Transposón mediada Integración de ADN plásmido en la zona subventricular de ratones recién nacidos para generar modelos novedosos de glioblastoma

Resumen

Aquí describimos un protocolo eficiente y versátil para inducir, monitorizar y analizar nuevos glioblastomas (GBM) utilizando ADN transposón inyectado en los ventrículos de ratones neonatos. Las células de la zona subventricular, que absorben el plásmido, se transforman, proliferan y generan tumores con características histopatológicas de GBM humano.

Resumen

Existe una necesidad urgente de probar la contribución de nuevos genes a la patogénesis y progresión de los glioblastomas humanos (GBM), el tumor cerebral primario más común en adultos con pronóstico sombrío. Nuevas terapias potenciales están emergiendo rápidamente de los laboratorios y requieren pruebas sistemáticas en modelos experimentales que reproduzcan fielmente las características más destacadas de la enfermedad humana. En este trabajo describimos en detalle un método para inducir nuevos modelos de GBM con integración de ADN plasmídico mediada por transposones en células de la zona subventricular de ratones neonatos. Presentamos una forma sencilla de clonar nuevos transposones susceptibles de integración genómica utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente e ilustramos cómo monitorear la absorción de plásmidos y la progresión de la enfermedad utilizando bioluminiscencia, histología e inmunohistoquímica. También describimos un método para crear nuevas líneas celulares primarias de GBM. Idealmente, este informe permitirá una mayor difusión del sistema de transposones de la Bella Durmiente entre los investigadores de tumores cerebrales, lo que conducirá a una comprensión profunda de la patogénesis y progresión de la GBM y al diseño y prueba oportunos de terapias efectivas para los pacientes.

Introducción

El glioblastoma multiforme (GBM) es el (60%) tumor cerebral primario más común en adultos, con una supervivencia media de 15-21 meses cuando fueron tratados con cirugía, radioterapia, y quimioterapia ^1. Terapias novedosas para GBM son imprescindibles. Las terapias experimentales requieren pruebas en modelos animales que reproducen adecuadamente las características más destacadas de la enfermedad humana. Estrategias para inducir GBM en roedores incluyen mutagénesis química con agentes alquilantes, línea germinal o alteraciones genéticas somáticas, o el trasplante usando líneas celulares de glioma ^2. Los modelos más utilizados emplean la implantación de líneas celulares de glioma, ya sea ortotópicamente, en el cerebro o por vía subcutánea utilizando células singénicas en animales con idéntico genotipo; o células xenogénicas, líneas más comúnmente humanos de células GBM, implantados en ratones inmunes comprometidos ^3. Los xenoinjertos ofrecen muchas ventajas para el estudio de tumores intracraneales: conveniencia de la reproducibilidad, standatasas de crecimiento rdized, momento de la muerte y el tumor de localización. Sin embargo, estos modelos tienen limitaciones debido al abordaje quirúrgico artificial, invasivo utilizado para implantaciones y capacidad limitada para reproducir con precisión histológica rasgos característicos de GBM humana (OMS grado IV): necrosis pseudo-pallisading, atipias nucleares, invasión difusa, la proliferación de micro-vascular y la formación de anomalías vascular glomeruloide ^4-7. La inducción de GBM por alterar el genoma de las células somáticas con ADN oncogénico, ya sea con vectores virales ^8-12, o con la integración mediada por transposón ^13, reproduce más estrechamente la etiología de la enfermedad humana y recapitula características histopatológicos de GBM humano.

