الصوت جيدا صغير ويحدث بعض تبخر المتوسطة، تحتاج أحادي الطبقة أن تتجدد يوميا مع المتوسطة الطازجة. استبدال وسائل الإعلام كما يمنع تراكم اللاكتات السامة مثل الخلايا تنمو والانقسام. يمكن فشل لزراعة أحادي الطبقة صحية تؤدي إلى سفك أحادي الطبقة أو ECM من السطح جيدا.

وCoomassie الزرقاء البروتينات ECM الملون المستمدة من U-87MG لى خلية دبقيشمال شرق وفقا إلى الخطوة 1.13 والمبينة أعلاه كمثال البصري للطبقة الركيزة ملتصقة تركت وراءها بعد الهضم مع تريتون X-100 (الشكل 1B). في كثير من الأحيان كان إنتاج ECM من خط خلية سرطان الثدي، والخلايا MDA-MB-231BR، غير مكتمل ورقيقة، مما أدى إلى طبقة ECM التي كانت أكثر تمسكا سيئة ورفع أحيانا من الشريحة أثناء الفحص. تحسين الالتزام بروتين ECM إلى الشريحة عندما كان مسك الخلايا السرطانية كما الطبقات الوحيدة متكدسة لمدة 1-2 أيام قبل الهضم. في جميع مراحل العملية، كانت المحافظة على ختم تفلون المحيطة البئر مهمة أيضا. الحفاظ على وحدة التخزين منخفضة والتقليل من التعرض للتفلون إلى حل تريتون-X100 التخفيف من الأضرار التي لحقت سلامة ختم تفلون.

التكيف واحدة من هذا البروتوكول قد يكون استخدام المصفوفة خارج الخلية الأبعاد الثلاثة التي تحصد من أقسام OCT جزءا لا يتجزأ من نسيج الورم 14. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن المسافة من قوارير شقةاوميد البئر إلى السطح الشريحة هو فقط 1 مم؛ وبالتالي، أقسام تتجاوز هذا سمك قد تعطلت بسبب وضع متعددة. أيضا، ستحتاج طريقة لوضعها لصنع ثقب لدغ طفيف في الأنسجة لقبول قطرة من المتوسط ​​تحتوي على خلايا غير ملتصقة.

كان إعداد تعليق خلية واحدة فرقت جيدا من الخلايا الليمفاوية التائية المستجيب في وقت مبكر من الترسيب الضروري أيضا. كان tituration طيف من الخلايا T غير ملتصقة لتفريق المجاميع إلى تعليق خلية واحدة خطوة أساسية الحق قبل تحميل alloCTL في القنوات من CSM. ينبغي استخدام استخدام غير الأنزيمية مخازن تفارق خلية إذا لزم الأمر. وعلاوة على ذلك، يجب أن تكون كثافة الخلايا الليمفاوية المستجيب حول 1،0-2،0 × 10 5 خلية / ميكرولتر للترسيب، كما هو موضح في الخطوة 2.8 أعلاه. أرقام الهواتف المحمولة منخفضة قد يؤدي إلى عدم الترسيب، في حين يمكن أن أعداد الخلايا أعلى يسبب وديعة كبيرة التي هي سهلة لتعطيل عند تحريكالشريحة. ويوصى أيضا أن تركيز مصل الدم في المتوسط ​​يكون 10٪ على الأقل لتوفير التوتر السطحي الكافي للالغضروف المفصلي الإيجابي الذي يقلل من احتمال امتداد.

مجهر الضوء المعكوس مع قدرات التصوير مضان و4x أو 10X الأهداف هو الأمثل لهذا الاختبار. نقاط الوقت للتصوير يمكن تحديد وفقا لاستفسارات التجريبية الفردية وأنواع الخلايا. وCTL غير ملتصقة على وجه الخصوص الهجرة من وسط الترسيب نحو حافة البئر بسرعة أكبر على البروتينات ECM (4-8 ساعة) من خلال أحادي الطبقة الخلية (12-72 ساعة). جزئيا كانت الخلايا المستهدفة MHC ذات الصلة أفضل من الأهداف ذات الصلة لفحص alloCTL جهدنا لتشجيع تصور الحركة وتقليل انحلال خلوي بوساطة خلية من الطبقات الوحيدة قبل أن تحدث هجرة كبيرة. استخدام من المستجيب منخفضة لاستهداف نسبة أيضا تباطؤ تحلل. استخدام أهداف يقابل جزئيا يسمح لتصور أفضل للRRVانتقال إلى الخلايا السرطانية أيضا.

