Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudiar la acción hormonal en el pecho humano

Resumen

Hemos desarrollado un nuevo modelo ex vivo para estudiar la acción de la hormona en el pecho humano. Se basa en microestructuras de tejido aisladas a partir de muestras de tejido de mama quirúrgicos que conservan la arquitectura del tejido, las interacciones intercelulares, y la señalización paracrina.

Resumen

El estudio de la acción de la hormona en el pecho humano se ha visto obstaculizada por la falta de sistemas de modelos adecuados. Tras el cultivo in vitro, las células epiteliales mamarias primarias tienden a perder la expresión del receptor de la hormona. Ampliamente receptor de la hormona líneas celulares de cáncer de mama positivo utilizados son de limitada relevancia para la situación in vivo. A continuación, describimos un modelo ex vivo para estudiar la acción de la hormona en el pecho humano. Muestras de tejido de mama humanos frescos a partir de material de descarte quirúrgica como mammoplasties reducción o mammectomies están mecánica y enzimáticamente digeridos para obtener fragmentos de tejidos que contienen conductos y los lobulillos y los múltiples tipos de células del estroma. Estas microestructuras de tejido mantenidas en medio basal sin factores de crecimiento conservan sus contactos intercelulares, la arquitectura de los tejidos, y siguen siendo sensible a hormonas durante varios días. Se procesan fácilmente para ARN y la extracción de proteínas, el análisis histológico o almacenadas en medio de congelación. Fluorescenciaclasificación de células activadas (FACS) puede usarse para enriquecer poblaciones de células específicas. Este protocolo proporciona un enfoque sencillo, estándar para estudios traslacionales con, variados especímenes humanos altamente complejos.

Introducción

Información sobre el paisaje mutacional en el cáncer de mama está aumentando a ritmo rápido. Se ha prestado menos atención a los factores sistémicos que influyen en el desarrollo del cáncer de mama. La exposición a las hormonas reproductivas tiene un impacto importante en la progresión de la enfermedad ^1-3. Sin embargo, los mecanismos por los cuales las hormonas reproductivas inciden en el pecho humano, son poco conocidos. Trabajar con modelos de ratones genéticamente modificados ha revelado que implican células de señalización intrínseca y paracrina través de varios efectores ^4.

El conocimiento limitado acerca de la acción de la hormona en el pecho humano es atribuible en gran medida a la falta de modelos adecuados. La mayoría del trabajo sobre los mecanismos de receptor de estrógeno (ER) y receptor de progesterona de señalización (PR) se ha realizado con receptores hormonales positivos líneas celulares de cáncer de mama, tales como MCF-7 y T47D. Estos se derivan de los derrames pleurales de pacientes con cáncer de mama avanzado que tenía already recibió múltiples tratamientos ^5. La importancia biológica de los resultados en este tipo de modelos simples in vitro de la mama humana es genes cuestionables y destinatarios identificados en estos modelos in vitro son difieren de los genes diana que se identifican en modelos animales ^6. Cuando las células epiteliales de mama humano primario se cultivan in vitro tienden a perder la expresión del receptor de la hormona y por lo tanto la respuesta de la hormona ^7,8. Este problema puede ser circumventd por enfoques sofisticados 3D utilizando matrigel. De esta manera, C. Clarke y sus colegas tuvieron éxito en el establecimiento de las células epiteliales de mama que mantenían la expresión del receptor de la hormona y mostraron una respuesta proliferativa a la estimulación de progesterona ^9. Sin embargo, dos importantes in vivo genes diana de receptores de progesterona, Wnt-4 y RANKL, no fueron inducidos a la estimulación de progesterona en este sistema ^9. Este enfoque fue recientemente tomada en más con in vitro pretratamiento hormonal y RANKL inducción se logró ^10. Una advertencia permanece matrigel que tiene actividades que son dependientes de lotes, es caro, y exige un diseño experimental que es apto para sólo el número de células pequeñas.