Históricamente, los tumores del SNC han sido clasificados sobre la base de la célula de origen percibida, que se observó, sería un factor predictivo para la supervivencia ^14. GBMs se clasifican en primaria y secundaria. Emergentes tod pruebasay apunta a la naturaleza altamente heterogéneo de glioblastoma primaria ^15. GBM secundaria (15%), el resultado de la transformación maligna de los astrocitomas de grado bajo (OMS grado I) y astrocitomas anaplásicos (OMS grado II), están asociados con la aparición temprana de la enfermedad, mejor pronóstico y un patrón de "proneural" de la expresión génica , mientras que GBM primaria (85%) muestran una aparición tardía, mal pronóstico y glial (clásica), neural o patrones de expresión mesenquimales. Si estos patrones de expresión génica se correlacionan con la célula real de origen del tumor todavía se está investigando activamente. La acumulación de los datos muestra que la combinación de mutaciones genéticas asociadas con GBMs son predictivo para la supervivencia. Por ejemplo, la pérdida de heterocigosidad (LOH) de los cromosomas 1p / 19q, mutaciones IDH1, PDGFRa amplificaciones, están asociados con GBMs secundarias, patrón de expresión proneural y mejor pronóstico, mientras que la sobreexpresión de EGFR, Notch y activación de la vía hedgehog sonic, Nf1 y PTEN pérdida y las mutaciones de p53 se correlacionan con los nervios, clásica, o GBM primaria mesenquimales y peor pronóstico ^16,17. El advenimiento de los grandes proyectos de secuenciación de escala y la acumulación de numerosas muestras de pacientes disponibles para la prueba trae una gran cantidad de nueva información con respecto a las mutaciones genéticas y las vías implicadas en GBM patogenia y la progresión y la posibilidad de la medicina individualizada, donde las terapias pueden ser adaptados específicamente a las anomalías genéticas del paciente. En última instancia, para evaluar el valor predictivo de estas mutaciones y las vías de manera sistemática, y para probar posibles tratamientos en cada caso, requiere modelos animales de GBM con alteraciones genéticas predeterminados. Transposón de integración mediada de ADN genómico ofrece un enfoque viable.

El sistema transposón Bella Durmiente, miembro de la / clase mariner Tc1 de transposones, se "despierta" (construido) en un proce múltiples pasosss de mutagénesis específica de sitio de un gen de transposasa salmónidos, que se convirtió en estado latente hace más de 10 millones años ^18,19. En esencia, transposones de ADN flanqueados por secuencias específicas (repeticiones invertidas / repeticiones directas: IR / DR) se pueden integrar en el genoma de una manera de "cortar y pegar" por medio de la actividad de la transposasa Bella Durmiente. La transposasa reconoce los extremos de los sitios de IR, escinde el transposón y la integra aleatoriamente en otro sitio de ADN entre las bases T y A, bases que se duplican en cada extremo del transposón durante la transposición (Figura 1a). La transposasa Bella Durmiente se compone de tres dominios, un dominio de unión transposón, una secuencia de localización nuclear y un dominio catalítico. Se requieren cuatro moléculas de transposasa para llevar a los dos extremos del transposón juntos y permitir la transposición, sin embargo, si demasiadas moléculas de transposasa están presentes, pueden dimerizar y tetramerizarse para inhibirla reacción de transposición ^20. Una reacción de transposición eficiente requiere una relación óptima de transposasa de transposones. El ADN que codifica la transposasa puede ser entregado en el mismo plásmido con el transposón (en cis) o en un plásmido diferente (en trans). Para asegurar la relación óptima entre la transposasa y los transposones, un promotor con una actividad adecuada puede ser elegido para la expresión de la transposasa (para el modelo "cis") o la proporción de los plásmidos en la solución de inyección pueden ser optimizados (para el modelo "trans"). El sistema transposón Bella Durmiente puede ser utilizado con éxito para la genómica funcional, mutagénesis de inserción, la transgénesis y la terapia génica somática ^21. Al ser una construcción sintética re-ingeniería a una molécula funcional de una variante salmonoides latente, la transposasa Bella Durmiente no se une a otros transposones en seres humanos u otros mamíferos ^20. Desde su descubrimiento, la ingeniería molecular tiene enhanced la eficacia transposición del sistema de transposón SB a través de cambios en las secuencias de IR y adición de dinucleótidos TATA que flanquea el transposón, resultando en los transposones pT2. Estos transposones han optimizado la unión de la SB para el sitio de infrarrojos y una mayor eficacia de la escisión. La transposasa SB también se sometió a una mejora significativa; la transposasa utilizado en los experimentos presentados en el presente documento es el SB100X, una transposasa hiperactiva generado por una estrategia de barajado de ADN seguido por una pantalla genética a gran escala en células de mamíferos ^22.

En este informe se presenta un método rápido, versátil y reproducible para inducir GBM intrínseca en ratones con la integración no viral, transposón mediada de ADN plásmido en células de la zona sub-ventricular de ratones recién nacidos ^23. Presentamos una manera simple de crear transposones con nuevos genes susceptibles para la integración genómico utilizando la transposasa Bella Durmiente y demostrar cómo supervisar plásmido captación yprogresión de la enfermedad utilizando bioluminiscencia. También nos caracterizamos características histológicas e inmunohistoquímicos de la MBG reproducido con este modelo. Además, se presenta un método rápido para generar líneas de células primarias de GBM de estos tumores. El modelo de la Bella Durmiente, en el que los tumores son inducidas a partir de células originales al animal, permite la evaluación funcional de la función de los genes candidatos GBM en la inducción y progresión de los tumores. Este sistema también es muy adecuado para el ensayo de nuevos tratamientos GBM, incluyendo terapias inmunes en ratones inmunocompetentes, sin la necesidad de procedimientos quirúrgicos invasivos inflamatorias, que pueden alterar el microambiente local.

