Artículo de método

Utilizando adeno-asociado virus como una herramienta para estudiar las barreras de retina en la enfermedad

DOI:

10.3791/52451

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19 de abril de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Therapeutics, Institut de la Vision, Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968, 2INSERM, U968, 3CNRS, UMR_7210

En este artículo

Resumen

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Para investigar la permeabilidad de la barrera hematorretiniana y la integridad de la membrana limitante interna en modelos animales de enfermedad de la retina, utilizamos varias variantes de virus adenoasociados (AAV) como herramientas para etiquetar las neuronas de la retina y la glía. La expresión génica reportera mediada por virus se utiliza como indicador de la permeabilidad de la barrera retiniana.

Resumen

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Las células de Müller son las principales células gliales de la retina. Sus pies finales forman los límites de la retina en las membranas limitantes exterior e interior (ILM), y en conjunción con los astrocitos, los pericitos y células endoteliales que establecen la barrera sangre-retina (BRB). BRB limita el transporte de material entre el torrente sanguíneo y la retina mientras que la ILM actúa como una membrana basal que define histológicamente la frontera entre la retina y la cavidad vítrea. Etiquetado de las células de Müller es particularmente relevante para estudiar el estado físico de las barreras de la retina, ya que estas células son una parte integral de la BRB y ILM. Tanto BRB y ILM se alteran con frecuencia en enfermedades de la retina y son responsables de síntomas de la enfermedad.

Hay varios métodos bien establecidos para estudiar la integridad de la BRB, tales como el ensayo de azul de Evans o la angiografía con fluoresceína. Sin embargo, estos métodos no proporcionan información sobre el grado de permeabilidad BRB to moléculas más grandes, en el rango nanométrico. Además, no proporcionan información sobre el estado de otras barreras de la retina tales como la ILM. Para estudiar la permeabilidad BRB junto ILM de la retina, se utilizó un método basado en AAV que proporciona información sobre la permeabilidad de BRB a moléculas más grandes, mientras que indica el estado de las proteínas de ILM y de la matriz extracelular en estados de enfermedad. Dos variantes de AAV son útiles para tal estudio: AAV5 y ShH10. AAV5 tiene un tropismo natural para fotorreceptores pero no puede conseguir a través de la retina externa cuando se administra en el vítreo cuando la ILM está intacto (es decir, en las retinas de tipo salvaje). ShH10 tiene un fuerte tropismo hacia las células gliales y etiquetará selectivamente células de Müller en ambas retinas sanas y enfermas. ShH10 proporciona la entrega de genes más eficiente en retinas donde se ve comprometida ILM. Estas herramientas virales, junto con el análisis de inmunohistoquímica y de ADN de sangre arrojan luz sobre el estado de las barreras de la retina en la enfermedad.

Introducción

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Las células de Müller son el principal componente glial de la retina. Morfológicamente, que abarcan la retina radial y su endfeet, en contacto con el vítreo, se enfrentan a la ILM y componentes secretos de este último. El ILM es una membrana basal compuesta de unos diez diferentes proteínas de la matriz extracelular (laminina, agrina, perlecan, nidogen, colágeno y varios proteoglicanos de sulfato de heparina). Durante el desarrollo, su presencia es indispensable para la histogénesis de la retina, la navegación de axones ópticos, y la supervivencia de las células ganglionares de 1-3. Sin embargo, ILM no es esencial en la retina de adultos y se puede extirpar quirúrgicamente en ciertas patologías sin causar daño en la retina 4. En la terapia génica, esta membrana se convierte en una barrera física para la transducción eficiente de la retina utilizando AAV mediante inyección intravítrea 5.

