Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

Resumen

La secuenciación de amplicones de bisulfito (BSAS) es un método para cuantificar la metilación de citosina en regiones genómicas específicas de interés. Este método utiliza la conversión de bisulfito emparejada con la amplificación por PCR de las regiones objetivo antes de la secuenciación de próxima generación para producir una cuantificación absoluta de la metilación del ADN a un nivel específico de base.

Resumen

El papel de los procesos epigenéticos en el control de la expresión génica se conoce desde hace varios años. La metilación del ADN en los residuos de citosina es de particular interés para los estudios epigenéticos, ya que se ha demostrado que es un regulador dinámico y duradero de la expresión génica. Los esfuerzos para examinar los cambios epigenéticos en la salud y la enfermedad se han visto obstaculizados por la falta de métodos cuantitativamente precisos y de alto rendimiento. Con el advenimiento y la popularización de las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), estas herramientas ahora se aplican a la epigenómica, además de las metodologías genómicas y transcriptómicas existentes. Para las investigaciones epigenéticas de la metilación de la citosina en las que se han identificado regiones de interés, como promotores de genes específicos o islas CpG, y existe la necesidad de examinar un número significativo de muestras con alta precisión cuantitativa, hemos desarrollado un método llamado secuenciación de amplicones de bisulfito (BSAS). Este método combina la conversión de bisulfito con la amplificación dirigida de regiones de interés, la construcción de bibliotecas mediada por transposomas y la NGS de sobremesa. BSAS ofrece un método rápido y eficiente para el análisis de hasta 10 kb de regiones objetivo en hasta 96 muestras a la vez que puede ser realizado por la mayoría de los grupos de investigación con conocimientos básicos de biología molecular. Los resultados proporcionan una cuantificación absoluta de la metilación de la citosina con especificidad de bases. El BSAS se puede aplicar a cualquier región genómica de cualquier fuente de ADN. Este método es útil para estudios de prueba de hipótesis de regiones objetivo de interés, así como para la confirmación de regiones identificadas en análisis de metilación de todo el genoma, como la secuenciación de bisulfito de genoma completo, secuenciación de bisulfito de representación reducida y secuenciación de inmunoprecipitación de ADN metilado.

Introducción

Ha pasado más de medio siglo desde el primer informe de origen natural modificaciones del ADN en forma de citosina metilación ^1. Metilación de citosina es una base de nucleótido citosina modificada donde el ^5º de carbono en el anillo de base tiene un grupo metilo (5-mC), que se producen con más frecuencia en el motivo dinucleótido CpG en genomas de mamíferos. La presencia funcional de 5-mC en los promotores de genes se asocia generalmente con la represión transcripcional, mientras que la ausencia se asocia con la actividad transcripcional ^2.

Grandes avances se han hecho en nuestra comprensión del papel de la metilación del ADN en desarrollo ^3, propagación TransGeneration de perfiles epigenéticos ^4, la patogénesis del cáncer de ^5,6, y una serie de otras áreas de investigación. Muchos de estos avances han llegado en los últimos años a medida que se han desarrollado nuevas metodologías para perfilar la metilación del ADN ^7. Con el advenimiento ypopularización de secuenciación (NGS) técnicas de última generación en la actualidad hay una serie de métodos para perfilar la metilación del ADN a través de todo un genoma o grandes regiones de un genoma ^8. Estos enfoques abren la posibilidad de realizar estudios de descubrimiento que cuantifican los patrones y las diferencias en la metilación del ADN de metilación del ADN. Además de estos métodos de generación de hipótesis, hay una necesidad significativa de ADN pruebas de métodos de cuantificación de metilación específica / hipótesis.

Pirosecuenciación, PCR específica de metilación y la secuenciación directa de ADN Sanger convertida bisulfito han sido los métodos más utilizados para el análisis de regiones específicas (es decir, una región promotora de un gen o de una isla CpG) ^9-12. Todos estos métodos se basan en la conversión de bisulfito, una reacción química donde la desaminación de la citosina no metilada se convierten en uracilo de, mientras que la citosina metilados permanecen intactos ^13,14. Amplificación por PCR de bisulfite-Los resultados de ADN convertidos en sustitución de de uracilo con timina ¹⁵ que permiten la metilación diferencial a leer como una diferencia de base. Aunque muy útil, las limitaciones a estos métodos incluyen baja precisión cuantitativa, la longitud de lectura corta, y bajo rendimiento de la muestra. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado un método que hemos llamado bisulfito Amplicon Secuenciación (BSAS) ^16. El objetivo de este método es ser capaz de analizar diana regiones genómicas de interés en un gran número de muestras con alta precisión cuantitativa.