Protocolo

NOTA: Todos los animales protocolos fueron aprobados por la Universidad de Michigan Comité para el Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA).

1. Clonación de la secuencia de interés en New dormir transposones Belleza

NOTA: Para insertar genes o elementos inhibitorios (como shRNA) utilizando el sistema de dormir transposasa Belleza, clonar la secuencia de interés en la columna vertebral de un pKT o plásmido pT2. Dirigir la clonación de tal manera que los elementos reguladores, genes de interés y marcadores permanecen flanqueadas por las repeticiones invertidas (IR / DR). Un ejemplo de clonación PDGFβ en una columna vertebral pKT se detalla a continuación (véase también la Figura 1b).

1. Digest 5 g de plásmido vector PKT-IRES-Katushka durante 4 horas a 37 ° C con 5-10 unidades de enzimas de restricción XbaI / XhoI en 50 l de volumen de reacción.
2. Digerir el ADNc mPDGFβ de 5 ug del plásmido pGEM-T mPDGFβ durante 4 horas a 37 ° C con 5-10 unidads de las enzimas de restricción NcoI / SacI.
3. Precipitar el ADN total mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol 100%, y 1/10 de volumen de 3 M de acetato sódico, pH 5,8 y se incuba durante la noche a -20 ° C.
4. Centrifugar las muestras a 13.800 xg durante 15 min.
5. Lavar el sedimento de ADN con 500 l de etanol al 70%, se centrifuga a 13.800 xg durante 1 minuto, repetir una vez y volver a suspender en 19 l de DNasa estériles agua libre.
6. Siga las instrucciones del fabricante en el Blunting Kit rápido a despuntar los extremos de ambos vectores (PKT-IRES-Katushka) e insertar (mPDGFβ).
7. Cargue el vector embotado e insertar en un bromuro de etidio manchadas gel de agarosa al 1,2% y correr a 80 V durante 40 minutos. Visualizar las bandas, escindir con una hoja de afeitar y gel limpia purificar el ADN usando un kit de purificación de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante.
8. Se liga el ADN inserto y el vector purificado en el paso 1.7 mediante la adición de ellas en un tubo a una relación molar 4: 1 (inserto: vector). En este tubo, pipette 1 l de T4 ligasa y 2 l de tampón ligasa T4 (que contiene ATP), y ajustar el volumen a 20 l con agua estéril. Incubar la reacción de ligación durante 18 horas a 16 ° C.
9. Transformar células bacterianas competentes DH5a químicamente con los productos ligados.
   1. Descongelar las células competentes en hielo.
   2. Añadir todo el volumen de la reacción de ligación a 50 l de células competentes, agitar suavemente el tubo e incubar la mezcla en hielo durante 30 min. Heat-Shock las bacterias durante 45 segundos a 42 ° C y respondió de inmediato en hielo; incubar en hielo durante otros 2 min.
   3. Añadir 950 l de caldo Luria a la cultura e incubar con agitación a 37 ° C durante 1 hora. Bacterias centrifugar a 2400 xg durante 3 min y volver a suspender el sedimento en 200 l de LB.
   4. Extender las bacterias transformadas en una placa de Petri recubierta con LB-agarosa y el antibiótico correspondiente. Incubar la placa durante la noche a 37 ° C.
   5. Por último, recoger 5-10 Bactecolonias rial y la cultura durante la noche a 37 ° C en 5 ml de medio LB con antibiótico.
   6. Se purifica ADN de plásmido usando un kit Mini ADN plásmido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realice una restricción de diagnóstico de digerir para verificar la incorporación correcta del inserto en el vector y presentar clones positivos para la secuenciación de ADN para asegurar la orientación correcta del inserto.
10. Seleccione las colonias correctas y ampliar la producción de ADN utilizando una alta calidad, endotoxina kit gratuito de preparación de plásmidos.
11. Eluir el ADN en agua estéril o mM Tris-HCl 1. ADN Almacenar a -20 ° C hasta el momento de inyectar en los recién nacidos.