A través de la extensa arborización de sus procesos, las células de Müller proporcionan suppo nutricional y regulatoriort a ambas neuronas de la retina y células vasculares. Las células de Müller también están involucrados en la regulación de la homeostasis de la retina, en la formación y mantenimiento de la BRB 6. Las uniones estrechas entre las células endoteliales de los capilares de la retina, las células de Müller, astrocitos y pericitos forman la BRB. BRB evita ciertas sustancias entren en los retina.In muchas enfermedades como la retinopatía diabética, oclusión venosa de la retina y las enfermedades respiratorias, la hipoxia de la retina provoca fugas a través de la BRB 7-9. Esta ruptura se asocia con un aumento de la permeabilidad vascular que conduce a edema vasogénico, desprendimiento de retina y daño en la retina.

Las células de Müller están estrechamente asociados con los vasos sanguíneos y la membrana basal, jugando un papel importante tanto en la integridad BRB y ILM. En consecuencia, el etiquetado de las células gliales de Müller es particularmente relevante para el estudio del estado físico de estas barreras de la retina.

Clásicoaliado, BRB permeabilidad se mide utilizando el ensayo de azul de Evans que consiste en la inyección sistémica de colorante azul de Evans, que se une no covalentemente a la albúmina plasmática. Este ensayo mide la pérdida de albúmina (proteína de tamaño intermedio, ~ 66 kDa) de los vasos sanguíneos en la retina (ver Protocolos Sección 5) 10. Alternativamente, la fuga vascular puede ser visualizado por la angiografía de fluorescencia de la retina en el que conste de fuga de fluoresceína (molécula pequeña, ~ 359 Da; véase Protocolos Sección 6) 11. Sin embargo, ambos métodos permiten la evaluación de la permeabilidad BRB a pequeñas moléculas y proteínas, pero que no proporcionan información sobre la integridad ILM.

Por lo tanto, para estudiar BRB permeabilidad, se utilizó un método basado en AAV que da información sobre la permeabilidad BRB a moléculas más grandes (por ejemplo, partículas de AAV, 25 nm de diámetro). De hecho, nuestro método puede detectar la presencia de transgen AAV en la sangre, lo que sugeriría que ~ partículas de 25 nm de diámetro haríaser capaces de infiltrarse en el torrente sanguíneo. Este método también proporciona información sobre la estructura de la ILM y las proteínas de la matriz extracelular en condiciones patológicas. Dos variantes de AAV son útiles para tal estudio: AAV5 y ShH10. Subretinally inyectado, AAV5 tiene un tropismo natural para los fotorreceptores y el epitelio pigmentario de la retina 12 pero no se puede conseguir a través de la retina externa cuando se administra en el vítreo en las retinas de tipo salvaje con ILM intacta 5,13. ShH10 es una variante de AAV que ha sido diseñado para dirigirse específicamente a las células gliales más de neuronas 14,15. ShH10 etiquetas selectivamente las células de Müller en ambas retinas sanas y enfermas con una mayor eficiencia en las retinas con barreras comprometidas 16. Estas herramientas virales junto con immuhistochemistry y el análisis de ADN de sangre proporcionan información sobre el estado de las barreras de la retina y su implicación en la enfermedad (Figura 1).

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Protocolo

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Todos los animales utilizados en este estudio fueron atendidos y manejados de acuerdo a la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research.

1. Producción de AAV recombinante (rAAV) por transfección transitoria de células HEK-293 17,18

NOTA: Ver McClure C, JoVE (2011) 19.