BSAS utiliza elementos de los métodos existentes (la conversión de bisulfito y la amplificación por PCR específica de la región) y los combina con una construcción simple de próxima generación biblioteca (transposome mediada) ¹⁷ y de sobremesa NGS ¹⁸ (Figura 1). Este enfoque proporciona un método rendimiento más cuantitativa y superior para examinar la metilación de citosina en cualquier región de interés. Aquí presentamos elmétodo en detalle y describir enfoques para la resolución de problemas y la calidad de comprobar el proceso BSAS.

Protocolo

1. Aislamiento de ácidos nucleicos a partir de tejido

NOTA: Co-aislamiento de ADN y ARN a partir de la misma muestra de tejido ofrece la oportunidad de recoger para el análisis de ADN y ARN epigenética emparejado para el análisis de la expresión génica. El ejemplo dado aquí es una forma de purificación en columna a partir de tejido experimental, pero enfoques alternativos para diferentes tipos de muestras u otros métodos de aislamiento puede ser empleado. El requisito principal es que el ácido nucleico altamente purificada sin contaminar proteína o disolventes orgánicos.

1. Seleccione un pedazo de tejido fresco congelado o fresco para la homogeneización mecánica y colocar en hielo. Tienda o tejido transferencia a un tubo de microcentrífuga de fondo redondo de 2,0 ml.
2. Añadir un 5 mm grano de acero inoxidable a cada tubo que contiene el tejido. Añadir una cantidad apropiada de tampón de lisis, sobre la base de las sugerencias del fabricante del número de células o peso del tejido.
3. Homogeneizar el tejido usando una homogeneización mecánica en molino de perlas30 Hz durante 30 s.
   NOTA: La frecuencia y la duración de la homogeneización mecánica depende del tipo de tejido. Los tejidos más blandos se homogeneizar por completo con los ajustes recomendados, mientras que los tejidos más resistentes requieren ajuste de optimización.
4. Llevar a cabo el aislamiento de ADN y ARN usando columnas de centrifugación de sílice a temperatura ambiente siguiendo el protocolo del fabricante.
   1. Elute ARN en 50 l de agua libre de RNasa y lugar en el hielo. Utilice ARN para el análisis de la expresión de ARNm por qPCR.
   2. Eluir el ADN en 100 l de tampón TE. Repita elución de la columna de ADN utilizando el eluyente para aumentar la concentración de ADN y el rendimiento. Utilice ADN para la cuantificación específica de metilación.
5. Evaluar la calidad de ADN y ARN usando un espectrofotómetro estándar para la absorbancia a 230 nm, 260 nm, 280 nm, y 320 nm.
   NOTA: Relación / A280 A260 debe ser ~ 1.8-2 para el ADN de alta calidad. Relación / A280 A260 debe ser ~ 2 de ARN de alta calidad. La presencia de un exceso de absorbancia a 230 nm Indiccontaminantes ates del procedimiento de aislamiento.
6. Compruebe la calidad del ARN más usando un chip de electroforesis capilar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: ARN de alta calidad tendrá un número de la integridad del ARN (RIN)> 8. La presencia de picos adicionales en el electroferograma además picos rRNA indican contaminación de la muestra.
7. Cuantificar ADN y ARN mediante ensayo fluorescente de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   NOTA: El uso de un ensayo fluorométrico es más sensible y específico para la cuantificación de ácidos nucleicos que espectrofotometría solo.
8. Aislado tienda ADN y ARN a -80 ° C.

2. Objetivo Identificación y Primer Diseño

1. Determinar la región genómica (s) de interés para ser analizada por BSAS basado en la secuencia del genoma de referencia adecuado. Promotores de genes de genes expresados ​​diferencialmente son objetivos comunes de cuantificación de metilación.
2. Preparar un in silico bisulfito-convertgenoma de referencia ed para la alineación después de la secuenciación lee mediante la alteración de la secuencia de archivo .fasta en un editor de texto. En la orientación 5'-3 ', reemplace CpG no citosina con la de timina (Figura 2).
3. Imprimación Diseño establece para amplificar las regiones de interés a partir del ADN convertido bisulfito.
   1. Seleccione y copie la región no convertidos de interés, en la orientación 5'-3 ', en un programa de diseño de imprimación-bisulfito de PCR específico (Figura 3).
      NOTA: una longitud óptima amplicón bisulfito-PCR es de 250-400 pb por amplificación como fragmentos tratamiento con bisulfito de ADN y es difícil para amplificar grandes> 400 bp regiones. Si, por ejemplo, una región de 1 kb es de interés, múltiples pares de cebadores pueden ser diseñados para cubrir esta región. Amplicones Diseño sean de igual tamaño pb para facilitar la puesta en común. Evite amplificación longitudes <250 pb ya que estos pueden ser de longitud suficiente para la generación de biblioteca. Una longitud del cebador óptima para BSAS es>20 pb por imprimación.
   2. Seleccione un rango _Tm de 55-65 ° C y una diferencia _m max T entre avance y cebadores de 1-2 ° C revertir.
   3. Seleccionar pares de cebadores que mejor cubren la región de interés. No seleccione cebadores que contienen sitios CpG o son directamente adyacentes a los sitios CpG, ya que esto hará que el sesgo en las reacciones de PCR. Utilice cebadores de PCR estándar que se pueden pedir desde cualquier número de proveedores académicas o comerciales.
   4. Reconstituir iniciadores liofilizados en RNasa / DNasa agua libre a una madre de trabajo de 100 M.
4. Tienda PCR primers a -20 ° C. Diluir 100 mM de PRIMER 10 mM acción de trabajo para las reacciones de PCR.