2. Intra-ventriculares Neonatales Inyecciones

1. De tres a cuatro semanas antes de experimentar, crear una cría de ratón jaula con un macho y una hembra de ratón, y un iglú de plástico de colores. Esto proporciona un ambiente enriquecido y ayuda al proceso de apareamiento.
2. Cuando se confirma el embarazo, retire el male a una nueva jaula. Dieciocho días después del apareamiento, monitorear jaula todos los días para la entrega. Realizar inyecciones intraventriculares en el día postnatal 1 (P1).
3. Preparación de la solución de inyección
   NOTA: La solución de inyección se hace mezclando el ADN plasmídico con el reactivo de transfección para crear las partículas para la transfección. A continuación se muestra un ejemplo en la preparación de una solución para inyección utilizando un plásmido que codifica la transposasa Durmiente La Bella y la luciferasa: pT2 / SB100x-Luc y dos plásmidos transposón: PT / CAGGS-NRASV12 y pT / CMV-SV40-LgE, en una proporción de 1: 2: 2. Todos los plásmidos tienen una concentración de 2 g / l. Detalles importantes sobre la preparación de la solución inyectable se presentan en la Discusión.
   1. Preparar la solución de ADN mediante la adición: 4 mg (2 l) de pT2 / SB100x-Luc, 8 mg (4 mu l) de PT / CAGGS-NRASV12 y 8 mg (4 l) de PT / CMV-SV40-LgE y 10 l de 10% de glucosa a un volumen final de 20 l a una concentración de 1 mg / mlADN y 5% de glucosa.
   2. Preparar la solución de PEI mediante la adición de 2,8 l de in vivo chorro de PEI, 7,2 l de agua estéril, y 10 l de 10% de glucosa a una concentración final de 5% de glucosa.
   3. Añadir la solución de PEI a la solución de ADN, mezclar y agitar y dejar reposar a temperatura ambiente (RT) durante 20 min. La solución está ahora lista para la inyección. Después de una hora a temperatura ambiente, mantener la solución en hielo.
   4. Montar un 10 l jeringa limpia equipada con una aguja hipodérmica de calibre 30 con 12,5 ° de bisel en la microbomba (Figura 2 # 1).
4. Para verificar el correcto funcionamiento del sistema de inyección, utilice el inyector automático (Figura 2 # 1) para retirar 10 l de agua en la jeringa y luego vaciar la jeringa completamente
5. Se enfría la fase estereotáxica neonatal (Figura 2 # 3) con una suspensión de hielo seco y alcohol a una temperatura de 2-8 ° C.
6. Inducir la anestesia mediante la colocación de los cachorros en hielodurante 2 min. Anestesia continuará en el marco estereotáxico refrigerada para el resto del procedimiento. El mantenimiento de la temperatura del bastidor encima de la congelación, entre 2-8 ° C evitará lesiones por quemaduras térmicas. Como cachorros precaución especial se pueden envolver en una gasa antes de colocar en hielo.
7. Llene la jeringa con la solución de ADN / PEI.
8. Inmovilizar el cachorro en el marco estereotáxico colocando su cabeza entre los barrotes del oído de gasa cubierta (Figura 2b). Asegúrese de que el lado dorsal del cráneo es horizontal, paralela a la superficie del marco y que las suturas craneales son claramente visibles. Limpiar la cabeza con etanol al 70%.
9. Bajar la aguja de la jeringa y ajustar las coordenadas estereotáxicas utilizando diales del marco estereotáxico hasta que la aguja toque el lambda (la intersección de la línea media de los huesos parietal y occipital) (Figura 2b).
10. Levante la aguja y ajustar las coordenadas estereotáxicas a 0,8 mm lateral y 1,5 mm rostral a la lambda (Figura 2b).
11. Baje la aguja hasta que llegue y hoyuelos ligeramente la piel. Mida las coordenadas. Baje la aguja otros 1,5 mm. La aguja perforar la piel y el cráneo, y pasar a través de la corteza para entrar en el ventrículo lateral (Figura 2c).
12. Utilizando el inyector automático, inyectar 0,75 l de la solución de ADN / PEI a una velocidad de 0,5 l / min
13. Mantenga el cachorro en el bastidor para otro minuto para permitir la solución para dispersar hacia los ventrículos. Mientras tanto, anestesiar otra pup, en hielo durante 2 min en preparación para la siguiente inyección.
14. Levante con cuidado y lentamente la aguja y coloque el cachorro bajo una lámpara de calor. Controlar la respiración y la actividad. Si es necesario, proporcionar una estimulación suave de las extremidades hasta la primera respiración sobreviene.
15. Devuelva el cachorro a su madre después de que se haya calentado, ha llegado a un color rosado, respira regularmente y está activo, normalmente 5-7 min. Si more de un cachorro se inyecta a la vez, mantenga todos los cachorros juntos hasta que se realicen todas las inyecciones. Si las inyecciones tardan más de 30 min, devuelva la mitad de las crías después de la primera 30 min y el resto al final del procedimiento.
16. Supervisar que la presa es sensible y alimentar a sus crías. Si es necesario, agregue una madre sustituta a la jaula.
17. Asegúrese de que el intervalo entre la colocación de la cría en hielo y colocarlo bajo la lámpara de calentamiento es inferior a 10 min. Cuanto más rápido el procedimiento mejor es la supervivencia. Por lo general, el tiempo que toma para anestesiar e inyectar un cachorro es 4 min.