Sobre la base de la constatación de que en ER vivo y PR de señalización están en gran parte mediada por interacciones paracrinas ^11, argumentamos que las interacciones intercelulares deben ser mantenidos. Otro factor importante que se pierde como tejidos se disocian a las células individuales para el cultivo in vitro son las interacciones de las células epiteliales con la matriz extracelular; sin embargo, éstos son críticos para la diferenciación del epitelio y su alteración es importante en la tumorigénesis ^12. Con esto en mente, hemos establecido un método para aislar microestructuras de tejido de mama a partir de material de descarte quirúrgica fresco ^13. El parénquima mamario, que consiste en un epitelio de dos capas con luminal interior y exterior myoepithelicélulas de Al, se diseca lejos de tejido adiposo y se someten a la disociación mecánica y enzimática. Después del lavado y centrifugación, se obtienen fragmentos de conductos de la leche que mantienen una estrecha interacción con muchas células del estroma. Estas microestructuras de tejido permanecen hormona sensible. El modelo fue validado en muestras clínicas ^13. Como tal, el presente procedimiento puede ayudar a estudiar la acción hormonal en la mama en un contexto biológicamente y clínicamente relevante.

Protocolo

Consideraciones generales: Antes de tiempo, establecer un protocolo de ética, preparar cuestionarios para los pacientes, y ver a la capacitación del personal clínico. Antes de utilizar el material de cirugía mamoplastia de reducción, adquirir las autorizaciones, y asegurar el consentimiento del paciente. El tejido puede ser contagiosa y debe ser manejada en consecuencia. Este protocolo fue aprobado por el comité ético de ISREC - Instituto Suizo de Investigación Experimental del Cáncer.

1. Recuperación de tejidos, producción y Bio-banking

Para garantizar la calidad de la muestra óptima para bio-banking, una serie de medidas se llevan a cabo en el hospital antes de su transporte al laboratorio.

En el hospital:

1. Obtener los tejidos mamarios humanos en condiciones estériles de cirugía mamoplastia de reducción y muestras de sangre, si es necesario. El tejido debe ser examinado por el patólogo que probar para excluir la presencia de lesiones malignas.
2. Coloque la t de mamaemitir bajo el capó en un tablero estéril y preparar tijeras, bisturí quirúrgico y pinzas que ya se esterilizan con esterilizador de vapor. Hacer corte profundo en diferentes sitios del tejido mamario usando un bisturí para abrirlo. En el tejido mamario humano buscar hebras blancas que constan de conductos y los lobulillos, que están incrustados en el tejido adiposo de color amarillo.
   NOTA: La relación de la parénquima blanco en el tejido adiposo amarillo difiere entre las mujeres; normalmente mujeres más jóvenes tienen más tejido epitelial.
3. Elige piezas de material blanco y los mantienen con pinzas, luego separarlos suavemente desde el tejido adiposo con unas tijeras. Evite tomar los vasos sanguíneos.
4. Enjuague las piezas de tejido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,2 para eliminar la sangre. Transferir el tejido para botellas de plástico 250 ml que contenían medio F12 (F12 medio modificado de Eagle de Dulbecco) sin rojo fenol con 2% de penicilina / estreptomicina (incluyendo 5.000 unidades / ml de penicilina y 5.000 g / ml de estreptomicina) y 1% de unaantibiótica / anfotericina B (incluyendo 10.000 unidades / ml de penicilina, 10.000 g / ml de estreptomicina y 25 mg / ml de anfotericina B). Tejidos de las tiendas en el medio de transporte al laboratorio.
5. Preparar piezas de 3 - 5 mm de diámetro para la extracción de ARN y proteínas y flash congelarlos en crioviales de frío (hielo seco) isopentano. Ellos Traslado a la caja de hielo seco para el transporte al laboratorio.
6. Ponga trozos de 3-5 mm en el molde y se cubre con una capa de la temperatura óptima de corte (OCT) y luego colocar el molde en la parte inferior plana de caja llena de isopentano frío. Después de congelación completa transferir el molde a la caja de hielo seco.
7. Fijar 5 piezas de 3-5 mm de diámetro en paraformaldehído (PFA) 4% y otras 5 piezas en formaldehído (FA) 4% en PBS a análisis histológico RT adelante. Dos fijadores diferentes se recomiendan como algunos anticuerpos funcionan mejor con uno u otro de los dos.

En el laboratorio:

8. Hacercumento toda la información sobre la mamoplastia de reducción, la fecha de la cirugía y si las muestras proceden de la izquierda contra la mama derecha.
9. Colocar las muestras congeladas a -80 ° C y transferir los tejidos fijados en casetes de histología después de 2 hr de la fijación. Entonces los puso bien en PBS o 70% de etanol, para O / N de almacenamiento a 4 ° C. Al día siguiente, la transferencia de los cassettes de histología a las instalaciones de histología para la inclusión en parafina.

2. Tejido digestión y la hormona de estimulación

1. Transferencia de las botellas que contienen las muestras de tejido para una cabina de flujo laminar en una habitación de cultivo celular P2. Coloque las piezas de tejido en tajadera estéril (29 x 19 cm). Sujete el material con fórceps y raspar la grasa restante y los vasos de distancia del parénquima mamario (parte blanca) con bisturí. Coloque el material blanco en PBS en una placa de cultivo de 10 cm.
2. Después de retirar el material graso de todas las piezas y disponer de ellos de acuerdo con la norma de seguridads del laboratorio, coloque las partes blancas que contienen los tejidos epiteliales de nuevo en la tabla de cortar. Uso de escalpelos opuestas cortar el tejido y cortar en pedazos de hasta 2 mm de diámetro.
3. Coloque el material picado en tubos de tamaño adecuado: hasta 1, 2,5 y 10 ml en un 5, 15 o 50 ml tubos, respectivamente. Normalmente un 5 ml rendimientos tubo de material suficiente para empotramiento de parafina y de la hormona estimulaciones, y unos 15 ml produce tubo de material suficiente para la fluorescencia de células activadas (FACS). Tubos más grandes se utilizan para congelar alícuotas.
4. Preparar mezcla maestra digestión consiste en medio (DMEM / F12 sin rojo fenol) con 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina B y la colagenasa A (clostridiopeptidasa A partir de Clostridium histolyticum). Dosis colagenasa de acuerdo a los tiempos de digestión.
   1. Para 12, 24, y 36 horas de incubación, utilice concentración final de colagenasa de 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml y 0,5 mg / ml respectivamente. Añadir mezcla maestra digestión hasta 4 veces de lavolumen del material digerido para asegurar la agitación y aireación adecuada.
      NOTA: En función del diseño experimental y la duración de la estimulación hormonal, añadir hormonas ya sea durante o después de la recuperación de paso de digestión enzimática y microestructura.
5. Añadir la hormona (s) a una concentración deseada para probar las muestras y el vehículo con el control. Para la estimulación con 17-β-estradiol, y promegestona (R5020) utilizar una concentración final de 20 nM.
   NOTA: R5020 es un agonista del receptor de progesterona sintética, que es más estable que la progesterona natural en el medio.
   1. Colocar los tubos en el mezclador de rodillos dentro de una incubadora a 37 ° C y 40 rpm O / N. Antes de colocar las muestras en el mezclador, resuspender ellos muy bien para asegurar que todo el material se distribuye a lo largo de los tubos de centrífuga.
6. Como la digestión tarda al menos 12 horas (O / N), para tiempos de estimulación de la hormona de menos de 12 horas, añadir las hormonas después de la recuperación de las microestructuras (decola en el paso 3). Añadir las hormonas a medida que volver a suspender las microestructuras y colocar la suspensión en placas ultra-bajas de fijación. Microestructuras de tejido se pueden mantener en placas de fijación ultra-bajas para un máximo de 7 días en medio del factor de crecimiento libre de conservantes alrededor del 70% de viabilidad.
7. Para el ARN y el análisis de proteínas, recoger microestructuras de tejido por centrifugación a 400 xg durante 5 min y flash congelación en tubos de centrífuga.

3. Recuperación de microestructuras de tejido

1. Centrifugar el tubo (s) a 400 xg durante 5 min. Aspirar la grasa de la parte superior del tubo de centrífuga y transferir el sobrenadante del sobrenadante acuosa restante, que está enriquecido en los fibroblastos, a un nuevo tubo de centrífuga y se centrifuga a 1250 xg durante 5 min.
   NOTA: Como las microestructuras de tejido de mama son muy pegajosas, para todos los pasos subsiguientes resuspender el sedimento suavemente agitando el tubo. Pipeteo no se recomienda debido al riesgo de perder material.
2. Resuspender los pellets enriquecidos en microestructuras y en los fibroblastos derivados de sobrenadante acuoso en PBS, 2% de suero de ternera fetal (FCS). Posteriormente girar ambos tubos a 1.250 xg durante 5 min y luego desechar los sobrenadantes.
3. Resuspender los pellets en 3-5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos de la sangre y transferirlas a tubos limpios. Incubar durante 5 min a TA.
4. Añadir 2x volumen de PBS, 2% de FCS y se centrifuga ellos en 1250 xg durante 5 min. Lavar los pellets con PBS, 2% de FCS y se centrifuga a 1250 xg durante 5 min. Repita este paso dos veces.

4. Las muestras de citometría de flujo

1. Añadir 1 - 2 ml de tripsina al 0,25% al ​​sedimento y se mezcla pipeteando arriba y abajo muy suavemente durante 2 min con un Pipetman 1000 l para disociar las células.
2. Inhibir la actividad de la tripsina mediante la adición de 9 ml de PBS, 2% FCS. Centrifugar a 450 xg durante 5 min y resuspender el pellet en 10 ml de PBS, 2% FCS.
3. Transferir la suspensión de células en un filtro de células de 40 micras colocado en top de un tubo de centrífuga de 50 ml para preparar células individuales. Si unos pocos microlitros de suspensión de células se mantienen en la parte superior del filtro, ayudarles a pasar a través del filtro mediante la aspiración de ellos desde el otro lado del filtro con una pipeta y añadirlos a las microestructuras filtrados.
4. Anticuerpos células inmunes separadas, fibroblastos y células endoteliales de microestructuras con un cóctel de anticuerpos anti-CD45, anti-FAP y anti-CD31 y luego a ordenar con FACS, basado en EpCAM marcador pan-epitelial y CD10 para separar las células luminales y basales respectivamente ¹⁰ .

5. Las muestras para histología

1. Después de lavar el material digerido mecánica y enzimáticamente como se describe anteriormente, fijar gránulos de 1,5 ml de material inicial en 1 ml de PFA al 4% en PBS a temperatura ambiente durante 30 min.
2. Centrifugar a 1250 xg durante 5 min y se lava con 1 - 2 ml de PBS dos veces.
3. Centrifugar a 16000 xg durante 10 min. Durante este tiempo, preparar 1% de usos múltiples de agarosa en Tris-acetato-EDTA (TAE) tampón y calentar la solución en el horno microondas hasta que la solución hierva.
   1. Retire la solución del horno de microondas y agitar el frasco suavemente para mezclar la solución y volver a suspender las partículas de agarosa restantes. Solución de agarosa Enfriar a 50 ° C y se vierte 1 ml en un molde base de parafina de tamaño 31 × 23 × 13,5 mm.
4. Descartar el sobrenadante y colocar las pastillas en la parte superior de la capa solidificada (1 - 3 mm) de agarosa usando una espátula con un extremo plano. Cubra todo con una capa adicional de agarosa (40 ° C).
5. Después de que se solidifique agarosa, generalmente dentro de 5 minutos, poner los bloques de agarosa en los cassettes de histología para empotramiento en parafina. Junto con las muestras de agarosa colocan un papel blanco de oficina en el cassette con toda la información sobre el número de mamoplastia de reducción, la condición experimental, y la fecha escrita en letras pequeñas en lápiz; este escrito soporta todas las etapas de tratamiento posteriores.
6. Ponga los casetes enPBS O / N, o en el 70% de etanol para el almacenamiento durante el fin de semana, a 4 ° C. No hemos notado ninguna diferencia entre las dos soluciones de almacenamiento. A continuación, traslado a las instalaciones de cassettes de histología histología para la inclusión en parafina.

6. Las microestructuras de congelación (Futuro cultivo)

1. Microestructuras de tejido resuspender en medio de congelación que consiste en FCS con 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y congelar alícuotas de 1 ml en crioviales. El número de crioviales obtenidos depende de la cantidad de material primario obtenido a partir de mamoplastia de reducción.
2. Congelar los crioviales que contienen microestructuras de tejido usando un congelador de velocidad controlada con el siguiente programa: 5 min vivienda a 4 ° C, disminuyendo la temperatura a -7 ° C con una tasa de 6 ° C / min, la disminución de la temperatura a -12 ° C con tasa de 6 ° C / min, 10 min vivienda, disminuyendo la temperatura a -40 ° C con una tasa de 6 ° C / min, la disminución de la temperatura a -80 ° C contasa de 6 ° C / min. A continuación, traslado los crioviales a -80 ° C congelador.
3. Al día siguiente, transferir los crioviales de -80 ° C a tanque de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo.

Resultados

Para estudiar el papel de los estrógenos y la progesterona y para comprender mejor sus funciones moleculares en el pecho humano, recogemos frescas muestras de tejido de mama humanos de los pacientes sometidos a reducción mammoplasties (Figura 1) después de obtener su consentimiento informado. También obtenemos la historia médica y reproductiva de los pacientes, así como una muestra de sangre para determinar los niveles séricos de progesterona en el momento de la cirugía. El tejido de reducción mammoplas...

Discusión

El cultivo ex vivo descrito aquí proporciona microestructuras de tejido de mama que contienen conductos y lóbulos intactos, junto con otros tipos de células que se encuentran normalmente en el pecho femenino humano. En el procesamiento del tejido de mama humano generalmente obtenido a partir de mammoplasties de reducción, la eliminación de tejido adiposo, la digestión mecánica y enzimática de la matriz estromal, y la lisis de las células rojas de la sangre enriquece para los fragmentos conducto de leche y unida...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Centrífuga de microlitros	Heraeus Biofuge Fresco	75005521
centrífuga 5810R	Eppendorf	5810 000.327
Cryobox	Nalgene	5100-0001
Congelador de tasa controlada EF600 Grant	Asymptote	EF600
Incubadora de CO2	Hera Cell Heraeus	51022391 de
rodillos SRT9D	Sturt	SRT9D
Histology Cassettes	Medizintechnik	81-0021-00
Cell Strainer	Falcon	352340
Strile Surgical Blade	Aesculap	BB536
Bisturí	Aesculap	BB084R
Pinzas	Aesculap	BD047R
Tijeras	Aesculap	BC374R
Molde base de parafina	SAKURA	4166
Temperatura óptima de corte (OCT) Cryomatrix	Thermoscientific	6769006
Penicilina/Estreptomicina	Life Technologies	15070-063
Antibiótico/Antimicótico	Life Technologies	15240-062
DMEM F/12	Life Technologies	11039-021	Precalentamiento (37 ° C)
Colagenasa	Roche	11 088 793 001	Prewarm (37 ° C)
Suero fetal bovino	Life Technologies	10270	Puede ser reemplazado con suero de ternera fetal
Tampón de lisis sanguínea	de células Sigma	R7757
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Tripsina-EDTA	Life Technologies	15400-054
Agarosa	Invitrogen	16500-500
Formaldehído	Sigma	F1635
Paraformaldehído	Roth	335
Isopentano	Sigma	M32631
Etanol	Merck	1009831000
Viales criogénicos (5,0 ml)	VWR, International	479-0820
Placa de cultivo de fijación ultra baja	Corning, NY 14831	3471

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