استخدام مجهر مقلوب يتيح مزايا متعددة على مدى نطاق تستقيم. على نطاق مقلوب يسمح للتصوير من خلال غرفة ترطيب بحيث الشرائح لا يجب أن يكون مضطربا، مع الحفاظ أيضا بيئة معقمة للخلايا. أيضا، والتصوير من خلال غرفة يوفر حاجزا بين العينة وفني، والسماح للانضمام إلى مستوى السلامة الحيوية II (BSL II) المبادئ التوجيهية عند العمل مع المشتقة من الأنسجة البشرية 15.

إذا باستخدام نطاق تستقيم، وهو أعلى التكبير يمكن تحقيقه من دون إزعاج الغضروف المفصلي إيجابي من البئر 20x و. للأسف، واستخدام ساترة، أو الملحقات عدة البصريات لمشعب الترسيب الخلية، فمن غير المستحسن، حيث أن اختلال في الغضروف المفصلي النتائج عادة في انتشار الخلايا غير ملتصقة الرسوبية في جميع أنحاء البئر. التصوير على مدى فترات طويلة من الزمن قد تتطلب بالإضافة متأنية لميدالبوتاسيوم إلى كل بئر لتحل محل التي فقدت التبخر، على الرغم من أن هذا هو أكثر من المحتمل أن تكون هناك حاجة خلال الوقت الفاصل بين التصوير.

هذا البروتوكول هو واضح من الأساليب التي تقيس هجرة الخلايا الأفقية من الخلايا الملتصقة في زيجموند غرف 16،17، فإن تصميم والتي لا تسمح لتصور للهجرة الخلايا غير ملتصقة. وتستخدم المقايسات الأخرى التي تقيم الهجرة الأفقية نحو الانحدار الانجذاب الكيميائي من خلال الركيزة مثل أجار عموما لدراسة الهجرة من نوع خلية واحدة 18-20. استخدام CSM يوفر مزايا عديدة لهذه الأساليب، وكذلك الأساليب التي قياس الرأسي الهجرة / غزو الخلايا المستزرعة، مثل في غرف بويدن أو لوحات transwell Matrigel. أولا، اتصال خلية خلية يسمح لتحديد المستهدفة المستجيب تفاعل الخلايا وإصابة من قبل خلايا المستجيب. القدرة لحل الخلايا من alloCTL-RRV-EMD حفز في البداية من قبل في اتجاه واحد MLTR مع مشجعا 13-06-MG الخلايا السرطانية إلى حزب حليف MHC يقابل خط خلية U-87MG هو واضح في وسط أحادي الطبقة في 24 و 72 ساعة بعد الترسيب (أرقام 3 و 5، بدد خطوط). كذلك، وتدهور خلايا TU-2449 بواسطة alloCTL الفئران مرئيا في 48 ساعة بعد الترسيب (الشكل 4). هو طمس أحادي الطبقة في مركز alloCTL الودائع، ولكن يحدث ببطء أكثر خلال الفترة المتبقية من أحادي الطبقة، إما بسبب التداخل في HLA التعبير عن 13-06-MG وU-87MG في المقايسات مع الخلايا البشرية 21 أو أدنى بدءا عدد الخلايا المستجيب للدبقي الفئران. أيضا، يتم تقليل المستجيب لاستهداف الكثافة مثل المستجيب alloCTL تهاجر بعيدا عن موقع الترسيب. بالإضافة إلى الهجرة وانحلال خلوي، وهذا البروتوكول يمكن استخدامها لتصور نقل الترميز فيروس البروتينات الفلورية. هنا، ونقل RRV الترميز لEMD من alloCTL إلى الخلايا السرطانية هو واضح بعد 72 ساعة (الشكل 5، أقحم).

الطبقة = "jove_content"> وCSM تم تصميم مناسب لفحص التنقل الخلايا غير ملتصقة على الخلايا الملتصقة. تصميم انها سمحت لأقل قدر من الاضطراب من الخلايا غير ملتصق مع أحادي الطبقة خلية ملتصقة عندما تم إزالة متعددة. بالإضافة إلى ذلك، ملثمين وسط الترسيب داخل تفلون الشريحة هي متطابقة في كل بئر من مشعب السماح لخفض التباين بين مكررات التجريبية. ومع ذلك، خيارات أخرى مثل اسطوانات الزجاج والخواتم الاستنساخ، أو أجهزة تشكيله أخرى يمكن التحقق من صحة لغرض مماثل.