3. La bioluminiscencia Seguimiento de Formación y progresión tumoral

3.1) Monitoreo plásmido Absorción después de la inyección

1. 24-72 horas después de la inyección, retire todos los cachorros de la jaula de la madre y el lugar en un 6 bien limpia placa de cultivo de tejidos, una cría por pocillo.
2. Preparar una solución de 30 mg / ml de luciferina disuelto en solución salina normal o Phosphattampón e. Preparar esta solución por adelantado y mantener en pequeñas alícuotas a -20 ° C.
3. Con una jeringa de 1 ml equipada con una aguja hipodérmica de calibre 30 se inyectan 30 l de luciferina subcutánea entre los omoplatos del cachorro. Asegúrese de que la aguja no perforar cualquier órgano, pellizcando la piel y levantar ligeramente antes de insertar la aguja.
4. Imagen de inmediato, utilizando un sistema vivo imágenes de bioluminiscencia en. Para el espectro IVIS, utilice los siguientes ajustes para adquisiciones: exposición automática, gran hurgar en la basura, y el diafragma f = 1.

3.2) La formación de Monitoreo y progresión tumoral

NOTA: Animales empezará la formación de tumores macroscópicos detectables mediante bioluminiscencia y la histología dentro de 2½-6 semanas, en función de los plásmidos inyectados oncogénicos.

1. Usando una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 26 se inyectan 100 l de una solución de luciferina 30 mg / ml por vía intraperitoneal.
2. Colocar el animal en la cámara de anestesia. Inyectar hasta cinco animales al mismo tiempo.
3. Espere 5 min a continuación, iniciar el flujo de oxígeno / isoflurano (1.5 a 2.5% de isoflurano) para anestesiar a los animales. Después de 3-4 minutos, retirar los animales de la cámara de anestesia, inicie el flujo de oxígeno / isoflurano en la cámara de bioluminiscencia. Colocar los animales en las respectivas ranuras equipadas con conos de ojiva de vidrio para permitir la anestesia y el paso sin obstrucciones de la luz.
4. Típicamente, adquirir una serie de imágenes 6, a intervalos de 2 min con un tiempo de exposición automático, binning mediana y una abertura abierta de f = 1.
5. Establecer la región de interés para todos los animales fotografiados, típicamente un óvalo sobre la región de la cabeza, y medir la intensidad de la luminiscencia usando las unidades de fotones calibrados / s / ^cm2 / sr.
6. Registre el valor máximo para cada animal. Posteriormente, las grabaciones pueden ser comparados durante la progresión del tumor para cada animal y / o entre los animales, por ejemplo when se emplean diferentes tratamientos.

4. histológico e inmunohistoquímico Análisis de Nueva GBMs

NOTA: Cuando los tumores han alcanzado el punto de tiempo deseado experimental, los animales pueden ser sacrificados, los cerebros perfundidos, fijos y analizados. Para la supervivencia se analiza la fase moribunda representa el punto final del experimento, cuando los animales son sacrificados humanitariamente a los primeros signos de la carga tumoral, según la definición de la etapa clínica cuando el animal se convierte en problemas de movilidad que muestra sintomática, postura encorvada y pelaje desaliñado. Una breve descripción de los métodos histológicos y inmuno-histoquímica estándar utilizados se presenta a continuación.

