Un Análisis Comparativo de Expresión recombinante de proteínas en diferentes Biofactorías: Las bacterias, células de insecto y Plant Systems

Summary

En este estudio se comparó la expresión de una proteína recombinante humana diana en diferentes plataformas de producción. Nos centramos en los cultivos tradicionales basados en fermentadores y en las plantas, describiendo la configuración de cada sistema y destacando, sobre la base de los resultados informados, los límites y ventajas inherentes a cada plataforma.

Abstract

Sistemas a base de plantas se consideran una plataforma valiosa para la producción de proteínas recombinantes, como resultado de su potencial bien documentado para la producción flexible, de bajo costo de alta calidad, los productos bioactivos.

En este estudio, se comparó la expresión de una proteína recombinante humana diana en las culturas tradicionales a base de fermentador de células bacterianas y (insectos) con los sistemas de expresión basados ​​en plantas, tanto transitorios y estables.

Para cada plataforma, se describe la puesta a punto, la optimización y la duración del proceso de producción, la calidad del producto final y los rendimientos y se evaluaron los costes de producción provisionales, específicos para la proteína recombinante diana seleccionado.

En general, nuestros resultados indican que las bacterias no son adecuados para la producción de la proteína diana debido a su acumulación dentro de cuerpos de inclusión insolubles. Por otro lado, los sistemas basados ​​en plantas son plataformas versátiles tsombrero permite la producción de la proteína seleccionada a-menores costos que el sistema celular baculovirus / insecto. En particular, las líneas transgénicas estables muestran el más alto rendimiento del producto final y las plantas que expresan transitorios el desarrollo más rápido proceso. Sin embargo, no todas las proteínas recombinantes se pueden beneficiar de los sistemas basados ​​en plantas, pero la mejor plataforma de producción deben determinar empíricamente con un enfoque caso por caso, como se describe aquí.

Introduction

Las proteínas recombinantes se producen comercialmente en masa en sistemas de expresión heterólogos con la ayuda de herramientas biotecnológicas emergentes. Los factores clave que deben tenerse en cuenta a la hora de elegir el sistema de expresión heterólogo son: la calidad de la proteína, la funcionalidad, la velocidad del proceso, el rendimiento y el coste.

En el campo de las proteínas recombinantes, el mercado de productos farmacéuticos se está expandiendo rápidamente y, en consecuencia, la mayoría de los productos biofarmacéuticos producidos hoy en día son recombinantes. Las proteínas pueden expresarse en cultivos celulares de bacterias, levaduras, mohos, mamíferos, plantas e insectos, así como en sistemas vegetales (ya sea por transformación estable o transitoria) y animales transgénicos; Cada sistema de expresión tiene sus ventajas y limitaciones inherentes y, para cada proteína recombinante diana, el sistema de producción óptimo debe evaluarse cuidadosamente.

Las plataformas basadas en plantas están surgiendo como una alternativa importante a los sistemas tradicionales basados en fermentadores para la producción segura y rentable de proteínas recombinantes. Aunque los costos de procesamiento posteriores son comparables a los de las células microbianas y de mamíferos, la menor inversión inicial requerida para la producción comercial de plantas y la economía de escala potencial, proporcionada por el cultivo en grandes áreas, son ventajas clave.

Evaluamos plantas como biorreactores para la expresión de la isoforma de 65 kDa de la descarboxilasa del ácido glutámico humano (hGAD65), uno de los principales autoantígenos en la diabetes autoinmune tipo 1 (DT1). El hGAD65 se ha adoptado en gran medida como marcador, tanto para clasificar como para controlar la progresión de la enfermedad, y su papel en la prevención de la diabetes tipo 1 se está investigando actualmente en ensayos clínicos. Si estos ensayos tienen éxito, la demanda mundial de hGAD65 recombinante aumentará drásticamente.