3. Optimización de la PCR específica de bisulfito

NOTA: Para la conversión de bisulfito de ADN genómico, una serie de diferentes kits comerciales para la conversión de bisulfito están disponibles. Seleccione el kit o protocolo que mejor se adapte al experimento planificado.

1. Usar entre 200 ng a 2 g de ADN genómico. Para los experimentos de optimización, ejecutar múltiples reacciones de conversión con el fin de tener suficiente bisulfito de ADN convertido para múltiples reacciones de PCR BS.
2. Use pequeños volúmenes de elución (por ejemplo, 10 l) de ADN convertido con bisulfito para mantener altas concentraciones de ADN.
   NOTA: 2/1 l de ADN convertido bisulfito es suficiente para la optimización de las reacciones de PCR si se utilizó 1 g de ADN genómico para la entrada de conversión.
3. Amplificar el ADN convertido por el bisulfito bisulfito de PCR específico. Reacciones BS-PCR requieren el uso de un Taq polimerasa capaz de amplificar ADN convertido bisulfito.
   1. Reúna la siguiente reacción para la optimización de amplificación de la diana de un solo amplicón. Para múltiples muestras, ensamblar reacciones en una placa de PCR de 96 pocillos.
      25 l de tampón de reacción 2x
      0,5 l dNTP Mix
      5 l 10 mM Cebador (Final 1 M)
      5 l 10 mM cebador inverso(Final 1 M)
      2 l de bisulfito de plantilla de ADN convierte
      0,4 l (5 U / l) ADN polimerasa
      12,1 l de agua libre de DNasa (volumen de reacción final 50 l)
   2. Sellar la placa de PCR con el adhesivo apropiado o película termosellada.
   3. Coloque reacción en un termociclador adecuado y utilizar las siguientes condiciones en bicicleta con una tapa térmica:
      1. Realice una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min.
      2. Desnaturalizar a 95 ° C durante 30 segundos.
      3. Recocido durante 30 segundos a la T _m específico de cebadores que se utiliza. Comience en una temperatura de recocido a unos pocos ° C por debajo de la _Tm del cebador para las reacciones de optimización.
         NOTA: Los mejores temperaturas de recocido también se pueden determinar utilizando un termociclador de gradiente para probar una gama de temperaturas.
      4. Realice una extensión a 72 ° C durante 30 segundos. Alargar el tiempo de extensión de los amplificados más largos.
      5. Repita los pasos 3.3.3.2-3.3.3.4 para 35 ciclos aTal para la optimización inicial. Números de ciclo más altas pueden ser necesarias, pero deben evitarse en general para evitar amplificaciones clonales que va a crear artefactos de reacción.
      6. Realice una extensión final a 72 ° C durante 7 minutos.
      7. Mantenga reacciones a 4 ° C.
   4. Visualice amplicones por electroforesis PÁGINA. Alternativamente, utilizar un chip de ADN electroforesis capilar de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      1. Mezclar 24 l de la reacción de PCR con 6 l de 5x colorante de carga en el hielo y agitar.
      2. Hacer 1 L de TBE 1x tampón mediante la mezcla de 200 ml de 5x tampón de TBE y 800 ml de ddH ₂ O. Diluir escalera de ADN para una concentración final de 0,5 mg por pocillo en ddH ₂ O y colorante de carga.
      3. Pozos de carga con 30 l de reacciones de PCR o escalera.
      4. Correr el gel a 200 V para ~ 45 min. Detener la ejecución de gel cuando el primer frente de colorante alcanza el final del gel.
      5. Manchar el gel con 5 mg / mlbromuro de etidio mediante la mezcla de 5 l de 10 mg / ml en 100 ml de ddH ₂ O. Cubrir todo el gel y dejar incubar durante ~ 5 min.
      6. Imagen del gel a través de una caja de luz UV o de imágenes multimodal en una longitud de onda de excitación de 482 nm.
      7. En referencia a la escala, el tamaño de los amplicones de PCR y determinar la especificidad de la reacción mediante la búsqueda de múltiples bandas otros que el tamaño de amplificación esperado (Figura 4A y C).
   5. Una vez que las condiciones óptimas para BS-PCR se han determinado, realizar BS-PCR en muestras experimentales.
      1. Purifica los amplificados desde restantes cebadores y otros componentes de la reacción. Realizar purificación de sílice columna, Perla SPRI, o base de gel de limpieza y cuantificación.
      2. Amplicones eluir en tampón TE 30 l.
      3. Cuantificar los amplificados mediante ensayo fluorométrico utilizando los protocolos del fabricante.
      4. Si hay varios amplicones por muestra, ellos aunar a igualdad de peso por volumenmontos y almacenar a -20 ° C.

4. NGS Biblioteca Preparación y Biblioteca QC

NOTA: preparación biblioteca BSAS NGS utiliza un protocolo transposome mediada simplificada con doble indexación (Ver Lista de materiales para obtener información sobre la selección de la biblioteca kit de preparación). Este método proporciona una ruta extremadamente rápido y alto rendimiento para la construcción de la biblioteca que ha sido validado y muestra poco o ningún sesgo en las aplicaciones de secuenciación de bisulfito ^16,19. Dual-indexación permite una mayor multiplexación de muestras que solo indexación. Otros estilos de preparación de la biblioteca puede ser posible, pero no han sido probados.

1. Preparar bibliotecas NGS de amplicones de PCR BS en una placa de PCR de 96 pocillos. Diluir amplicones a 0,2 ng / l para una masa de entrada final de 1 ng, o 5 l de la 0,2 ng / l de dilución. Realizar una limpieza de las bibliotecas generadas usando perlas de SPRI. Utilice 50-90 perlas SPRI mu l para el aislamiento de las bibliotecas wITH este protocolo. El volumen de los granos de SPRI depende del tamaño del objetivo de la biblioteca y el número de ciclos de la secuencia de reacciones deseadas.
   NOTA: Utilice un agitador de microplacas o placa de vórtice para resuspender las microesferas.
   1. Eluir las bibliotecas de las cuentas y transferir a una nueva placa de 96 pocillos y sellar con una película de termosellado para el almacenamiento a -20 ° C.
2. Determinar el tamaño y la concentración de las bibliotecas (Figura 4B y D).
   1. Bibliotecas se ejecutan en un ADN electroforesis capilar calibrado chip de acuerdo con los protocolos del fabricante.
      1. Utilice un ensayo de ADN electroforesis capilar de alta sensibilidad para determinar el tamaño medio de los picos de la biblioteca detectados y una estimación de molaridad de acuerdo con los protocolos del fabricante.
   2. Cuantificar bibliotecas por qPCR, usando cebadores diseñados contra las secuencias adaptadoras generados en las bibliotecas y las normas de uso con una concentración conocida.
      1. Ejecutar qPCR reacciones en un instrumento de tiempo real utilizando los ajustes de cuantificación absoluta de acuerdo con los protocolos del fabricante.
      2. Utilice el tamaño de las bibliotecas y la cuantificación molar de qPCR para calcular las concentraciones molares de las bibliotecas.
3. Diluir bibliotecas a 4 nM usando 10 mM Tris-Cl con 0,1% de Tween-20 a pH 8,5. Bibliotecas de las tiendas en una placa de 96 pocillos PCR sellado con film de termosellado a -20 ° C.

5. Las bibliotecas de secuenciación utilizando un secuenciador de sobremesa

1. Descongelar y preparar reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Descongele 4 bibliotecas nm en hielo.
3. Hacer 1 ml de NaOH 0,2 N en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Piscina 4 bibliotecas nm en cantidades iguales de volumen, si varias bibliotecas se van a utilizar.
5. Diluir y desnaturalizar las bibliotecas agrupadas de acuerdo a las instrucciones del fabricante a la concentración molar final deseado.
   1. Mantenga diluido y desnaturalizarbiblioteca agrupado en hielo hasta que esté listo para cargar el cartucho de reactivos.
6. Generar una hoja de muestra que contiene nombres de las muestras y la correspondiente información de índice y especificar para generar .fastq archivos solamente.
   1. Cargar muestra de hoja en la carpeta muestra de hoja correspondiente en el secuenciador.
7. Añadir un total de 600 l diluidos y biblioteca desnaturalizado para el cartucho de reactivo en el pocillo correspondiente.
8. Ejecute la secuencia de reacciones a su finalización.

Análisis 6. La metilación cuantificación de datos

NOTA: Hay varios programas disponibles para el análisis de datos NGS incluyendo tanto comerciales como de código abierto. Los detalles sobre los programas en ejecución se pueden encontrar en cada paquete específico. Instrucciones generales se dan en cada paso junto con los comandos específicos de este paquete de software. (Ver Lista de materiales para obtener información sobre el software utilizados en este protocolo).

1. Importar archivos .fastq.gz en sí apropiadaQuencing análisis de tuberías que conserva sus niveles de calidad (Qscores) para su uso en lectura recorte. (Para este programa de ejemplo, seleccione "Importar" y seleccionar el método de secuenciación utilizado para generar lecturas. Seleccionar .fastq.gz leer archivos para importar y conservar Qscores de archivos .fastq para lectura recorte aplicaciones desmarcando «desprenderse puntuaciones de calidad 'en' general Opciones '. Seleccione una ubicación para la importación de lecturas y seleccione' Terminar '.)
   1. Recorte y retener lecturas usando los siguientes ajustes en una tubería de análisis de datos NGS. (Para este programa seleccione "Recorte Secuencias 'bajo' NGS Core Herramientas 'y seleccione las lecturas que ser recortado.)
      1. Conservar sólo lee que contiene partituras ≥ Q30. (Para este programa seleccione "Recorte utilizando puntuaciones de calidad 'y establecer el límite a 0.001.)
      2. Conservar sólo lee con ≤ 1 nucleótido ambigua. (Para este programa seleccione 'nucleótidos ambiguos ajuste' y establecer el'Número máximo de ambigüedades' a 1. Seleccione una ubicación para guardar recortado lee y seleccione 'Terminar'.)
   2. Mapa recortado lee a la in silico bisulfito convertido referencia gen de 2,2. (Para el software de ejemplo seleccione 'Mapa lee a Referencia' bajo 'NGS Core Herramientas'. Seleccione recortado lee para ser mapeada y seleccione "siguiente". Seleccione la secuencia de referencia convertida y seleccione 'no enmascaramiento "en" enmascaramiento de referencia'. Seleccione ' siguiente '.)
      1. Asignar una pena máxima para los desajustes, inserciones y eliminaciones. Establecer parámetros de tal manera que el 100% de la longitud de lectura es necesaria para mapear con un 90% de identidad de secuencia. Por ejemplo software, asignar una puntuación de 3 para los desajustes, inserciones y eliminaciones. Asignar una puntuación de 1 para la fracción mínima de la longitud de lectura asignada a la referencia, y asignar una puntuación de 0,9 para la fracción mínima de identidad entre hicieron mapas de leer y de referencia.
      3. Para la salida de la alineación generar cada muestra como un archivo independiente. Por ejemplo software, seleccione 'Crear independiente leer asignaciones "en" Opciones de salida "y" Guardar "en" la manipulación de resultados'. Seleccione una ubicación para guardar la asignación de lectura y seleccione 'Terminar'.
   3. Ejecutar un flujo de trabajo variante pidiendo a lee el mapeado. Para el software de ejemplo, seleccione 'Probabilístico Detección Variant' bajo 'Resequencing Análisis', seleccione la asignación de lectura para ser analizados y seleccione "siguiente". Seleccione 'Ignorar partidos no específicos' en 'Leer filtros "y seleccione" Siguiente ".
      1. Asegúrese de que la secuencia está en un depº de ≥ 1.000 X estableciendo la 'cobertura mínima "en" Importancia "para 1000.
      2. Asegúrese de que la llamada variante está presente tanto en avance y retroceso lee. Por ejemplo software, seleccione "Requerir la presencia tanto de avance como gradas invertir" en "filtros Variant 'y seleccione' Siguiente '.
      3. Exportación alineados, variante llamada de datos como un índice anotado. Por ejemplo software, seleccione 'Crear índice anotado "en" Opciones de salida "y seleccione una ubicación para guardar el archivo de tabla de variantes. Seleccione "Finalizar".
2. Calcular 5-mC porcentaje utilizando las frecuencias de las variantes en los sitios CpG anotados en la región de interés desde el archivo de la tabla de variantes. La frecuencia de la citosina en una referencia C en CG es el porcentaje de 5-mC.
   NOTA: Cuando se utiliza la variante llamando algoritmos para la altamente metilados de CpG, reemplace citosinas CpG con timinas. Esto identify el mapeado de citosina como variantes, lo que resulta en la frecuencia de la citosina en CpG.
3. Determinar la eficiencia de conversión de bisulfito (BSC) por primera calculando el porcentaje de C no está en los sitios CpG en la referencia (C). Multiplique el porcentaje de no CpG C de por número de mapeado (T _mp) total del T, y se dividen por el total de C de mapeado en la referencia de T (C _MPT). 100 menos la frecuencia calculada es la eficiencia de conversión de bisulfito (BSC) de dicha biblioteca (Ecuación 1).



Ecuación 1. eficiencia de conversión de bisulfito.
NOTA: Mientras que los genomas de mamíferos contienen cantidades muy bajas de no CpG metilación de citosina (con la excepción de las células madre potencialmente ^20), los genomas vegetales contienen una cantidad significativa. Con el fin de determinar la eficiencia de la conversión de bisulfito en estos reference genomas, una ruta adecuada es secuenciar una porción del genoma mitocondrial o genoma del cloroplasto o genes metilados conocidos presentes en genomas de plantas ²¹ y el cálculo de la eficiencia de conversión como se describe anteriormente. La eficiencia de conversión de bisulfito debe ser ≥98% en la mayoría de los casos, con de los no convertidos C que puedan derivarse de la falta de metilación CpG.

Resultados

BSAS lee correctamente alineado con la secuencia de referencia convertida se parecerá a la Figura 5. Dinucleótidos CpG pueden ser claramente identificados y estados de metilación pueden estimarse mediante la observación de base de las llamadas en los sitios CpG en lee el mapeado. Por ejemplo, con controles de metilación, 0% de metilación se traducirá en todo el lecturas asignan a sitios que contienen CpG de T (Figura 5A). 100% de los controles de metilación se traducirá en todo el mapeado lee lee a los sitios que contienen CpG de C (Figura 5B).

La cuantificación de la frecuencia de la citosina (C T / C +) en los sitios CpG se obtiene la frecuencia de metilación en la muestra original. Una curva estándar generada representante de los controles de metilación de todo el genoma (n = 3 de relación / metilación) muestra la linealidad de la cuantificación de metilación, así como precisión en la cuantificación en cada relación de metilación (Figura 6). Como un ejemplo de este método en total, ARN y ADN fueron co-iso lada de cerebelo de ratón y la retina (n = 4 / grupo). Expresión rodopsina, expresado selectivamente en tejido de la retina, se midió utilizando qPCR. Expresión sólo se detectó en la retina (Figura 7A). Usando BSAS, los niveles de metilación de CpG se cuantificaron en la región promotora de la rodopsina. Los niveles de metilación acumulados a través de la región del promotor fueron> 80% en el cerebelo en comparación con <15% en la retina (p <0,001, t-test paramétrico) (Figura 7B). BsAs beneficios de cuantificación de metilación metilación cuantificación específica de sitio, y los niveles de metilación se pueden comparar de forma específica de CpG a través de cualquier región genómica dado. Niveles de metilación CpG en todo el promotor rodopsina fueron significativamente mayores en las muestras del cerebelo cuando se compara con muestras de retina (p <0,001, paramétrica t-test en cada sitio CpG) (Figura 7C).

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Figura 1:. Esquemática del método de BSAS En este método, el ADN genómico es bisulfito convertida para modificar las citosinas no metilación a uracilos. Posteriormente, durante la PCR estos uracilos se cambian a timinas. La amplificación por PCR se dirige contra las regiones de interés y altamente enriquece por sólo estas secuencias. Los amplicones de PCR resultantes se convierten en bibliotecas de doble indexado a través de un proceso de tagmentation simple. Posteriormente, las bibliotecas están secuenciados en un secuenciador de última generación de sobremesa y la secuenciación lee se asignan a la secuencia de referencia in silico convertido y ciento metilación de la citosina de se determina de forma-base específica.

Figura 2:. En silico conversión de bisulfito de región de interés Cualquier región de interés de toda referencia genómica puede ser selected para in silico bisulfito de conversión. Citosinas no CpG se sustituyen con la timina de la secuencia de referencia. Citosinas CpG permanecen citosinas en el bisulfito convierten referencia.

Figura 3:. Cebadores colocación Primer bisulfito de PCR se diseñan contra un bisulfito en silico secuencia de referencia convertidos. Los cebadores deben ser diseñados de manera que no se superpongan dinucleótidos CG, o diseñado junto a dinucleótidos CG.

Figura 4: Ejemplos de amplicones altas y pobres de PCR calidad y bibliotecas de secuenciación rastros electropherogram representativos y gel espectáculo (A) amplicón ideal para la generación de bibliotecas transposome mediada con un solo alto.producto de concentración. (B) Biblioteca generada a partir de este amplicón muestra una alta concentración y una distribución uniforme de tamaño. (C) Mala amplicones de PCR de calidad puede ser baja en tamaño, concentración y contiene múltiples productos y / o dímeros de cebadores. Estos amplicones de mala calidad dará lugar a (D) no generación biblioteca con baja concentración y distribución de baja capacidad.

Figura 5: Ejemplos de salidas de secuenciación de los controles de metilación. (A) En silico convierte secuenciación de referencia con sitios CpG resaltado en rojo. 0% de control de la metilación del mapeado lee a los timinas seleccionados región mostrando (iluminaciones codicia) de mapeo en sitios CpG. De control (B) 100% metilación asignada lee mostrar (punto culminante azul) mapeo de citosina en los sitios CpG.

Figura 6:. Cuantificación de metilación a través de una gama de controles de metilación controles de metilación de todo el genoma mezclados en proporciones de metilación (n = 3 / ratio) de 0% a 100% se cuantificaron utilizando BSAS. Trazado de cuantificación de espera frente cuantificada demuestra la linealidad de la cuantificación de control de la metilación. En todos los controles, hubo una alta precisión en la cuantificación de metilación.

Figura 7: Ejemplo de la metilación del ADN y la expresión génica análisis pareado de muestras de tejido. (A) La rodopsina relativa expresión de mRNA de cerebelosa ratón y tejido de la retina. (B) La rodopsina promedio metilación promotor cuantificado por BSAS entre cerebelo y el ADN de la retina (*** p <0,001, paramétrica t-test). los niveles de metilación C) sitio-específica CpG través promotor rodopsina (-244 a 6, en relación al sitio de inicio de transcripción [SST]) en el cerebelo del ratón y ADN retina.

Discusión

BSAS permite centrado, precisa cuantificación de metilación del ADN con capacidades de alto rendimiento, tanto en número de muestras y número de objetivos. Además, esta generación biblioteca utilizando tagmentation transposome mediada requiere menos entrada de ADN, es más rápido y contiene menos pasos que esquila tradicional y técnicas de unión adaptador posteriores. Estas mejoras sobre los métodos existentes permiten precisa de nivel de base el análisis de metilación del ADN de cualquier diana de interés. Por otra parte, BSAS proporciona un nuevo método para la confirmación de las regiones de interés (regiones de metilación diferencialmente (DMR), islas CpG, regiones reguladoras) que han sido identificados utilizando todo el genoma de bisulfito ²² o capturar ²³ enfoques. Utilizando métodos de confirmación ortogonales y más cuantitativamente métodos precisos mejora el rigor analítico de estudios epigenómicos. La profundidad máxima de lectura alcanzado con BSAS permite la cuantificación precisa en un intervalo de confianza estrecho, reresultante en la cuantificación precisa ^16. Además, la capacidad de ejecutar muchas muestras en un solo experimento puede aumentar el tamaño de la muestra para la confirmación de los métodos de todo el genoma, lo que aumentará el poder estadístico; una debilidad de muchos estudios epigenéticos actuales. Es importante destacar que, BSAS proporciona una cuantificación de metilación CpG específicos de base, lo que permite la generación de hipótesis comprobables para la investigación epigenética. Hipótesis como el aumento de la metilación en un elemento de respuesta específica se traducirá en disminución de la unión de un factor de transcripción específico. BSAS, combinado con los datos de expresión de ARNm emparejados, proporciona un método para obtener tanto la regulación epigenética y la expresión del ARNm dentro de una sola pieza de tejido o población de células. Mediciones pareadas de regulación y expresión también aumentan el rigor científico y el impacto de los hallazgos.

Los pasos críticos dentro del protocolo BSAS incluyen primer diseño, optimización de amplificación, y la generación de biblioteca /QC. PCR sesgo se introduce si cebadores no están diseñados adecuadamente y amplifican en diferentes eficiencias ^8. El uso de estándares de metilación, como 100% y 0% de citosina metilados normas enzimáticamente generadas, se puede utilizar para determinar el grado, si alguno, de sesgo cuantificación de metilación, y es un control metodológico adecuado cuando la cuantificación de metilación ^16. Del mismo modo, se debe tener cuidado cuando la optimización de las reacciones de PCR para generar un único amplicón de alta calidad. Si no está presente amplicón utilizando las directrices sugeridas se detallan en el protocolo, pasos de optimización incluyen un número creciente de ciclo de PCR o la cantidad de entrada bsDNA. Si hay múltiples productos de PCR, incluyendo dímeros de cebadores, pasos de optimización incluyen la disminución de la cantidad de entrada bsDNA, la disminución de las concentraciones de entrada de cebadores PCR molares, aumento de las temperaturas de recocido, o disminuyendo el número de ciclos de PCR. Uno o una combinación de estos procedimientos de optimización da resultados suficientes para generar un único higamplicón h calidad. Alternativamente, el rediseño de cebadores es un buen enfoque para conjuntos de cebadores que no producen un solo amplicón. Para aquellas regiones donde rediseño no es adecuado o posible, degenerar conjuntos de primer incluyendo tanto pueden trabajar de citosina y timina de CpG en los sitios en los cebadores directos y adenina y guanina de de en los sitios CpG en cebadores inversos. Sin embargo, estos conjuntos de cebadores necesitan una mayor optimización para asegurar que no se está produciendo PCR sesgo, un proceso fuera del alcance de este protocolo. Bibliotecas de calidad son extremadamente importantes para el éxito. Asegúrese de que las medidas de control de calidad se llevan a cabo para determinar el tamaño, la calidad y cantidad de las bibliotecas antes de la secuenciación. Las reacciones de secuenciación son propensos a fallas con el aporte de las bibliotecas de baja calidad. Sesgo en la cuantificación de metilación puede ser mitigado por garantizar que las frecuencias de metilación están presentes tanto en avance y retroceso secuenciación lee. Además, las puntuaciones de calidad de las bases de la alineación de los sitios CpG deben ser ≥Q30 para alta confidence en la cuantificación. Mientras que otros han demostrado previamente poco o ningún sesgo en las reacciones tagmentation de ADN convertido bisulfito ^19, garantizando los parámetros descritos anteriormente permite la confirmación de la baja cuantificación metilación sesgo.

BSAS actualmente mide la metilación en sitios CpG, sin embargo, las futuras ampliaciones de este método permitirá que las mediciones pareadas de CpG 5-HMC con la adición de etapas experimentales distinguiendo entre 5-mC y 5-HMC como la introducción de perrutenato de potasio antes de la conversión de bisulfito ^24. Esto aumentará el impacto de utilidad BSAS permitiendo para la metilación emparejado, tanto los datos de expresión 5-mC y 5-HMC, y con el fin de determinar la expresión de genes funciones de regulación de la metilación del ADN. Preparación biblioteca mediada por transposome de amplicones de PCR da lugar a la disminución de la profundidad de secuenciación en los extremos de las regiones amplificadas. Por lo tanto, las regiones de alto interés deben ser diseñados para residir en el medio de amplicones. Cómonunca, porque BSAS genera secuenciación leer profundidades de> 1000 X, la precisión cuantitativa de 5-mC mediciones cerca de los extremos de las regiones amplificadas sigue siendo alta.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agilent 2100 Bioanlyzer	Agilent	G29393AA
Agilent RNA 6000 Nano kit	Agilent	5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Typhoon 9200	Amersham/GE Healthcare Life Sciences
Agencourt AMPure XP - PCR Purificación	Beckman Coulter	A63880	5 ml
Fuente de alimentación básica PowerPac	Bio Rad	164-5050
twin.tech placa PCR 96	Eppendorf	951020362	semifaldón
Película de termosellado	Eppendorf	0030127838
Lámina de termosellado	Eppendorf	0030127854
Termosellador	Eppendorf	5390000.024
0.1-10 μ l Puntas	Eppendorf	0030073.002
2-200 μ l Puntas	Eppendorf	0030073.045
50-1,000 μ l Consejos	Eppendorf	0030073.100
MixMate	Eppendorf	5353000.014
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Eppendorf	0030121.023
Centrífuga 5424	Eppendorf	5424000.010
Tubo de microcentrífuga de 2,0 ml	Eppendorf	022363352
Nextera XT Kit de preparación de muestras de ADN	Illumina	FC-131-1024	24 rxn
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	24 índices
MiSeq Desktop Sequencer	Illumina
MiSeq Kit de reactivos v2	Illumina	MS-102-2002	300 ciclos
KAPA SYBR FAST Kit de qPCR universal	KAPA Biosystems	KK4824
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit de ensayo	Life Technologies	P7589
Quant-iT RiboGreen Kit de ensayo de ARN	Life Technologies	R11490
Sistema de PCR ProFlex de 96 pocillos	Life Technologies	4484075
Novex 6% Gel de ADN TBE	Life Technologies	EC6261BOX	10 pocillos
Novex TBE Running Buffer	Technologies	LC6675	5x (1 L)
Novex Tampón de muestra TBE de alta densidad	Life Technologies	LC6678 5x	(10 ml)
1 Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies	10787-018
Xcell SureLock Mini-Cell Life	Technologies	EI0001
UltraPure 10 mg/ml Bromuro de etidio	Life Technologies	15585-011
7900HT Sistema de PCR rápida en tiempo real	Life Technologies	4329001	bloque de 384 pocillos
DynaMag-96 con faldón lateral	Life Technologies	12027
SpectroMax M2 Multimodo Lector de microplacas	Molecular Devices/VWR	89429-532
AllPrep Mini kit de ADN/ARN	Qiagen	80204
Perlas de acero inoxidable	Qiagen	69989	5 mm
CLC Genomics Workbench	Qiagen		Software para tubería de metilación
QIAQuick PCR Kit de purificación	Qiagen	28104	50 rxn
TissueLyser II	Retsch/Qiagen	85300
Agua sin nucleasas	Sigma	W4502
Clorhidrato TRIS	Sigma	PHG0002-100G
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Placa de faldón completo de 384 pocillos, estándar	Thermo Scientific	AB-1384
Sello absoluto qPCR	Thermo Scientific	AB-1170
EZ DNA Metilación-Kit de rayos	Zymo Research	D5030	50 rxn
ZymoTaq ADN polimerasa	Zymo Research	E2001	50 rxn