4.1) Perfusión y Fijación

1. Anestesiar al ratón con una inyección intra-peritoneal de 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina.
2. Compruebe el reflejo pedal pellizcando los pies del ratón. Cuando se abolió este reflejo, lo que indica una anestesia profunda, immobilize el ratón sobre una tabla de disección con alfileres, abrir la cavidad abdominal, diseccionar el diafragma y abrir la cavidad torácica para visualizar el corazón.
3. Inserte una cánula roma de calibre 20 en el ventrículo izquierdo del corazón. Conectar la cánula con un tubo de plástico que pasa a través de una bomba peristáltica a un recipiente con solución oxigenada y heparinizada de Tyrode (NaCl al 0,8%, 0,0264% CaCl ₂ 2H ₂ O, 0,005% de NaH ₂ PO _4, 0,1% de glucosa, 0,1% de _NaHCO3, 0,02 % KCl). Iniciar el flujo de la solución de Tyrode mediante el ajuste de la velocidad de la bomba peristáltica para asegurar un flujo lento y constante, aproximadamente una gota por segundo o menos si los animales son más pequeños.
4. Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón para permitir el drenaje de la sangre y de Tyrode.
5. Controlar la eficiencia de perfusión mediante la observación de escaldado de los órganos internos (más evidentes en el hígado y el riñón) a medida que estén desprovistos de sangre.
6. Cuando elsolución de drenaje desde el corazón es evidente (3-5 min), cambiar las soluciones de Tyrode de al 4% de paraformaldehído para la fijación (4% PFA, pH 7,34 en tampón fosfato salino).
7. Monitorear buena fijación de los tejidos por el aumento de la rigidez del cuello y la cola.
8. Decapitar al ratón y diseccionar cuidadosamente el cerebro del cráneo.
   1. Tire de la piel que cubre el cráneo rostral, hacia la nariz, y agarrarlo firmemente para estabilizar la cabeza, dorsal hacia arriba.
   2. Con un bisturí afilado, corte hacia abajo a lo largo del borde de la órbita, a seccionar los músculos orbitales y los arcos cigomáticos subyacentes.
   3. Gire la cabeza cara ventral hacia arriba y retire los músculos del cuello conectados usando una gubia. Aplastar la primera vértebra y retírela del tronco cerebral.
   4. Visualice la cóclea, agarrar el hueso temporal suprayacente con la gubia y crear una abertura entre el hueso temporal y occipital. Despegar el hueso occipital de la superficie del cerebelo.
   5. Aplastar el hueso que recubre la nariz con la gubia. Retire cuidadosamente la frontal y parietal huesos restante de la superficie del cerebro ser consciente de no dañar la superficie del cerebro. Preste especial atención en el área orbital.
   6. Gire la cabeza ventral hacia arriba. El cerebro se deslizará hacia abajo desde el resto del cráneo, conectado ahora únicamente a través de los nervios craneales. Usando pequeñas tijeras cortan el olfativo, óptico y los nervios trigémino. Esto liberará el cerebro.
9. Coloque cerebro en el 4% PFA durante la noche a 4 ° C para la post-fijación.
10. Para el análisis histológico y la tinción de hematoxilina-eosina, transferir los cerebros de tampón fosfato durante 24 horas y luego proceder a la incrustación de parafina.
11. Para el análisis de inmuno-histológico, transferir cerebros en una solución de sacarosa al 30% en solución salina tamponada con fosfato durante 24-48 h (hasta que los cerebros se hunden hasta el fondo del tubo)
12. Sección cerebros en un medio a través del centro de la región del tumor, coloque el cortedesventaja en un molde de congelación, incrustar en medios crio-incrustación (OCT compuesto), y el flash-congelación en una suspensión de etanol en hielo seco, isopentano hielo seco o en nitrógeno líquido. Mantenga bloques congelados a -80 ° C hasta el corte y tinción.

4.2) Los cerebros para el análisis histopatológico de la intrínseca GBMs hematoxilina-eosina tinción de parafina Embedded

1. Sección parafina embebido cerebros a las 4 micras de espesor, deje caer en un baño de agua de 42 ° C y montar en portaobjetos de vidrio.
2. Diapositivas De-paraffinize colocándolos durante 10 min en un horno de 60 ° C y luego transferirlos a intervalos de 5 min a través de una serie de tres recipientes de diapositivas llenas de xileno.
3. Hidratar los portaobjetos a través de una serie de baños de etanol: etanol al 100% durante 2 min, repetir una vez, etanol al 95% durante 2 min, repetir una vez, etanol al 70% durante 2 min y luego transferir diapositivas al agua.
4. Manchar los portaobjetos sumergiéndolos en un recipiente lleno de diapositiva Harris hematoxilina durante 2 min.
5. Enjuague con agua del grifo hasta que el agua salga limpia.
6. Dip desliza dos veces en la solución de azulado (0,1% Bicarbonato de Sodio).
7. Deje diapositivas están en agua del grifo durante 2 min, luego transferir a etanol al 80% durante 2 min.
8. Manchar los portaobjetos sumergiéndolos en un recipiente lleno con eosina para 5 min.
9. Deshidratar diapositivas en una serie de baños de etanol (80% de etanol 3-4 salsas, 95% de etanol 2 min, repetir una vez, 100% de etanol 2 min, repita una vez).
10. Claro con 3 baños consecutivos de xileno, 3 minutos cada uno.
11. Cubreobjetos con un medio de montaje a base de xileno y dejar secar en una superficie plana a temperatura ambiente hasta que esté listo para la imagen. Guarde a temperatura ambiente.

