A continuación, presentamos un protocolo para cuantificar de forma continua adhesión celular y de-adhesión procesos con alta resolución temporal de una manera no invasiva por impedancia célula-sustrato y análisis de imágenes de células vivas. Estos enfoques revelan la dinámica de los procesos de adhesión celular / DE-adhesión desencadenados por modificación de la matriz y su relación temporal de los eventos de señalización de adhesión dependiente.
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Artículo de método
Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación
En este artículo
Resumen
Resumen
La adhesión célula-matriz desempeña un papel clave en el control de la morfología celular y la señalización. Los estímulos que interrumpen la adhesión célula-matriz (por ejemplo, mieloperoxidasa y otros oxidantes matriz modificar / enzimas liberadas durante la inflamación) están implicados en el desencadenamiento de cambios patológicos en la función celular, el fenotipo y la viabilidad en un número de enfermedades. Aquí se describe cómo impedancia de la célula-sustrato y enfoques imágenes de células vivas se pueden emplear fácilmente para cuantificar con precisión los cambios en tiempo real en la adhesión celular y de-la adhesión inducida por la modificación de la matriz (utilizando células endoteliales y la mieloperoxidasa como un estímulo matriz de modificadores de fisiopatológico) con alta resolución temporal y de una manera no invasiva. El sistema de impedancia de la célula-sustrato xCELLigence cuantifica de forma continua el área de la adhesión célula-matriz mediante la medición de la impedancia eléctrica en la interfase célula-sustrato en las células cultivadas sobre matrices de microelectrodos de oro. Análisis de imágenes de time-lapse diferencial películas de contraste de interferencia cuantifica los cambios en el área proyectada de las células individuales en el tiempo, que representa los cambios en el área de contacto célula-matriz. Ambas técnicas cuantificar con precisión los cambios rápidos en los procesos de adhesión celular y de-adhesión. Impedancia de la célula-sustrato sobre biochips microelectrodos proporciona una plataforma para mediciones robusto, de alto rendimiento. Imágenes de células vivas analiza proporcionar detalles adicionales con respecto a la naturaleza y la dinámica de los cambios morfológicos cuantificados mediante mediciones de impedancia célula-sustrato. Estos enfoques complementarios proporcionan valiosos nuevos conocimientos sobre cómo la modificación oxidativa catalizada por mieloperoxidasa de los componentes de la matriz extracelular subcelulares provoca cambios rápidos en la adhesión celular, la morfología y señalización en las células endoteliales. Estos enfoques son también aplicables para el estudio de la dinámica de adhesión celular en respuesta a otros estímulos matriz modificar y en células adherentes relacionados (por ejemplo, células epiteliales).
Introducción
Se requieren contactos adhesivas estable entre las células y su matriz extracelular circundante para el mantenimiento de la homeostasis del tejido. Por ejemplo, la adhesión celular endotelial a la matriz subendotelial en los vasos sanguíneos desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la integridad de la capa endotelial y su función homeostática como una barrera vascular reguladora, semi-permeable 1. El citoesqueleto de actina está acoplado mecánicamente al adhesivo moléculas de la matriz en los sitios de adhesión célula-matriz y los contactos de adhesivo en la interfase célula-matriz desempeñar un papel importante en la determinación de la posición ....
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Protocolo
1. Generalidades de células endoteliales Cultura
- Células endoteliales aórticas bovinas Cultura (pasajes 4-9) en matraces de cultivo de tejido recubiertos de gelatina (capa de superficie de cultivo de tejidos con 0,1% w / v de gelatina en PBS a temperatura ambiente durante 15 min) en EGM-2 medios de comunicación (con la bala EGM-2 kit que contiene suero bovino fetal al 5%, factores de crecimiento y todos los suplementos proporcionadas por el fabricante, a excepción de hidrocortisona).
- Cuando las células son casi confluente (ca. 3 días después de la siembra después de un 1: split 4), las células de la cosecha mediante el tratamiento con 0,05% w / v....
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Resultados
La cuantificación en tiempo real de células endoteliales de adhesión de fibronectina en respuesta a la oxidación mediada por la fibronectina MPO (Experimento 2). La siembra de las suspensiones de células endoteliales en nativo (MPO libre) de fibronectina o MPO-cojinete resultados de fibronectina en la unión celular máxima y la difusión dentro de 2 h, según se juzga por un estancamiento de valores de índice celular en las mediciones de impedancia sustrato de células (Figura 3A). Esta fas.......
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Discusión
La adhesión célula-matriz y los procesos de-adhesión pueden cuantificarse con precisión en tiempo real con alta resolución temporal utilizando impedancia de la célula-sustrato y análisis de imágenes de células vivas. Estos enfoques en tiempo real proporcionan una gran ventaja sobre los análisis de punto final de la adhesión celular, que proporcionan una pobre resolución temporal. Al cuantificar con precisión rápidas respuestas de-adhesión con alta resolución temporal, estos análisis pueden proporcionar información decis.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen revelaciones para hacer.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por un 568721 de Subvenciones de Proyecto (SRT) del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud (NHMRC) y, en parte, por una Beca de Investigación (MDR) de la Facultad de Medicina de la UNSW.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Matriz de microelectrodos de impedancia de sustrato-celda de oro de 96 pocillos | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | placa de un solo uso utilizada para realizar ensayos basados en células en el sistema xCELLigence |
| blebbistatina | Sigma | B0560 | inhibidor selectivo de |
| células endoteliales aórticas bovinas con miosina II no muscular, criopreservadas | Lonza | BW-6001 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 Kit de | medios de crecimiento de células endoteliales |
| Fibronectina, polvo liofilizado | Sigma | F-4759 | de plasma bovino |
| Placa de cultivo celular con fondo de vidrio fluorado de 35 mm | World Precision Instruments | FD35-100 | Plato de curura celular con fondo de vidrio de calidad óptica para imágenes Gelatina |
| de piel bovina Sustrato de | cultivo celular | Sigma | G9391 |
| Solución salina equilibrada de Hank | Life Technologies | ||
| Peróxido de hidrógeno Merck | 107298 | ||
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | Medios celulares sin suero |
| Metionina | Sigma | M9500 | apaga los oxidantes clurantes generados por la mieloperoxidasa |
| Mieloperoxidasa, leucocitos polimorfonucleares humanos | Millipore | 475911 | |
| impedancia de sustrato celular | ACEA Biosciences / Roche | consta de analizador RTCA, estación MP RTCA (placa múltiple) y unidad de control RTCA | |
| tripsina-EDTA (0,5%) | Gibco | 15400-054 |
Referencias
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J.....
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Reimpresiones y permisos