Aquí, nos centramos en la expresión de la contraparte enzimáticamente inactiva de hGAD65, hGAD65mut, un mutante generado por la sustitución del residuo de lisina que une el cofactor PLP (piridoxal-5'-fosfato) con un residuo de arginina (K396R)¹.

hGAD65mut conserva su inmunogenicidad y, en células de plantas e insectos, acumula hasta diez veces más que hGAD65, su contraparte de tipo salvaje. Se planteó la hipótesis de que la actividad enzimática de hGAD65 interfiere con el metabolismo de las células vegetales hasta tal punto que suprime su propia síntesis, mientras que hGAD65mut, la forma enzimáticamente inactiva, puede acumularse en las células vegetales a niveles más altos.

Para la expresión de hGAD65mut, se exploró el uso de diferentes tecnologías, ampliamente utilizadas en biotecnología vegetal, y se comparó con las plataformas de expresión tradicionales (Escherichia coli y Baculovirus/células de insectos).

En este trabajo, se revisaron y compararon las plataformas recombinantes desarrolladas para la expresión de hGAD65mut que comprenden sistemas tradicionales y basados en plantas sobre la base de la velocidad y el rendimiento del proceso, y de la calidad y funcionalidad del producto final.

Protocol

1. Construcción de vectores de expresión

1. Comercial sistema de clonación de recombinación:
   1. Amplificar la secuencia de longitud completa del gen diana (hGAD65mut) con cebadores apropiados permite la adición de una abrazadera CACC en el extremo 5 'del gen como se describió anteriormente ^2.
   2. Clonar el producto de amplificación se purificó en gel, de acuerdo con las especificaciones del kit de clonación direccional, en el vector de entrada (topoisomerasa obligado) mediante el ensamblaje de la reacción en un volumen total de 6 l, usando una proporción de 1,5: 1 molar de inserción: vector y 1 l de solución de sal (NaCl 0,2 M y 0,01 MgCl _2). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
   3. Transformar la reacción completa en E. químicamente competentes coli células de acuerdo con las especificaciones de dirección del kit de clonación y pantalla colonias obtenidas por PCR colonia ^3, utilizando M13 adelante y atrás primers incluidas en el kit de clonación direccional. Aislar el plásmido de una pocolonia sibles según las especificaciones de preparación de plásmidos de ADN del kit y la secuencia de inserción utilizando M13 adelante y atrás primers para garantizar la ausencia de mutaciones ^3.
   4. Utilice el clon de entrada obtenida para realizar la reacción de recombinación por la recombinasa Clonase Lambda II Enzyme (LR) con destino vectores específicos: para la expresión de proteína recombinante en células bacterianas con pDEST17 (produciendo pDEST17.G65mut), en plantas (transitoria o estable) con pK7WG2 (produciendo pK7WG2.G65mut), en el sistema de baculovirus / células de insecto con el ADN viral linealizado (produciendo Baculo.G65mut) ^4. Montar la reacción, de acuerdo con las especificaciones del kit Clonase, con 100 ng de vector de entrada, 150 ng de vector de destino y 2 l de mezcla de enzima en un volumen final de 10 l. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hr.
   5. Transformar el producto de recombinación en E. químicamente competentes coli células de acuerdo con las especificaciones del kit Clonase. Pantalla colonias obtenidas por PCR ³ utilizando para todas las colonias derivadas reacción de transformación de la misma cebador inverso GAD65mut-específico (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ') y los siguientes vectores de destino cebadores directos específicos: para pDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'; para pK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '; para Baculo vector linealizado: 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 '.
   6. Aislar el ADN plásmido utilizando un kit de minipreparación de ADN comercial y confirmar la presencia de la secuencia diana por PCR ^3, utilizando las mismas combinaciones de cebadores específicos descritos en el paso anterior.
   7. Usa los plásmidos PCR-positivos obtenidos para transformar diferentes organismos objetivo, dependiendo de la plataforma elegida para la expresión de proteína recombinante como se describe en los pasos siguientes.
2. Sistema de MagnICON ^5-7:
   1. Clonar el gen diana en el extremo 3 'del módulo pICH31070, como se ha descrito anteriormente en detalle ^7, produciendo pICH31070.G65mut. Utilice lasiguiente ciclo de reacción específica: 30 min de incubación a 37 ° C, 5 min a 50 ° C y luego 5 min a 80 ° C.

2. recombinante Expresión de Proteínas

1. Sistema de células bacterianas:
   1. Transformar pDEST17.G65mut en E. coli BL21 (DE3) células electrocompetentes utilizando técnicas estándar y la pantalla las colonias crecidas en que contiene ampicilina (100 mg / ml) de medio LB, por colonia PCR utilizando los cebadores siguientes transgenes específicos: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'y 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', con una temperatura de hibridación de 58 ° C y un tiempo de elongación de 20 seg. Llevar a cabo la reacción de PCR en un volumen total de 20 l después de disolver las células bacterianas con una punta de plástico en el tubo.
   2. Inocular una única colonia durante la noche a 37 ° C en 3 ml de ampicilina que contiene (100 mg / ml) de medio LB.
   3. Diluir el cultivo bacteriano 1: 100 en 100 ml de medio LB fresco (incluyendo ampicillin) y se incuba a 37 ° C durante 1-6 horas hasta que una DO final de ₆₀₀ 0.8.
   4. Inducir la expresión de proteína recombinante por adición de isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) a una concentración final de 1 mM y se incuba cultivo con agitación vigorosa durante 3 horas a 37 ° C.
   5. Recoger las células por centrifugación a 4000 xg durante 20 min y utilizar sedimento bacteriano para la extracción de proteínas (etapa 3.1.1.1).
2. Sistema / célula de insecto de baculovirus:
   1. Semilla Spodoptera frugiperda (Sf9) células en placas de 6 pocillos (8 x 10 ⁵ células por pocillo) y lavar dos veces con 2 ml de no suplementada insecto de Grace Medio.
   2. Retire y reemplace el gota a gota con la mezcla de transfección (5 l LR reacción recombinante, solución Celfectin 6 ly 200 l no suplementada insecto de Grace Medium) medio.
   3. Incubar las placas a 27 ° C durante 5 horas.
   4. Retire y reemplace mezcla de transfección con 2 ml de fresco Sf-900 medio, suplementado con suero bovino fetal al 10%, 10 mg / ml de gentamicina y 100 mM ganciclovir para seleccionar clones de baculovirus recombinantes.
   5. Después de la incubación durante 96 horas a 27 ° C, recoger medio (V1 madre viral), centrifugar a 4000 xg para eliminar las células y los desechos grandes y almacenar en la oscuridad a 4 ° C.
   6. Semilla de 1 x 10 ⁶ células Sf9 por pocillo en 2,5 ml Sf-900 medio que contiene suero bovino fetal al 10%, 10 mg / ml de gentamicina y 100 mM ganciclovir e infectar con 100 l de V1 stock en cada pozo.
   7. Se incuban las células durante 3 días a 27 ° C.
   8. Recoger y medio se centrifuga a 4000 x g.
   9. Almacenar el sobrenadante (V2 alto título de valores) a 4 ° C.
   10. Semilla de 1 x 10 ⁶ células Sf9 por pocillo en 2,5 ml Sf-900 medio que contiene suero bovino fetal al 10%, 10 mg / ml de gentamicina y 100 mM ganciclovir e infectar con 25 l de V2 stock en cada pozo.
   11. Se incuban las células durante 3 días a 27 ° C.
   12. Recoger las células por centrifugación a 4000 xg y utilizar pellet de células de insectos para la extracción de proteínas (paso 3.1.2. 1).
3. Nicotiana benthamiana sistemas de expresión transitoria:
   1. Crecer N. benthamiana plantas en un invernadero, bajo la luz natural dentro del rango de temperatura de 18-23 ° C. Para agroinfección utilizar las plantas 4-5 semanas de edad.
   2. Mantenga las plantas agroinfected en una cámara climática a 22 ° C con un 13 hr días / 11 hr noche fotoperiodo.
   3. Comercial sistema de clonación de recombinación:
      1. Introducir pK7WG2.G65mut en cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105 células electrocompetentes como se describe anteriormente y la pantalla ^8, las colonias cultivadas en medio LB con rifampicina (50 mg / ml), estreptomicina (300 mg / ml) y espectinomicina (100 mg / ml) después de 2 días de incubación a 28 ° C, por colonia PCR ⁸ utilizando los siguientes cebadores transgenes específicos: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 y #8217; y 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', con una temperatura de hibridación de 58 ° C y un tiempo de elongación de 50 seg. Llevar a cabo la reacción de PCR en un volumen total de 20 l.
      2. Inocular bacterias en 30 ml de medio LB con rifampicina (50 mg / ml), estreptomicina (300 mg / ml) y espectinomicina (100 mg / ml) durante dos días a 28 ° C.
      3. Recoger las bacterias por centrifugación a 4000 xg durante 20 min y resuspender el pellet en 10 ml de tampón de infiltración (MES 10 mM, 10 mM de MgCl _2, 100 acetosiringona mu M, pH 5,6). Medir el valor OD ₆₀₀ y luego ajustarlo a 0,9 mediante la dilución en el mismo tampón.
         NOTA: el volumen total necesario para infiltrarse en tres N. benthamiana plantas es de 30 ml.
      4. Utilice una jeringa 2,5 ml sin aguja para infiltrar la suspensión de Agrobacterium en N. benthamiana deja. Con cuidado y lentamente inyectar paneles de la hoja con la suspensión de la jeringa. Infíltrate en tres l ampliadoaleros por planta y utilizan tres plantas como triplicados.
         NOTA: por razones de salud y seguridad gafas de protección durante el proceso de infiltración.
      5. Recoger las hojas agroinfiltradas infección 2 días después (dpi) y la congelación en nitrógeno líquido. Tienda de tejidos vegetales a -80 ° C.
   4. Sistema MagnICON:
      1. Introducir los vectores MagnICON - el 'módulo (pICH20111), 3' 5 módulo (pICH31070.G65mut), y el módulo de la integrasa (pICH14011) - en A. tumefaciens cepa GV3101 utilizando técnicas estándar. Se tamizan los colonias, cultivadas en medio LB que contenía 50 mg / ml de rifampicina y antibiótico apropiado-vector específico (50 mg / ml de carbenicilina para pICH20111 y pICH14011, 50 mg / ml de kanamicina para pICH31070), mediante PCR de colonias usando cebadores específicos para cada vector.
      2. Inocular por separado los tres A. tumefaciens cepas en 5 ml de medio LB que contenía 50 mg / ml de rifampicina y antibióticos vector específico apropiadoy agitar durante la noche a 28 ° C.
      3. Pellets durante la noche cultivos de bacterias por centrifugación a 4000 xg durante 20 min y resuspender en dos volúmenes del cultivo bacteriano inicial de MES 10 mM (pH 5,5) y 10 mM MgSO _4.
      4. Mezclar volúmenes iguales de suspensiones bacterianas que contienen los tres vectores y utilizar la mezcla de la suspensión para la infiltración de la jeringa de N. benthamiana deja. Infíltrate en tres hojas expandidas por planta.
      5. Recoger las hojas agroinfiltrated en 4 dpi y congelar en nitrógeno líquido.
      6. Tienda de tejidos vegetales a -80 ° C.
4. Nicotiana tabacum sistema de expresión estable:
   1. Crecer y mantener las plántulas in vitro de N. tabacum (var Sr1.) en medio de cultivo de la planta sólido (4,4 g / L de Murashige y Skoog - MS - medio, incluyendo vitaminas, 30 g / l de sacarosa, pH 5,8, 7 g / L de agar planta) bajo condiciones controladas en cámara climática a 25 ° C con 16 horas de día / 8 h / nirégimen de lucha.
   2. Iniciar un pre-cultivo de A. tumefaciens EHA105 que alberga el vector de expresión pK7WG2.G65mut en 5 ml de medio líquido YEB con antibióticos adecuados (rifampicina 50 mg / ml, estreptomicina 300 mg / ml, espectinomicina 100 g / ml) y crecer durante la noche a 28 ° C en un agitador orbital conjunto a 200 rpm.
   3. Usar 1 ml de la pre-cultivo para inocular un cultivo de 50 ml de Agrobacterium en medio YEB más antibióticos (rifampicina 50 mg / ml, estreptomicina 300 mg / ml, espectinomicina 100 g / ml) y hacer crecer durante 24 horas, hasta que el cultivo bacteriano es saturado (OD ₆₀₀ valor de 0,5-1,0).
   4. Recoger las bacterias por centrifugación a 4000 xg durante 20 min y resuspender el pellet en 50 ml de medio de cultivo de la planta líquido. Repita este paso dos veces para eliminar completamente los antibióticos.
   5. Tome primero saludables hojas totalmente expandidas in vitro de plantas de tabaco en y cortarlas en aproximadamente 1 cm cuadrados.
   6. Trozos de hojas de Transferenciaa los platos Petri profundas que contiene suspensión bacteriana y dejar en la oscuridad durante 20 min.
   7. Retire los trozos de hoja de suspensión y secar sobre papel de filtro estéril.
   8. Coloque trozos de hoja con el lado adaxial (superficie superior de la hoja) en medio de cultivo sólido de plantas que contengan 1,0 g / ml 6-bencilaminopurina (BAP) y ácido 0,1 mg / ml naftaleno acético (NAA) y se incuban las placas durante dos días en una cámara climática en controlada condiciones (25 ° C, 16 horas día / 8 h noche).
   9. Trozos de hoja de transferencia sobre medio de cultivo sólido (incluyendo 1,0 mg / ml de BAP, 0,1 mg / ml de NAA, 500 mg / ml de cefotaxima, 100 mg / ml de kanamicina) con la superficie abaxial (superficie inferior de la hoja) en contacto con el medio.
   10. Incubar las placas durante 2-3 semanas en la cámara climática a 25 ° C con 16 h / 8 h régimen de día / noche para inducir la formación de brotes. Subcultura cada 2 semanas por la transferencia de explantes de hoja de medio de cultivo de la planta fresca sólido que contiene 1,0 mg / ml de BAP, 0,1 mg / ml de NAA, 500g / ml de cefotaxima y 100 mg / ml de kanamicina.
   11. Cuando los brotes aparecen transferirlos a cajas Magenta que contenían medio de cultivo sólido que incluye 500 mg / ml de cefotaxima y 100 mg / ml de kanamicina para inducir la formación de raíces. Incubar plántulas con 16 horas de día / 8 h noche fotoperiodo a 25 ° C durante 1-2 semanas.
   12. Cuando se forman las raíces, la transferencia de las plantas al suelo en el invernadero.
   13. Recoger un pedazo de hoja de cada planta y aislar el ADN genómico con un kit comercial.
   14. Detectar la presencia del transgén mediante PCR específica. Utilice 30 ng de ADN genómico como molde para la amplificación por PCR utilizando los cebadores siguientes transgenes específica: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'y 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', con una temperatura de hibridación de 58 ° C y un tiempo de elongación de 20 sec . Llevar a cabo la reacción de PCR en un volumen total de 50 l.
   15. Analizar el producto de 220 pb por electroforesis en gel de agarosa al 1% en Tris-EDTA-acetato tampón (TAE) (40 mM Tres decir, ácido acético 20 mM, y EDTA 1 mM).
   16. Seleccionar plantas transgénicas que contienen el gen diana.
   17. Se recoge una hoja de cada pieza de la planta transgénica seleccionada y congelar en nitrógeno líquido inmediatamente.
   18. Preparar extractos de proteínas totales de tejido de la hoja de la planta (paso 3.1.3) y probar cada muestra por Western blot como se describió anteriormente ² para seleccionar la mejor planta de tabaco que expresan la proteína recombinante.
   19. Flores Bolsa de la mejor planta de rendimiento seleccionado antes de la floración para evitar la polinización cruzada.
   20. Después de la floración, la maduración del fruto y el secado de semillas, recolectar bolsas.
   21. Semillas separadas de la paja y guárdelas en un lugar seco a temperatura controlada (20-24 ° C).
   22. Sembrar las semillas secas para producir las plantas transgénicas segunda generación y posteriormente seleccionar la mejor planta de rendimiento para ser auto-polinización.
   23. Repita el mismo procedimiento descrito en los pasos 2.4.19-2.4.21 para las generaciones posteriores.

3. Análisis de la expresión de proteínas recombinantes

1. La extracción total de proteínas:
   1. Las células bacterianas:
      1. Resuspender el sedimento celular bacteriana, recogidos como se describe en el paso 2.1.5, en la mitad del volumen de cultivo de solución salina tamponada con Tris (TBS - 2 mM Tris / HCl, NaCl 500 mM) pH 7,4 suplementado con phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM (PMSF).
      2. Sonicar resuspendió sedimento celular tres veces durante 40 segundos a media potencia, manteniendo la muestra en hielo.
      3. Aclarar lisado por centrifugación a 14.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
      4. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y almacenar tanto sobrenadante y el sedimento separado a -80 ° C.
      5. Solubilizar los cuerpos de inclusión, recogidas en el sedimento, en medio volumen de lisado celular de TBS pH 8,0 suplementado con 6 M urea por agitación vigorosa durante la noche a temperatura ambiente.
      6. Centrifugar a 10000 xg durante 25 min a temperatura ambiente y recoger el sobrenadante en un recipiente limpiotubo.
      7. Guarde tanto sobrenadante y el sedimento a -80 ° C.
   2. Las células de insecto:
      1. Lavar infectados pellet de células de insecto, recogidos como se describe en el paso 2.2.12, con 1 ml de tampón fosfato salino (PBS - NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO ₄₎ pH 7,4.
      2. Resuspender las células en 200 l de tampón de lisis (20 mM Tris / HCl pH 8,0, NaCl 0,5 M, 3 mM β-mercaptoetanol y 1% de Tween-20) e incubar en hielo durante 30 min.
      3. Centrifugar las células solubilizan a 14.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
      4. Reunir las fracciones solubles y almacenar a -80 ° C y descartar el pellet.
   3. Tejido de la hoja de la planta:
      1. N. Grind benthamiana o N. tejido tabacum a polvo fino en nitrógeno líquido utilizando mortero.
      2. Homogeneizar 100 mg de tejido triturado en 300 l de tampón de extracción (40 mM Hepes pH 7,9, DTT 5 mM, 1,5% CHAPS), Suplemented con 3 l de proteasa cóctel de inhibidores y descongelar en hielo.
         NOTA: la relación seleccionada entre el peso tejido de la planta (g) para amortiguar el volumen (ml) es 1: 3.
      3. Extracto de Centrifugar a 30000 xg durante 30 min a 4 ° C.
      4. Recoger el sobrenadante en un tubo limpio y se almacena a -80 ° C.
2. Tinción Coomassie gel:
   1. Preparar una dilución apropiada de extractos de proteínas totales (por ejemplo, 2 l de extracto de la planta, 5 l de extractos bacterianos y de insectos) a un volumen final de 10 l de tampón de extracción y añadir 5 l de tampón de muestra 3x (1,5 M Tris / HCl pH 6,8, 3% SDS, 15% de glicerol, 4% β-mercaptoetanol) hasta una concentración 1x final.
   2. Muestras Hervir durante 10 minutos.
   3. Proteínas separadas en un 10% SDS-PAGE.
   4. Después de la electroforesis, el gel de calor en presencia de la solución de Coomassie A (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% de isopropanol, 10% de ácido acético) en un horno microondas durante aproximadamente dos minutoss hasta el punto de ebullición.
   5. Enfriar gel a temperatura ambiente con agitación suave.
   6. Deseche la solución de tinción Coomassie A.
   7. Gel Destain por calentamiento en la presencia de Coomassie solución B (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% de isopropanol), C (10% de ácido acético) (0,002% Brilliant Blue R-250, ácido acético al 10%) y D cada vez siguiendo el mismo protocolo para la tinción.
   8. Después de la última etapa de calentamiento con una solución de D, dejar destaining gel hasta que el fondo es claro ^9.
3. El análisis de transferencia Western:
   1. Después de la electroforesis, la transferencia de proteínas a una membrana de nitrocelulosa utilizando técnicas y bloque con 4% de leche estándar separados en PBS pH 7,4 a temperatura ambiente durante 1 hr.
   2. Incubar la blot durante la noche a 4 ° C o durante 4 horas a temperatura ambiente en la solución de bloqueo que contiene anticuerpo de conejo primario elevado contra la proteína diana a 1: 10.000 y suplementado con 0,1% de Tween-20.
   3. Después de etiqueta anticuerpo primarioING, lavar la membrana 3 veces durante 5 min cada uno con solución de bloqueo que contiene 0,1% de Tween-20.
   4. Incubar con peroxidasa de rábano (HRP) anticuerpo anti-conejo -conjugate al 1: 10.000 durante 1,5 h.
   5. Lavar la membrana 5 veces durante 5 minutos cada uno con PBS-T (PBS suplementado con 0,1% de Tween-20).
   6. Proceso de transferencia de Western usando el sustrato de peroxidasa quimioluminiscente.
4. Radioinmunoensayo (RIA):
   1. Deje que los reactivos (antisuero, trazador y proteína A Sepharose) alcancen la temperatura ambiente y la pipeta de 20 l de muestras de extracto de proteínas y normas a diferentes concentraciones (de 300-2,400 ng / ml de hGAD65 comercial recombinante) en tubos de poliestireno de 12 x 75 mm.
   2. Añadir 20 l de antisuero, preparadas diluyendo 1:30 el suero de plasmaféresis de un paciente DM1.
   3. Añadir 50 l de trazador (125-I-GAD65) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Establecer un tubo con trazador sólo para estimar la actividad total.
   4. Añadir 50 lde la proteína A Sepharose y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
   5. Dosificar 1 ml de tampón PBS frío en cada tubo y centrifugar a 1500 xg a 4 ° C durante 30 min.
   6. Decantar los tubos para eliminar el sobrenadante y absorba el líquido residual en papel secante golpeando suavemente el tubo.
   7. Medida inmunoprecipitó radiactividad en todos los tubos contando durante 1 min en un contador gamma.
   8. Parcela en escala logarítmica las tasas vinculantes (B / T%) de los calibradores relacionados con la actividad total, para establecer la curva estándar y lea la concentración GAD de muestras fuera de la curva de calibración ^10.
      NOTA: Restringido áreas deben estar diseñados para el almacenamiento, manipulación y eliminación de material radiactivo.

Results

Un diseño experimental para la expresión heteróloga de una proteína recombinante diana en diferentes sistemas de producción se describe aquí. El primer foco fue la puesta en marcha de las diferentes plataformas mediante el establecimiento de las condiciones óptimas para la expresión de la proteína diana en cada sistema.

La expresión de la proteína diana, hGAD65mut, se indujo por triplicado E. culturas coli. Después de 3 h de expresión a 37 ° C, las células bacterianas se re...

Discussion

En este estudio tres plataformas diferentes se compararon para la expresión de una proteína humana recombinante: células bacterianas, células de baculovirus / insectos y plantas. La plataforma basada en plantas fue explorada aún más por la explotación de tres tecnologías de expresión ampliamente utilizado (es decir, transitoria - MagnICON y pK7WG2 base - y estables). La proteína diana escogido para este experimento, hGAD65mut, se ha expresado anteriormente en diferentes sistemas de ^13, y su producció...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extracto de levadura	Sigma	Y1333
Triptona	para medio	TRP03
Agar Bacteriológico	Applichem	A0949
Sf-900 II SFM medio	Gibco	10902-088
Grace' s Medio para insectos, sin suplementar	Gibco	11595-030
Cellfectin II Reactivo	Invitrogen	10362-100
MS medio que incluye vitaminas	Duchefa Biochemie	M0222
Sacarosa	Duchefa Biochemie	S0809
Agar vegetal	Duchefa Biochemie	P1001
Ampicilina sódica	Duchefa Biochemie	A0104	Sulfato de
gentamicina	Duchefa Biochemie	G0124
Ganciclovir	Invitrogen	tóxico I2562-023
Carbenicillina disódica	Duchefa Biochemie	C0109
Sulfato de kanamicina	Sigma	K4000
Rifampicina	Duchefa Biochemie	R0146	Tóxico y ndash; Stock de 25 mg/ml en DMSO
Sulfato de estreptomicina	Duchefa Biochemie	S0148	Toxico
Cimlorhidrato de espectinomicina	Duchefa Biochemie	S0188
IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside)	Sigma	I5502	Hidrato
MES	Sigma	M8250
MgCl2	Bioquímico	436994U
Acetosjeringa	Sigma	D134406	Tóxico – 0,1 M de stock en Jeringa DMSO
(1 ml)	Terumo
MgSO4	Fluka	63136
BAP (6-Benzilaminopurina)	Sigma	B3408	Tóxico
NAA (Ácido naftaleno acético)	Duchefa Biochemie	N0903
Cefotaxima	irritante Mylan Generics
Trizma base	Sigma	T1503	Ajuste el pH con 1 N HCl para hacer tampón Tris-HCl
HCl	Sigma	H1758	Corrosivo
NaCl	Sigma	S3014	1 M stock
KCl	Sigma	P9541
Na2HPO4	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P9791
PMSF (fenilmetanosulfonilofluoruro)	Sigma	P7626	Urea corrosiva, tóxica
Sigma		U5378
β-mercaptoetanol	Sigma	M3148	Tóxico
Tween-20	Sigma	P5927
Hepes	Sigma	H3375
DTT (Dithiothreitol)	Sigma	D0632	Tóxico – 1 M de stock, almacenar a -20 ° C
CHAPS	Duchefa Biochemie	C1374
Cóctel inhibidor de la proteasa vegetal	tóxico Sigma	P9599	No congelar/descongelar demasiadas veces
SDS (Sulfato de dodecilo de sodio)	Sigma	L3771	Inflamable, tóxico, corrosivo – 10% de stock
Glicerol	Sigma	G5516
Azul Brillante R-250	Sigma	B7920
Isopropanol	Sigma	24137
Ácido acético	Sigma	27221	Ácido
antiglutámico corrosivo descarboxilasa 65/67	Sigma	G5163	No congelar/descongelar demasiadas veces
Peroxidasa de rábano picante (HRP)-anticuerpo anti-conejo conjugado	Sigma	A6154	No congelar/descongelar demasiadas veces
Sf9 Cells Life	Tecnologías	11496
BL21 Competente E. coli	New England Biolabs	C2530H
Proteína A Sepharose	Sigma	P2545
Placas de cultivo celular	Sigma	CLS3516
Radioinmuno kit de ensayo	Techno Genetics	12650805	Material radiactivo