4.3) inmunohistoquímica de cerebros Embedded conservados Cryo para Molecular y Celular Caracterización de de novo inducida GBMs

1. Recuperar bloques congelados de la C de almacenamiento -80 °, coloque en criostato y permiten temperaturas equilibrar durante 30 min.
2. Sección 12-14 Micras de espesor secciones y montaje 2-3 secciones en portaobjetos de vidrio con carga positiva. Los cortes de secciones en serie, mediante la recopilación de las secciones adyacentes en diferentes diapositivas. Esto permite que la tinción con anticuerpos diferentes sobre secciones de tejido adyacentes dentro del tumor.
3. Diapositivas seca en un desecador durante al menos 1 hr después de la sección para permitir una buena adherencia del tejido.
4. Crea una barrera hidrófoba (con un marcador hidrófobo) en cada extremo de la corredera para permitir líquido para cubrir las secciones y para permanecer en la diapositiva durante los lavados. Cubrir las secciones con una solución de PBS con 0,1% Triton-X (PBS 0,1% Tx) y agitar suavemente durante 5 min en un agitador horizontal para permeabilizar el tejido. Repetir dos veces.
5. Bloquear la unión no específica con una solución de 10% de suero de cabra normal (o suero de animal en el que se elevó el anticuerpo secundario) durante 30 min con agitación suave
6. Preparar la solución de anticuerpo primario en 2% de suero normal de cabra en PBS 0,1%Tx y pipeta de la solución sobre las secciones. Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda cubierta en la oscuridad y mantener a temperatura ambiente durante la noche.
7. El día siguiente, lavar secciones tres veces durante 5 minutos con PBS 0,1% Tx y se incuban en anticuerpo secundario fluorescente diluido en 2% de suero normal de cabra PBS 0,1% Tx durante una hora.
8. Lavar las secciones tres veces durante 5 minutos con PBS 0,1% Tx, contrateñir con una tinción nuclear (por ejemplo, DAPI) durante 2 min, se lava una vez más, claro en agua y cubreobjetos con un medio de montaje de agua que preserve la fluorescencia basada. Coloque las diapositivas en una superficie plana y dejar que ellos curan durante al menos 24 horas, en la oscuridad, hasta que esté listo para la imagen. Mantenga a 4 ° C a partir de entonces.

5. Generación de tumor primario líneas celulares con alteraciones genéticas específicas.

1. Para generar líneas celulares de dormir ratones portadores de tumores de belleza seleccionar un ratón con tumor grande confirmado (bioluminiscencia 10 ⁷ -10 ⁸ fotones / s / cm2 / sr).
2. La eutanasia del ratón con una sobredosis de anestésico isoflurano, decapitar al animal y cuidadosamente diseccionar el cerebro del cráneo (como se describe en la sección 4). Coloque el cerebro en una placa de Petri limpia.
3. Utilizando una hoja de afeitar, hacer cortes coronales anterior y posterior al tumor. La ubicación del tumor es generalmente reconocible debido a la transparencia del cerebro.
4. Disecar el tumor, por lo general 5-7 mm de diámetro con pinzas finas y colocar en un tubo de 1,5 ml lleno con 300 l Neural Stem Cell Media (NSC medios: DMEM / F12 con B-27 suplemento, N2, y Normocin, complementado con EGF humano recombinante y bFGF a una concentración de 20 ng / ml cada uno).
5. Homogeneizar suavemente tumor con una mano de mortero de plástico, que se ajusta a las paredes del tubo.
6. Añadir 1 ml de solución de disociación de tejido libre de enzimas y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
7. Pase suspensión celular a través de un filtro de células de 70 micras, lavar el filtro con 10 ml deMedios NSC, centrifugar a 300 g durante 4 min, el sobrenadante decante y volver a suspender pellet en 7 ml de medio NSC.
8. Placa en un matraz de cultivo T25 y de cultivo a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos con y la atmósfera de 95% de aire y 5% de CO _2. Después de 3 días, algunas células han muerto, algunos adherido a la parte inferior de la placa de cultivo, y algunos están formando neuroesferas, flotando libremente en los medios de comunicación.
9. Retire estas células en suspensión y re-placa en un frasco de cultivo de tejido T75.
10. Después de otros tres días de cultivo, recoger neuroesferas, disociar como se describe en el paso 5.6, la tensión a través de filtro de células y contar las células. Congelar alícuotas de células en suero bovino fetal 10% de DMSO y células de paso a una densidad de un millón de células en 14 ml de NSC suplementado con EGF y FGF para un matraz T75. La tasa de crecimiento dependerá de los oncogenes utilizados para generar tumores. Adaptar las condiciones de cultivo celular para prevenir el crecimiento excesivo y mantener las células en una densidad relativamente alta.

Resultados

Para caracterizar rasgos histopatológicos de glioblastomas inducidos-SB, los ratones neonatales C57 / BL6 fueron inyectados en P1 con un plásmido que codifica la luciferasa (pT2 / SB100x-Luc) en combinación con plásmidos que codifican transposones con ADN oncogénico, es decir, las ANR (pT / CAGGS -NRASV12) y SV40 LgE (pT / CMVSV40-LgE) (Figura 3c) o un plásmido que codifica un p53 de horquilla corta con PDGFβ y un reportero GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) en combinación con las ANR (Figu...

Discusión

En este artículo, te detallamos un método versátil y reproducible para la generación de nuevos modelos de GBM mediante la integración SB transposase- mediada de ADN plásmido oncogénica en células que rodean la zona subventricular de ratones recién nacidos. Se presenta un protocolo para generar plásmidos transposón con nuevos genes de interés, ilustramos cómo monitorizar la progresión de los tumores en los animales vivos, y cómo caracterizar rasgos histopatológicos y inmunohistoquímicos de estos tumores.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Stoelting's Lab Standard con adaptadores para ratas y ratones	Stoelting	51670	Otras empresas producen marcos similares, cualquiera de ellos con adaptadores de ratón pequeños son adecuados
Inyector estereotáxico por excelencia (QSI)	Stoelting	53311	Las inyecciones se pueden hacer sin él, ,pero       El inyector automático permite una mayor reproducibilidad y comodidad
10 μ l Jeringa de MICROLITROS ajustada a mano de la serie 700	Hamilton	Modelo 701	Este modelo de jeringa suministrará de 0,5 a 500 ul de solución de forma fiable. También se pueden utilizar otras jeringas (por ejemplo 5 ul, Modelo 75) aguja
hipodérmica de calibre 30 (1,25", 15o bisel)	Hamilton	S/O# 197462	Esta aguja es ideal para perforar la piel y el cráneo de un ratón neonatal sin necesidad de otros procedimientos invasivos. Si se vuelve opaco (no entra fácilmente en la piel), debe ser reemplazado.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Alícuota en pequeños volúmenes y mantener a -20 oC
D-Luciferina, Sal de Potasio	Goldbio.com	LuckK-1g	Otras fuentes de lucifirerasa de lucilucicerasa son igual de adecuadas
Solución de hematoxilina,	Harris Modified Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Ciencias	de la Microscopía Electrónica Compuesta 62550-01		Para la inclusión de cerebros para la criosección y la inmunohistofemistry
DMEM/F-12 avanzado, sin glutamina	Life Tecnologías	12634-010	Para la cultura de las neurosferas
B-27¨ Suplemento (50X), sin suero	Life Technologies	17504-044	Suplemento sin suero para el cultivo de neuroesferas
N2 Suplemento (100x)	Life Technologies	17502-048	Suplemento sin suero para el cultivo de neuroesferas
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	Agente anti-micoplasma para el cultivo de neurosferas
Egf humano recombinante	PEPROTECH	AF-100-15	Suplemento de factor de crecimiento para el cultivo de  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	Suplemento de factor de crecimiento para el cultivo de  neurospheres
[header]
HyClone HyQTase  Reactivo de desapego de células	Thermo Scientific	SV3003001	Para la disociación de neurosferas
Kimble-Chase Kontes Pellet Mortle	Fisher Scientific	K749510-0590	Para la disociación de tumores recién disecados
Falcon Cell Strainers tamaño de malla 70 mmm	Fisher Scientific	08-771-2	Para generar suspensiones unicelulares de neurosferas disociadas
Xilenos Grado histológico	Fisher Scientific	C8H10
Protocolo Harris Hematoxilina Libre de mercurio (acidificado)	Fisher Scientific	245-678
Protocolo Eosyn Y Solución (intensificado)	Fisher Scientific	314-631