  1. Se purifica una preparación de plásmido a gran escala (por lo menos 1 mg / ml) de los plásmidos vectores de AAV. Utilice 3 plásmidos. El plásmido auxiliar AAV que lleva los genes de replicación y de la cápsida sin el terminal invertida de AAV ITRs se repite, el casete de expresión del transgén que lleva el AAV ITR conoce como el plásmido de transferencia, y el plásmido suministro de los genes auxiliares de adenovirus E2, E4, y los genes VA RNA que se hace referencia como pHELPER.
  2. Transfectar células 293 con estos 3 plásmidos usando polietilenimina (u otro reactivo de transfección). Por encima de 80% de eficiencia de transfección es necesario para una buena virendimientos RAL.
  3. Purificar AAV recombinante a partir de lisados ​​de células 293 en un gradiente de iodixanol. 15%, 25%, 40% y 60% iodixanol se utiliza para obtener el gradiente. Recoger la fracción de iodixanol 40% que contiene partículas de AAV, concentrar la fracción después de ultracentrifugación a 500.000 xg durante 1 hr y tampón de intercambio frente a PBS (tampón fosfato salino) con 0,001% de Pluronic.
  4. Para determinar el título genómica viral 20, realizar una DNAsa proteinaseK compendio seguido por QPCR. Los cebadores directo e inverso amplificar la región de 62 pb situada en el AAV2 ITR. Para el estándar plásmido, la sonda está marcada con FAM y tiene un agujero negro extintor (BHQ).
  5. Llevar a cabo qPCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa) en un volumen final de 25 l usando 340 nM cebador inverso ITR, 100 nM de cebador ITR hacia adelante, 100 nM de la sonda AAV2 ITR, 0,4 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq y plantilla 5 l (estándar, muestra y control sin molde).
  6. Parael estándar, utilice el plásmido para la transfección en 7 x 10 veces diluciones seriadas (5 l de cada uno de 2 x 10 9 a 2 x 10 3 genomas / ml que resulta en una concentración final de 10 octubre-10 abril genomas / ml).
  7. Comience el programa de una etapa de desnaturalización inicial a 95 ° C durante 15 min seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C en durante 1 min y recocido / extensión a 60 ° C durante 1 min. Almacenar a 4 ° C durante un almacenamiento a corto plazo oa -20 ° C para el almacenamiento prolongado.

2. inyección intravítrea de AAV

  1. Anestesiar a los ratones C57BL6J con ketamina (50 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) y verificar la pérdida del reflejo de enderezamiento, el reflejo de retirada y de pinzamiento del rabo de respuesta que indica una anestesia adecuada. Dilatar los alumnos mediante la aplicación de la córnea de neosinefrina 5% y 0,5% mydriaticum gotas para los ojos. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
  2. Aprobar un ultrafino 30 G disposabLe aguja a través de la línea ecuatorial y al lado del limbo, en la cavidad vítrea (ver Chiu K, JoVE (2007) 21). Inyectar 1 l de stock contiene de 1 a 4 x 10 11 vp de ShH10-GFP o AAV5-GFP con la observación directa de la aguja en el centro de la cavidad vítrea (Figura 1). Utilice un ojo como un control para los experimentos de ILM. Inyectar ambos ojos para experimentos BRB. Aplicar un tratamiento tópico antiinflamatorio y antibacteriano en los ojos inyectados.
  3. Dilatar alumnos con neosinefrina y cae mydriaticum ojo para la imagen. Realizar exámenes de fondo de ojo con una cámara de fondo de ojo para seguir GFP (Green Fluorescent Protein) expresión 1 semana, 2 semanas, 1 mes y 2 meses después de la inyección intravítrea (Figura 1). Sacrificar los ratones por inhalación de CO2 1 a 2 meses después de la inyección.