وجود قيود من هذا النموذج هو أن الهجرة لا يمكن تقييمها في المختبر، والتي قد لا يكون معبرا حقا عن الهجرة في الجسم الحي. الحد آخر هو أن التدرجات chemokine / مستقبلات chemokine لا يمكن أن تنشأ باستخدام هذا النموذج. بينما تفاعلات الخلايا المناعية مع ECM أو الخلايا السرطانية الفردية قد لا تزال تحدث ويعتمد على ما تفرز هذه الخلايا أو التعبير، وهذا حركية الحمارسوف المنعم يوسف لا إجابة على الأسئلة حول ما إذا كانت الخلايا غير ملتصقة سوف تهاجر خصيصا لأو بعيدا عن العوامل معزولة.

ميزة من هذا الاختبار هو القدرة على تحديد ما إذا كان السكان من الخلايا غير ملتصقة الحفاظ على وظائف المهاجرة إذا كانت الخلايا الليمفاوية لها أو لم يتم transduced. في مثالنا، حيوانية transduced مرئيا من خلال EMD البروتين التعبير، وأنه من الواضح أن وظيفة المهاجرة يتم الحفاظ في هذه حيوانية. قد يكون تطبيق أوسع لاختبار تأثير تركيزات مختلفة من وكلاء أو الأدوية التي قد تؤثر غير ملتصقة هجرة الخلايا المناعية. أيضا، قد يتم اختبار الخلايا المكونة للدم أخرى للتنقل على ركائز مختلفة أو الخلايا الملتصقة المستمدة من الأنسجة الطبيعية. وأخيرا، على الرغم من أنه لم يتم ذلك هنا وزرع البذور مزيج من أنواع الخلايا الملتصقة، أي الخلايا اللحمية أو الخلايا الجذعية مع الورم، يمكن أن توفر تحليلات يعكس أكثر تعقيدا في بيئات الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

بدعم جزئي من المعاهد الوطنية للصحة R01 CA121258، R01 CA125244، R01 CA154256، NIH / NCATS UCLA CTSI غرانت عدد UL1TR000124، USAMRMC W81XWH-08-1-0734، وصندوق جوان S. هولمز التذكاري للبحوث. MJH وبطاقات المعايدة الواردة معتمد من زمالة ما بعد الدكتوراه التذكارية جوان S. هولمز في جامعة كاليفورنيا. تم الحصول على الجهاز CSM من الأساليب العلمية الإبداعية: www.creative-sci.com. وكان في استقبال ناقلات lentiviral من جامعة كاليفورنيا المتجهات الأساسية، الذي تدعمه CURE / P30 DK041301.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Teflon-masked microscope slides Creative Scientific Methods CSM002
Cell Sedimentation Manifold Creative Scientific Methods CSM001
Petri Dish, 150mm Corning 430597
Petri Dish, 35mm Corning 430588
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Mediatech 21-040
20 μl Pipetman Gilson F123600
200 μl Pipetman Gilson F123601
200 μl pipette tips VWR 89003-060
Distilled, deionized water (sterile) Mediatech 25-055
Trypsin Mediatech 25-054-CL
Celltracker Red CMPTX Invitrogen C34552
TrypLE Express (optional) Gibco 12604
Tumor cell culture media (e.g. DMEM) Mediatech 10-013
AIM-V serum-free media Invitrogen 12055-083
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-02
Inverted microscope
SPOT Advanced Diagnostic Instruments
Poly-D-Lysine Millipore A-003-E
Fibronectin BD 354008
31/2 x 51/4 Autoclave Pouches Crosstex SCXS2
Trypan Blue Mediatech 25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670 eBioscience 65-0840-85
ImageJ NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
  2. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  3. Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
  4. Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
  5. Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
  6. Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
  7. Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
  8. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  9. Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
  10. Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
  11. Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
  12. Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
  13. Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
  14. Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
  15. Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
  16. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  17. Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
  18. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  19. Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
  20. Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
  21. Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).

Tags

علم المناعة، العدد 96، هجرة الخلايا غير ملتصقة، مضان المجهر، الترسيب خلية متعددة، وخيفي CTL، أحادي الطبقة، T الخلية، والمصفوفة خارج الخلية، gliom
شعاعي التنقل والسامة للخلايا وظيفة من فيروسات الرجعية تكرار ناقل Transduced، غير ملتصقة Alloresponsive T اللمفاويات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erickson, K. L., Hickey, M. J.,… More

Erickson, K. L., Hickey, M. J., Kato, Y., Malone, C. C., Owens, G. C., Prins, R. M., Liau, L. M., Kasahara, N., Kruse, C. A. Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (96), e52416, doi:10.3791/52416 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter