Artículo de método

Tridimensional Modelo Co-cultura para la interacción tumor estromal

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DOI:

10.3791/52469

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2 de febrero de 2015

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1Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Department of Clinical Laboratory, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 4Department of Biochemistry, Nihon University School of Dentistry, 5Department of Biochemistry, Ohu University School of Pharmaceutical Sciences

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para el cocultivo en tres dimensiones, que es útil para investigar las interacciones multicelulares y la modulación dependiente de la matriz extracelular del comportamiento de las células cancerosas. En este modelo experimental, las células cancerosas se cultivan en geles de colágeno incrustados con fibroblastos asociados al cáncer humano.

Resumen

La progresión del cáncer (iniciación, crecimiento, invasión y metástasis) se produce a través de interacciones entre las células malignas y las células del estroma tumoral circundante. El microambiente tumoral está compuesto por una variedad de tipos de células, como fibroblastos, células inmunitarias, células endoteliales vasculares, pericitos y células derivadas de la médula ósea, incrustadas en la matriz extracelular (MEC). Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) tienen un papel protumorigénico a través de la secreción de factores solubles, la angiogénesis y la remodelación de la MEC. Los modelos experimentales para la supervivencia, proliferación, migración e invasión de células cancerosas se han basado principalmente en cultivos de tejidos monocelulares y monocapa bidimensionales o ensayos de cámara de Boyden. Sin embargo, estos experimentos no reflejan con precisión las condiciones fisiológicas o patológicas de un órgano enfermo. Para comprender mejor las interacciones entre el estroma tumoral o la matriz tumoral, los cultivos multicelulares y tridimensionales proporcionan herramientas más potentes para investigar la comunicación intercelular y la modulación del comportamiento de las células cancerosas dependiente de la MEC. Como plataforma para este tipo de estudio, presentamos un modelo experimental en el que las células cancerosas se cultivan en geles de colágeno embebidos con cultivos primarios de CAFs.

Introducción

El tejido canceroso puede percibirse como un tipo de órgano, que evoluciona a través de interacciones cercanas entre el cáncer y el microambiente del estroma tumoral, compuesto por fibroblastos asociados al cáncer (CAF), células inmunitarias, vasos tumorales y la matriz extracelular (MEC). Los CAF son la principal fuente de factores solubles (citocinas, factores de crecimiento y quimiocinas) que ejercen efectos mitogénicos, pro-migratorios y pro-invasivos sobre las células cancerosas. También estimulan la formación de vasos tumorales y reclutan células precursoras, como las células derivadas de la médula ósea (BMDC). Los CAF activados están implicados en la producción y remodelación de la MEC, promoviendo así el crecimiento y la diseminación de las célulascancerosas 1. Los CAF también proporcionan un nicho que facilita la colonización y metástasis de las células tumorales y son capaces de conferir fenotipos de células madre a las células cancerosas vecinas. Las observaciones patológicas sugieren que las reacciones estromales o los cambios fibróticos en los tejidos cancerosos son indicativos de un mal pronóstico. Estudios recientes también han demostrado que las características del estroma tumoral, como la firma genética, pueden predecir el pronóstico del paciente. Además, los factores derivados de la CAF pueden modular la sensibilidad a la quimioterapia, lo que pone de manifiesto el papel de las CAF en la determinación de la sensibilidad y la resistencia a los fármacos2.

Dado que los CAF desempeñan un papel multifacético en la promoción de la progresión tumoral a través de vías de señalización que median las interacciones entre los CAF y diferentes tipos de células dentro del microambiente tumoral, han atraído cada vez más atención como nuevos objetivos para las terapias contra el cáncer. La heterogeneidad de las poblaciones celulares dentro del microambiente del cáncer presenta un obstáculo para dirigirse a los CAF. Se han propuesto varios marcadores para los CAF, como la actina del músculo liso α (α-SMA), la proteína de activación de fibroblastos (FAP) y el proten-1 específico de fibroblastos (FSP-1: también llamado S100A4); sin embargo, estos marcadores moleculares no son específicos para distinguir los CAFs de otras células presentes en tejidos no cancerosos3. Por lo tanto, se necesitan más estudios para obtener más conocimiento sobre las propiedades específicas de los CAF. Con este fin, es informativo caracterizar los CAF primarios cultivados en comparación con los fibroblastos normales emparejados por el paciente.

Recientemente, se han reportado análisis sobre CAFs derivados de pacientes en varios tipos de cáncer, revelando patrones de expresión génica y comportamientos celulares únicos en comparación con fibroblastos derivados de tejidos no cancerosos. Utilizando CAFs aislados de tejidos de cáncer de pulmón humano, desarrollamos un método de cocultivo tridimensional, lo que nos permitió evaluar las propiedades de los CAFs de pulmón. En este modelo, investigamos los efectos de los CAFs sobre la invasión de células de cáncer de pulmón, la proliferación y la contracción del gel de colágeno, lo que recapituló experimentalmente las funciones promotoras de tumores de los CAFs de pulmón4.

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Protocolo

NOTA: Este estudio fue aprobado por los Comités de Ética apropiados.

1. cultivo primario de fibroblastos humanos de pulmón

  1. Colección de tejido pulmonar:
    1. Obtener muestras de tejido de pulmón humano de la sala de operaciones quirúrgicas directamente. Recoger aproximadamente 1 cm 3 cuadras del tejido pulmonar canceroso y no canceroso, con la muestra no cancerosa recogido tan lejos de tumor posible.
    2. Suspender las muestras en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,25 mg / ml de anfotericina B (medio libre de suero). Mantener las muestras en suspensión en 50 ml tubos estériles y traslado al laboratorio.
      NOTA: Los fibroblastos son altamente migratoria y proliferativa en comparación con otros tipos de células, tales como células epiteliales, endoteliales y células musculares lisas. El método de derivación se aprovecha de estas características de los fibroblastos, y outgrolas células del ala de las secciones de tejido son abundantes en los fibroblastos. Después de varios pases celulares, otros tipos de células no sobreviven y propagar en DMEM con suero bovino fetal al 10% (FBS), resultando en cultivos celulares de fibroblastos purificados. Las células podrían utilizarse 3-7 pasajes siguientes cultivo primario.
  2. Cultura explante y acondicionamiento de crecimiento externo celular:
    1. Realizar cultivo primario de fibroblastos utilizando un protocolo informó anteriormente con modificaciones 5.
    2. En el laboratorio, colocar la muestra de tejido en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos sin medio de cultivo y se corta en pequeñas secciones ~ 2-3 mm de tamaño usando pinzas estériles y un bisturí. Durante este proceso, evitar hacer la sección seca, de lo contrario la eficiencia del crecimiento de la célula está alterada.
  3. La separación de la capa de células epiteliales y del tejido conectivo:
    1. Remoje las secciones de tejido cortado en medio de cultivo que contiene 2.000 UF / ml dispasa I y cultura durante 16 horas a 4 ° C.
    2. Transferencia de las secciones de tejido a un plato, y separar la capa de células epiteliales del tejido conectivo adyacente. Procesar las secciones en un banco limpio para evitar la contaminación de microorganismos.
      NOTA: Si se necesita un cultivo primario de células epiteliales, realice el paso 1.3. Si sólo fibroblastos deben ser aislados, omita el paso 1.3 porque la cultura explante y celulares pasajes posteriores son desfavorables para las células epiteliales, que producen poblaciones de fibroblastos purificados.
  4. La unión de las secciones de tejido:
    1. Picar los tejidos en piezas de 1 mm utilizando dos escalpelos. Si las piezas no son lo suficientemente pequeños, se desprenden más fácilmente del plato, y las células no podrán superar en la superficie del plato.
    2. Coloque pequeñas secciones de tejido de pulmón separados unos de otros para mantener un área vacía rodea a cada pieza. Hacer arañazos en la superficie de la placa de cultivo de tejidos utilizando una hoja de bisturí para facilitar la unión de secciones de tejido.
      NOTA: Rascarsetambién parece facilitar la derivación de células, proporcionando pistas a lo largo de la cual las células pueden migrar.
      1. Como alternativa, coloque trozos de tejido picado individualmente en cada pocillo de una placa de 6 pocillos y cubrirlos con un cubreobjetos. Coloque la hoja de la cubierta a la superficie de la placa con grasa de silicona.
      2. Coloque grasa de silicona en dos puntos 1.5 cm de separación, en cada pocillo utilizando un pasador estéril. Cobertura de las piezas de tejido mejora la eficacia del crecimiento de las células y la propagación de células después de varios pasajes.
  5. Cultura explante subsiguiente:
    1. Añadir suavemente medio de cultivo para el plato antes de las secciones de tejido se secan, como consecuencia de células eficiente se pierde en su mayor parte si las muestras se sequen. No vierta el medio con demasiada rapidez como las secciones de tejido se separe.
    2. Células de cultivo en DMEM con 10% de FBS. Utilice medio suficiente para cubrir sólo el tejido, pero no demasiado, que permite flotante, como la flotabilidad adicional promueve la separación de laplato.
  6. Pasaje de la célula:
    1. Maneje el medio de cultivo con cuidado en todo momento como movimientos repetidos de la placa de cultivo puede dar lugar al desprendimiento de las secciones de tejido.
    2. Coloque las placas de cultivo en una incubadora a 37 ° C durante 5-7 días. Actualizar el medio cada dos días, y manejar las placas de cultivo mínimamente durante los cambios de medio. Los fibroblastos superan desde el borde de las secciones de tejido en las próximas semanas.
      NOTA: Después de ~ 2-3 semanas, los fibroblastos outgrowing casi alcanzan la confluencia, dependiendo de la cantidad de área de superficie.
    3. Lavar las células con PBS 1x, y añadir 1 ml de tripsina I de la placa.
    4. Después de tripsinización, separar las células usando 9 ml de DMEM suplementado con 10% FBS. Recoger las células suspendidas en el medio en un tubo de 10 ml, junto con las secciones de tejido. Después de la centrifugación para formar sedimentos celulares, resuspender los sedimentos resultantes en el nuevo medio.
    5. Sembrar las células y las secciones de tejido en un nuevo callejónplato tura, momento en el que los tejidos fallan para insertarse en el plato, mientras que las células se adhieran y crezcan. Al día siguiente, retire los trozos de tejido que flotan por aspiración, y cambiar el medio. Fibroblastos adjuntos se propagan con culturas posteriores.

2. tridimensional Co-cultivo de fibroblastos humanos de pulmón y células cancerosas

  1. Preparación de las células y reactivos:
    1. Utilizar Aproximadamente 2 x 10 5 células epiteliales y 2,5 x 10 5 fibroblastos por pocillo. Preparar el colágeno de tipo IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), tampón de reconstitución (NaOH 50 mM, 260 mM NaHCO 3, mM HEPES 200), 5x DMEM, DMEM suplementado con 10% FBS para cultivo de fibroblastos, y un medio de co-cultivo 3D (una mezcla 1: 1 de medio de cultivo de fibroblastos y medio de cultivo para las células cancerosas).
    2. A549 Cultura células de adenocarcinoma de pulmón, los fibroblastos y el co-cultivo 3D A549 en DMEM suplementado con 10% FBS.
  2. El colágeno gel formación:
    1. Lave fibroblastos cultivados en placa de 10 cm con 1x PBS, y añadir 1 ml de tripsina I de la placa. Después de tripsinización durante ~ 5 min a 37 ° C, separar las células usando 9 ml de DMEM suplementado con 10% FBS. Recoger las células suspendidas en el medio en un tubo de 10 ml y centrifugar ellos a 200-300 xg para formar sedimentos celulares.
    2. Resuspender los sedimentos resultantes en 100% de FBS a una densidad de 5 x 10 5 / ml.
    3. Preparar el gel de colágeno en el hielo. Enfriar los reactivos, pipetas y tubos en un refrigerador antes de la siguiente procedimiento. Incluso en el hielo, la mezcla solidifica en cierto grado, y el volumen total es menor que la suma de todos los componentes.
    4. En cada pocillo, preparar el gel de colágeno mediante la mezcla de 0,5 ml de la suspensión de fibroblastos (2,5 x 10 5 células) en FBS, 2,3 ml de colágeno de tipo IA, 670 l 5x DMEM, y 330 l tampón de reconstitución. Permitir que los geles para ajustar fácilmente a temperatura ambiente.
      1. Vigorosamente pipeta para asegurarse a mi homogéneaxture. Evitar la creación de burbujas durante el proceso de pipeteado.
    5. Añadir la mezcla (3 ml) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos y se deja gelatinizar en la incubadora a 37 ° C sin perturbaciones durante 30-60 min.
  3. Cultivo de células de cáncer en el gel de colágeno:
    1. Realizar co-cultivo tridimensional usando un protocolo informó anteriormente con modificaciones 6.
    2. Resuspender las células cancerosas en el medio de co-cultivo 3D (o en DMEM con 10% FBS en el caso de las células A549) a una densidad de 1 x 10 5 / ml.
    3. Verter 2 ml de la solución de células resuspendido (2 x 10 5 células) sobre la superficie de cada gel. Modificar el número de células de las células cancerosas o fibroblastos en co-cultivo dependiendo de las condiciones experimentales.
  4. Gel contracción:
    1. Incubar geles durante la noche a 37 ° C de modo que las células cancerosas pueden adherirse a la gel de colágeno. Separe cada gel, y generar una "cultura flotante" en cada pozo of la placa de 6 pocillos.
      NOTA: Mediante el uso de una cultura flotante, diversos cambios en el tamaño de gel son inducidas por la tensión mecánica y la degradación de colágeno, que están mediadas por la interacción celular entre co-cultivaron células cancerosas y fibroblastos.
    2. Utilice un ángulo 21 G aguja o pequeña espátula para separar cada gel desde el borde del pozo. Cada 2-3 días, refrescan los pocillos con 2 ml de medio de cultivo conjunto 3D. Medir el tamaño de cada gel cada día durante 5 días.
  5. Análisis de geles de colágeno:
    1. Mida el contenido de colágeno de cada gel utilizando métodos de cuantificación de colágeno, tales como el ensayo Sircol. Realizar análisis transcriptómica o RT-PCR cuantitativa después de recoger el ARN de los geles 5.

3. Aire líquido Interfaz cultura y la invasión de ensayo

  1. Después de cultivar los geles de colágeno a 37 ° C durante 5 días, exponga los geles contratados a la atmósfera que los coloca en una malla (70 micras de tamaño de poro) en el nuevo 6-placas de pocillos. Hacer la malla de los tamices de células disponibles comercialmente utilizados para citometría de flujo.
  2. Llenar suavemente cada pocillo con 11 ml de medio de co-cultivo 3D.
  3. Coloque los geles sobre la malla con una cuchara estéril y retire cualquier medio restante de los geles. En esta condición, se sumergen geles en el medio mientras exponer la superficie superior del gel al aire. Definir esta condición cultura como interfase aire-líquido.
    NOTA: Después de 5-7 días de mantenimiento de la cultura interfase aire-líquido a 37 ° C en la incubadora, las células cancerosas invasivas migrar en el gel. Dependiendo del tipo de célula y como resultado de interacciones celulares, grados variables de cambio morfológico celular en las células cancerosas son inducidas por la cultura interfase aire-líquido.
  4. Para la evaluación histológica, fijar el gel en solución de formalina durante la noche a temperatura ambiente y embeber en parafina. Teñir secciones verticales (4 m) con hematoxilina y eosina (H & E). Realizar análisis inmunohistoquímico on las secciones 4.

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Resultados

Este método de co-cultivo, imitando el microambiente tumoral, es una herramienta útil para investigar las interacciones entre las células cancerosas y los fibroblastos embebidos en geles de colágeno. En el estudio anterior, tres parámetros fueron evaluados en este modelo experimental: la contracción de gel de colágeno, la invasión de células de cáncer y el cambio morfológico. Proliferación de las células del cáncer se estimó utilizando también Ki67 inmunoticción 4. Muestras de tejido pulmonar se recogieron a ...

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Discusión

CAF forman un componente importante de la ECM que rodea las células del cáncer y no sólo proporcionan un andamio para el tumor, pero también participan activamente en el desarrollo del tumor 7. La acumulación de pruebas revela el impacto de la CAF o sus moléculas relacionadas en el eventual pronóstico, destacando el papel fundamental de la progresión tumoral mediada por CAF 8.

En el estudio anterior, hemos empleado el método consecuencia de aislar CAF pulmón 4.

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 y 25460137).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMSigma-AldrichD5796
FBSGIBCO10437
Colágeno tipo IANitta gelatina Inc.Tampón de reconstitución CELL-1A
Nitta gelatin Inc.
CubreobjetosNUNC174934
Grasa de siliconaDow Corning TorayGrasa
Dispasa IWAKO386-02271
Placa de 6 pocillosBD Falcon353046
Colador de células (70 μ m)BD Halcón352350
de alto vacío

Referencias

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