3. La inmunohistoquímica

  1. Para cryosections de la retina (Figura 1), diseccionar ojos enucleados para eliminar lens y la córnea, y la inmersión en solución 4% de paraformaldehído durante 1 hr.
    1. Cryoprotect los ojos previamente fijados en 10% de sacarosa durante 1 hora a temperatura ambiente, 20% de sacarosa para otra hora a temperatura ambiente. Cryoprotect en solución de sacarosa al 30%, durante la noche a 4 ° C. Congelar y incrustar ojeras en la incrustación de resina tal como Cryo-matriz. Hacer 10 micras cryosections y montar en portaobjetos tratados especialmente para las secciones de tejido congelado y que mejoran la adherencia del tejido durante la tinción.
    2. Permeabilizar secciones con 0,1% de Triton X100 en PBS pH 7,4 durante 5 min. Lavar 2x en PBS y el bloque durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS con 1% de BSA, 0,1% de Tween 20.
  2. Para flatmounts de la retina (Figura 1), fijar los ojos enucleados en 4% de paraformaldehído durante 15 min para facilitar la disección.
    1. En 15-30 min, diseccionar los ojos para eliminar la córnea y el cristalino. Se separa la retina del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y la esclerótica cortando alrededor de la ora serrata yel nervio óptico. Sumergir en paraformaldehído al 4% durante otros 30 min para fijar la retina y la proteína fluorescente en las células de la retina transducidas (fijación no debe exceder de 24 hr). Lavar 5 min en PBS estéril, pH 7,4.
    2. Cambiar el PBS a tampón de bloqueo (PBS con 1% de BSA, 2% de suero normal de cabra o de burro, 0,5% Triton X-100), e incubar en tampón de bloqueo, ya sea para 4 hr a temperatura ambiente o 4 ° C durante la noche.
  3. Incubar los tejidos con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo, ya sea para 4 horas a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche. Lavar 3 veces con PBS.
    NOTA: Los anticuerpos utilizados son los siguientes: anti-laminina (1 / 1.000) marcar la ILM, clon anti-rodopsina 4D2 (1/500) varillas de etiquetado, (1 / 1.500) de etiquetado células de Müller clon sintetasa anti-glutamina GS-6 , PNA lectina (1/40) conos de etiquetado.
  4. Incubar los tejidos con dilución 1: 500 de anticuerpos secundarios conjugados Alexa Fluor en tampón de bloqueo durante 1 hora (cryosections) o 2 hr (flatmounts) a tempe habitacióntura y protegido de la luz. Lavar 3 veces con PBS.
  5. Hacer el alivio de los recortes a la retina y flatmount sobre un portaobjetos de vidrio, ya sea con el fotorreceptor o el lado de células ganglionares de la retina (RGC) mirando hacia arriba. Añadir mountingmedium acuosa, aplique cubreobjetos y se almacena a 4 ° C.
  6. Realizar la microscopía confocal de escaneo láser confocal microscopio. Adquirir imágenes de forma secuencial, línea por línea, para reducir la excitación y la diafonía de emisiones. Definir tamaño de paso de acuerdo con el teorema de muestreo de Nyquist-Shannon. Utilice los ajustes de exposición que minimicen píxeles sobresaturados en las imágenes finales. Proceso de imágenes de 12 bits con FIJI, proyecto Z-secciones en un solo plano utilizando máxima intensidad bajo la función Z-proyecto y, finalmente, convertirse al modo de color de 8 bits RGB.

4. Análisis de PCR de muestras de sangre de ratón

  1. Inyectar 100 l de stock contiene de 1 a 4 x 10 11 partículas de un AAV-GFP en la vena del pene de ratones C57BL6J anestesiados (5% de isofluranopara la inducción en una cámara de cierre y 2,5% de isoflurano a través de un cono de la nariz durante la cirugía) usando una jeringa de insulina con una aguja de ultra-fina 6 mm. Este animal servirá como control positivo de la circulación de partículas de AAV.
  2. Muestra de sangre de la cola del ratón antes de la inyección y 3 horas, 24 horas, 2 días y 3 días después de la inyección intravítrea ShH10 o después de la inyección intrapeniles (Figura 1). Acerca de 10-20 l se recoge en tubos de heparina. Sacrificar los ratones por inhalación de CO 2 después de la finalización del procedimiento.
  3. Extraer el ADN genómico de las muestras de sangre utilizando el kit de extracción de su elección.
  4. Realizar la amplificación por PCR de ADN genómico. Para este protocolo utilice el siguiente par de cebadores: GFP, sentido 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', 5'-antisentido CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. El siguiente programa de PCR se realizó: 95 ° C 2 min (1 ciclo); 95 ° C 45 seg, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 seg (30 ciclos); 72 ° C 5 min (1 ciclo);4 ° C espera.

5. Opcional Evans Método Azul

NOTA: Cuantificar la permeabilidad vascular mediante la medición de la albúmina de fuga de los vasos sanguíneos en la retina utilizando el método de azul de Evans 10.

  1. Preparar colorante azul de Evans por disolución en una solución salina normal (6 mg / ml), sonicación durante 5 min en un limpiador ultrasónico, y filtración a través de un filtro de 5 micras.
  2. Anestesiar ratones C57BL6J (inhalación isoflurano, consulte el paso 4.1), comprobar la pérdida de los reflejos, el reflejo de retirada y la respuesta pizca de cola que indica una anestesia adecuada, y se inyecta azul de Evans (45 mg / kg) a través de la vena del pene (Figura 1). Compruebe que las patas, el hocico y las orejas de ratones se vuelven claramente azul después de la inyección azul de Evans, lo que confirma la captación y distribución del colorante.
  3. Anestesiar a los ratones C57BL6J 3 hr después de la inyección del colorante con ketamina (50 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) y verificar la pérdida de righting reflex que indica una anestesia adecuada. Muestra intracardially aproximadamente 500 l de sangre en tubos de heparina y perfundir los ratones para 2 min a través del ventrículo izquierdo con un tampón de citrato (0,05 M, pH 3,5; disolver 7,8 g de ácido cítrico y 3,8 g de citrato de sodio en 1 L de agua destilada) pre-calentado a 37 ° C para evitar la vasoconstricción. Los ratones se sacrificaron a través de la perfusión.
  4. Después de la perfusión, enucleate y cuidadosamente diseccionar los dos ojos bajo un microscopio quirúrgico para recoger las retinas (ver sección 3.2). Retinas secos en un evaporador centrífugo durante la noche, pesan, y extraer el colorante azul de Evans incubando retinas con 100 l de formamida de 18 horas a 65 ° C con agitación (100 xg). Muestras Centrífuga retina en 30K tubos de filtro omega en 20,798.5 xg durante 2 horas a 4 ° C y las muestras de sangre se centrifuga a 20,798.5 xg durante 15 min a 4 ° C.
  5. Use ambos sobrenadantes para medir la absorbancia. Determinar la absorbancia de cada muestra sustrayendo la absorbancia máxima for Evans azul a 620 nm al mínimo la absorbancia a 740 nm. Calcular la concentración de azul de Evans en el plasma y la retina de una curva patrón de azul de Evans en formamida. Expresar BRB permeabilidad en microlitros de azul de Evans por gramo de retina seco por hora (l plasma / g de peso seco de la retina / hr).

6. Opcional angiografía con fluoresceína

NOTA: Las fugas de los vasos sanguíneos de la retina en ratones puede ser visualizado por inyección intraperitoneal de fluoresceína de sodio.

  1. Anestesiar ratones C57BL6J (inhalación isoflurano, consulte el paso 4.1) y dilatar pupilas con gotas para los ojos (neosinefrina y mydriaticum). Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
  2. Inyectar por vía intraperitoneal 0,01-0,02 ml de 10% de fluoresceína sódica en 0,1 ml de solución salina estéril para la angiografía con fluoresceína.
  3. Recoge imágenes de ambos ojos después de la inyección utilizando una cámara de fondo de ojo. Sacrificar los ratones por inhalación de CO2 después de la proprocedimiento.
    NOTA: 20 segundos son necesarios para los vasos de la retina que se hacen visibles en la angiografía. Las imágenes tienen que ser capturado entre 3-10 min máximo después de la inyección de fluoresceína. Los puntos de fuga (si existe) se observan después de 2,5 min. En los puntos de tiempo posteriores la calidad de la imagen se pierde debido a la fluoresceína sódica difundirse en los así sólo imágenes vítreas, poco después de obtenidos se utilizan para el análisis.

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Resultados

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Nos esperar un aumento de la transducción de la retina de las células gliales de Müller utilizando ShH10 si el modelo animal muestra perturbaciones en la estructura de la ILM (Figura 2A - B). Por ejemplo, hemos demostrado que, en ausencia de DP71, objetivos ShH10 específicamente, pero de manera más eficiente Müller células gliales por inyección intravítrea, lo que indica aumento de la permeabilidad de la ILM en esta línea de ratón en comparación con ratones de tipo salvaje 16...

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Discusión

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El BRB regula el intercambio de moléculas entre la sangre y la retina. Su composición se asocia con varias enfermedades tales como la retinopatía diabética o la degeneración macular relacionada con la edad (AMD). Recientemente, hemos demostrado que en un ratón distrofina ronda, que muestra permeable BRB, la retina se vuelve más permisiva para la entrega de genes mediada por vectores virales adeno-asociados (AAV). Sin embargo, a pesar de BRB partículas de AAV permeabilidad intraocular inyectado mantenerse confinado en el...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a la plataforma de imagen del Institut de la Vision. Agradecemos a la Asociación Francesa de Distrofia Muscular (AFM) por una beca de doctorado para O.V. y Allergan INC. Este trabajo realizado en el marco del LABEX LIFESENSES [referencia ANR-10-LABX-65] contó con el apoyo de fondos estatales franceses gestionados por la ANR. Agradecemos a Peggy Barbe y Mélissa Desrosiers por su asistencia técnica con los preparativos de AAV. Agradecemos a Stéphane Fouquet su excelente asistencia técnica en microscopía confocal y su aportación experta en la interpretación de los resultados.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
C57BL6J ratones cepaJANVIER LABSratones
Ketamina 500Virbac Franciaanestésico
Xilacina Rompun 2%Bayer Healthcareanestésico
Neosinefrina 5% FaureEurophtadilatante
Mydriaticum 0.5%Theadilatante
SterdexNovartisantiinflamatorio
Cryomatrix resina de inclusiónThermo Scientific6769006
Superfrost Plus Portaobjetos de adhesión Portaobjetos10143352Thermo Scientific
anti-lamininaSigmaL9393anticuerpo
anti-rodopsina clon 4D2MilliporeMABN15anticuerpo
anti-glutamina sintetasa clon GS-6MilliporeMAB302anticuerpo
antiglial fibrilar Proteína ácidaDako334anticuerpo
PNA LectinInvitrogenL32459
sonda Alexa Anticuerpos secundarios conjugados con flúorAnticuerpo Invitrogen
Reactivo FluorsaveCalbiochem345789medio de montaje
QIAmp DNA Micro KitQIAGEN56304
GoTaq ADN polimerasaPromegaM3001
Evans Tinte azulSigmaE2129tinte
5 y micro; m filtroMillipore
Citrato de sodioSigmaS1804
Ácido cítricoSigmaC1909-2.5KG
Formamida espectrofotométricoSigma295876-2L
FluoresceínaSigmaF2456
colorante Micron IIIPhoenix Research LabsEl sistema de microscopía basado en una cámara a color 3-CCD, un capturador de fotogramas y un software listo para usar permite a los investigadores obtener imágenes de las retinas de los ratones.
Jeringas de insulinaTerumoSS30M3109
Jeringa 10 y micro; l HamiltonDutscher74487Seringue 1701
Aguja RN G33, 25 mm, PST 2Fisher Scientific11530332Inyección intravítrea
UltraMicroPump UMP3World Precision InstrumentsUMP3El inyector versátil utiliza microjeringas para suministrar volúmenes de picolitros
UltraMicroPump (UMP3) (uno) con controlador SYS-Micro4Controladordigital UMP3-1
Lupa binocular SZ76ADVILABADV-76B2Zoom 0,66 x 5 x LEDs con soporte epi y dia / Disección de retinas
Tijeras de muelle rectas - 8,5 cmBionic France S.a.r.l15003-08Disección de retinas
curvo tijera Vanna15004-08
Pince Dumont 511254-20
Veriti Termociclador de 96 pocillosLife technologies4375786Termociclador
Limpiador ultrasónicoSuministros de laboratorioG1125P1T
Tubos omega Nanosep 30kVWR
SpeedvacFisher ScientificSC 110 A
EspectrofluorómetroTECANinfinite M1000
de

Referencias

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