En este artículo, se describe un protocolo para la infección de macrófagos con Cryptococcus neoformans. Además, se explica un método para la depleción de esteroles de los macrófagos. Estos protocolos proporcionan una guía para estudiar las infecciones fúngicas in vitro y examinar el papel de los esteroles en dichas infecciones.
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Artículo de método
El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de
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En este artículo
Resumen
Resumen
La criptococosis es una infección potencialmente mortal causada por hongos patógenos del género Cryptococcus. La infección se produce después de la inhalación de las esporas, que son capaces de replicar en el pulmón profundo. La fagocitosis por los macrófagos de Cryptococcus es una de las formas en que la enfermedad es capaz de propagarse en el sistema nervioso central para causar meningoencefalitis letal. Por lo tanto, el estudio de la asociación entre Cryptococcus y macrófagos es importante para entender la progresión de la infección. El presente estudio describe un protocolo de paso a paso para estudiar la infectividad de macrófagos por C. neoformans in vitro. El uso de este protocolo, se estudia el papel de los esteroles de acogida en las interacciones huésped-patógeno. Diferentes concentraciones de metil - ciclodextrina (MCD) se utilizaron para suprimir el colesterol de murino sarcoma retículo-macrófago línea celular J774A.1. El agotamiento de colesterol se confirmó y cuantificó usando tanto un dis comercialmentekit de cuantificación de colesterol e y cromatografía en capa fina. Células de colesterol empobrecido se activaron usando lipopolisacárido (LPS) y el interferón gamma (IFN) y se infectaron con Cryptococcus neoformans anticuerpos opsonizado de tipo salvaje células H99 en una relación de efector a diana de 1: 1. Las células infectadas fueron monitorizados después de 2 h de incubación con C. se calculó neoformans y su índice de fagocitosis. Agotamiento de colesterol dio lugar a una reducción significativa en el índice de fagocitosis. Los protocolos presentados ofrecen un método conveniente para imitar la iniciación del proceso de infección en un entorno de laboratorio y estudiar el papel de la composición de lípidos de acogida sobre la infectividad.
Introducción
La fagocitosis es un proceso por el cual las entidades extracelulares son internalizados por las células huésped. Es un arma clave en el arsenal del sistema inmune para defenderse contra agentes patógenos, pero el proceso a menudo puede ser subvertido por patógenos para permitir la internalización y la difusión a través del cuerpo 1. La fagocitosis está mediada por varios eventos de señalización que resultan en la unión y la inmersión a través de reordenamientos de citoesqueleto de la célula huésped. Fagocitos "profesional" son capaces de reconocer y unirse a opsoninas en la superficie del patógeno invasor a la señal para la unión y la formación de lamelip....
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Protocolo
1. El colesterol agotamiento de las células J774A.1 con MβCD
- En una cabina de bioseguridad estéril, de semillas 10 5 J774A.1 células de tipo macrófago por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos en 200 l de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina / estreptomicina (P / S). Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 O / N.
- Retire el medio de la monocapa de células y se lavan las células dos veces con fosfato 1x solución salina tamponada (PBS) que ha sido filtrada o tratada en autoclave.
- Añadir 200 l de solución de MβCD a la concentración deseada ....
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Resultados
El agotamiento Colesterol
Análisis del sobrenadante reservado en el paso 1.3 del protocolo, siguiendo las instrucciones del fabricante en el kit de ensayo de colesterol de Amplex Red produce una concentración elevada de colesterol en la muestra MβCD tratado en comparación con el control PBS 1x. Dependiendo del tipo de célula y el agotamiento de colesterol concentración MβCD utilizado puede variar. Para J774 tratados con 10 mM MβCD, se observó una disminución de aproximadamente el 50%. El agotam.......
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Discusión
En el trabajo con este protocolo es importante para obtener recuentos de células precisos cuando chapado en células de mamíferos y opsonizantes C. células neoformans. Esto minimiza la variación entre los ensayos y asegura una precisa 1: 1 de destino para la proporción de efector durante todo el estudio. También es fundamental para coordinar la temporización de la depleción de colesterol y para prevenir la infección las células de levadura o células opsonizadas macrófagos tratados de reposo a temperatur.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas del NIH AI56168, AI71142, AI87541 y AI100631 de MDP. Maurizio Del Poeta es Burroughs Wellcome Investigador en Enfermedades Infecciosas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Gabinete de Bioseguridad Clase II tipo A2 | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 línea celular | ATCC | TIB-67 | Llega Congelado. Consulte las instrucciones de ATCC para el cultivo. |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Tienda en 4 ° C y cálido a 37 ° C antes de usar |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Mantener congelado a -20 ° C y descongele antes de agregar a DMEM |
| Penicilina-estreptomicina (10,000 U / ml) | Gibco | 15140-122 | Se utiliza para complementar DMEM |
| Isotemp Incubadora de cultivo celular | Fisher Scientific | Modelo # 3530 | |
| Plato de cultivo de 96 pocillos | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x solución salina tamponada con fosfato | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Diluir a 1x y filtrar o esterilizar en autoclave antes de usar. |
| Metil-β-ciclodextrina | Sigma Life Science | C4555-10G | Se disuelve en 1x PBS para hacer soluciones de concentraciones de 10 mM y 30 mM |
| Agitador orbital | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Technologies Molecular Probes | A12216 | Todos los reactivos para el ensayo de colesterol están contenidos en el kit. Siga las instrucciones del fabricante. |
| Placa de ensayo negra de 96 pocillos | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax Lector de microplacas | Molecular Devices Modelo | F5 | |
| Cámara TLC | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Cloroformo | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Papel | Whatman | 3030917 | Cortado al tamaño necesario para el tanque TLC |
| Campana | Cualquier campana extractora que cumpla con las normas AIHA/ANSI | ||
| Placa de 6 pocillos | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Raspador de células | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocitómetro | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrífuga | Beckman Coulter | Modelo Alegra x-30R | |
| Mezclador Votex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Modelo # MS104S mide hasta 0,1 mg | |
| Vidrio Pipeta Pasteur | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Colesterol | Avanti Lípidos Polares | 700000 | |
| Concentrador SpeedVac | Thermo Scientific | Modelo # SPD2010 | |
| Éter de petróleo | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Éter dietílico | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Ácido acético | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Gel de sílice 60 con zona de concentración | Cromatocrato analítico Millipore | 1.11845.0001 | |
| Chips de yodo | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Ácido sulfúrico | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Cloruro de manganeso | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Utilice el software Vision Works LS para el análisis de densitometría | |
| Plato confocal con fondo de vidrio | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtenido del Centro Médico de la Universidad de Duke | ||
| YNB | BD | 239210 | Consulte al fabricante para obtener instrucciones de preparación. Utilice una concentración de glucosa de 20 g/L. |
| Lipopolisacárido | Sigma | L4391-1MG | Disolver en 1x PBS para hacer un caldo de 1 mg/ml. Almacenar a -20 °C. |
| Interferón gamma | Sigma | I4777 | Disolver en 1x PBS para hacer una solución madre de 0,1 mg/ml |
| Anticuerpo de glucuronoxilomanano (anti-GXM) | Regalo de Arturo Casadevall's Lab la concentración es de 1,98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Disuelva 0,8 g de Giemsa en 25 ml de glicerol y caliente a 60 °C; C durante 1 hora. Añadir 25 ml de metanol a la solución y dejar envejecer a temperatura ambiente durante al menos 1 mes. |
| Microscopio | Zeiss | Observer.Microscopio D1 con AxioCam MRm para la toma de |
Referencias
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Ch....
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Reimpresiones y permisos
