Aquí describimos un protocolo eficiente y versátil para inducir, monitorizar y analizar nuevos glioblastomas (GBM) utilizando ADN transposón inyectado en los ventrículos de ratones neonatos. Las células de la zona subventricular, que absorben el plásmido, se transforman, proliferan y generan tumores con características histopatológicas de GBM humano.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Transposón mediada Integración de ADN plásmido en la zona subventricular de ratones recién nacidos para generar modelos novedosos de glioblastoma
En este artículo
Resumen
Resumen
Existe una necesidad urgente de probar la contribución de nuevos genes a la patogénesis y progresión de los glioblastomas humanos (GBM), el tumor cerebral primario más común en adultos con pronóstico sombrío. Nuevas terapias potenciales están emergiendo rápidamente de los laboratorios y requieren pruebas sistemáticas en modelos experimentales que reproduzcan fielmente las características más destacadas de la enfermedad humana. En este trabajo describimos en detalle un método para inducir nuevos modelos de GBM con integración de ADN plasmídico mediada por transposones en células de la zona subventricular de ratones neonatos. Presentamos una forma sencilla de clonar nuevos transposones susceptibles de integración genómica utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente e ilustramos cómo monitorear la absorción de plásmidos y la progresión de la enfermedad utilizando bioluminiscencia, histología e inmunohistoquímica. También describimos un método para crear nuevas líneas celulares primarias de GBM. Idealmente, este informe permitirá una mayor difusión del sistema de transposones de la Bella Durmiente entre los investigadores de tumores cerebrales, lo que conducirá a una comprensión profunda de la patogénesis y progresión de la GBM y al diseño y prueba oportunos de terapias efectivas para los pacientes.
Introducción
El glioblastoma multiforme (GBM) es el (60%) tumor cerebral primario más común en adultos, con una supervivencia media de 15-21 meses cuando fueron tratados con cirugía, radioterapia, y quimioterapia 1. Terapias novedosas para GBM son imprescindibles. Las terapias experimentales requieren pruebas en modelos animales que reproducen adecuadamente las características más destacadas de la enfermedad humana. Estrategias para inducir GBM en roedores incluyen mutagénesis química con agentes alquilantes, línea germinal o alteraciones genéticas somáticas, o el trasplante usando líneas celulares de glioma 2. Los modelos más utilizados emplean la implantac....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: Todos los animales protocolos fueron aprobados por la Universidad de Michigan Comité para el Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA).
1. Clonación de la secuencia de interés en New dormir transposones Belleza
NOTA: Para insertar genes o elementos inhibitorios (como shRNA) utilizando el sistema de dormir transposasa Belleza, clonar la secuencia de interés en la columna vertebral de un pKT o plásmido pT2. Dirigir la clonación de tal manera que los elementos reguladores, genes de interés y marcadores permanecen flanqueadas por las repeticiones invertidas (IR / DR). Un ejemplo de clonación PDGFβ en una columna v....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para caracterizar rasgos histopatológicos de glioblastomas inducidos-SB, los ratones neonatales C57 / BL6 fueron inyectados en P1 con un plásmido que codifica la luciferasa (pT2 / SB100x-Luc) en combinación con plásmidos que codifican transposones con ADN oncogénico, es decir, las ANR (pT / CAGGS -NRASV12) y SV40 LgE (pT / CMVSV40-LgE) (Figura 3c) o un plásmido que codifica un p53 de horquilla corta con PDGFβ y un reportero GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) en combinación con las ANR (Figu.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En este artículo, te detallamos un método versátil y reproducible para la generación de nuevos modelos de GBM mediante la integración SB transposase- mediada de ADN plásmido oncogénica en células que rodean la zona subventricular de ratones recién nacidos. Se presenta un protocolo para generar plásmidos transposón con nuevos genes de interés, ilustramos cómo monitorizar la progresión de los tumores en los animales vivos, y cómo caracterizar rasgos histopatológicos y inmunohistoquímicos de estos tumores.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. John Ohlfest y a la Dra. Stacey Decker13 por el generoso regalo de plásmidos y por la formación proporcionada para dominar este método. Agradecemos a Marta Dzaman por su ayuda en la estandarización del procedimiento de tinción con hematoxilina-eosina de secciones incluidas en parafina. También agradecemos a Molly Dahlgren por leer detenidamente este manuscrito y proporcionar sugerencias útiles. Este trabajo cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH/NINDS a MGC y PRL, la subvención de la Fundación Leah's Happy Hearts a MCG y PRL. Premio al Investigador Joven de la Fundación Alex's Lemonade y la Beca de la Fundación St. Baldrick's ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Stoelting's Lab Standard con adaptadores para ratas y ratones | Stoelting | 51670 | Otras empresas producen marcos similares, cualquiera de ellos con adaptadores de ratón pequeños son adecuados |
| Inyector estereotáxico por excelencia (QSI) | Stoelting | 53311 | Las inyecciones se pueden hacer sin él, ,pero El inyector automático permite una mayor reproducibilidad y comodidad |
| 10 μ l Jeringa de MICROLITROS ajustada a mano de la serie 700 | Hamilton | Modelo 701 | Este modelo de jeringa suministrará de 0,5 a 500 ul de solución de forma fiable. También se pueden utilizar otras jeringas (por ejemplo 5 ul, Modelo 75) aguja |
| hipodérmica de calibre 30 (1,25", 15o bisel) | Hamilton | S/O# 197462 | Esta aguja es ideal para perforar la piel y el cráneo de un ratón neonatal sin necesidad de otros procedimientos invasivos. Si se vuelve opaco (no entra fácilmente en la piel), debe ser reemplazado. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | Alícuota en pequeños volúmenes y mantener a -20 oC |
| D-Luciferina, Sal de Potasio | Goldbio.com | LuckK-1g | Otras fuentes de lucifirerasa de lucilucicerasa son igual de adecuadas |
| Solución de hematoxilina, | Harris Modified Sigma Aldrich | HHS128-4L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Ciencias | de la Microscopía Electrónica Compuesta 62550-01 | Para la inclusión de cerebros para la criosección y la inmunohistofemistry | |
| DMEM/F-12 avanzado, sin glutamina | Life Tecnologías | 12634-010 | Para la cultura de las neurosferas |
| B-27¨ Suplemento (50X), sin suero | Life Technologies | 17504-044 | Suplemento sin suero para el cultivo de neuroesferas |
| N2 Suplemento (100x) | Life Technologies | 17502-048 | Suplemento sin suero para el cultivo de neuroesferas |
| Normocyn | InvivoGen | ant-nr-1 | Agente anti-micoplasma para el cultivo de neurosferas |
| Egf humano recombinante | PEPROTECH | AF-100-15 | Suplemento de factor de crecimiento para el cultivo de neurospheres |
| Recombinant Human FGF-basic | PEPROTECH | 100-18B | Suplemento de factor de crecimiento para el cultivo de neurospheres |
| [header] | |||
| HyClone HyQTase Reactivo de desapego de células | Thermo Scientific | SV3003001 | Para la disociación de neurosferas |
| Kimble-Chase Kontes Pellet Mortle | Fisher Scientific | K749510-0590 | Para la disociación de tumores recién disecados |
| Falcon Cell Strainers tamaño de malla 70 mmm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Para generar suspensiones unicelulares de neurosferas disociadas |
| Xilenos Grado histológico | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Protocolo Harris Hematoxilina Libre de mercurio (acidificado) | Fisher Scientific | 245-678 | |
| Protocolo Eosyn Y Solución (intensificado) | Fisher Scientific | 314-631 |
Referencias
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
- Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
- Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Ri....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
