Una guía para la generación y uso de hiPSC NPCs derivados para el Estudio de las Enfermedades Neurológicas

Resumen

Este protocolo describe cómo se pueden diferenciar las células progenitoras neurales de las células madre pluripotentes inducidas humanas, con el fin de producir una población de células neuronales robusta y replicativa, que puede usarse para identificar las vías de desarrollo que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad en muchos trastornos neurológicos.

Resumen

Los estudios post-mortem de enfermedades neurológicas no son ideales para identificar las causas subyacentes del inicio de la enfermedad, ya que muchas enfermedades incluyen un largo período de progresión de la enfermedad antes de la aparición de los síntomas. Debido a que los fibroblastos de los pacientes y los controles sanos pueden reprogramarse de manera eficiente en células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), y posteriormente diferenciarse en células progenitoras neurales (NPC) y neuronas para el estudio de estas enfermedades, ahora es posible recapitular los eventos de desarrollo que ocurrieron antes de la aparición de los síntomas en los pacientes. Presentamos un método mediante el cual se pueden diferenciar de manera eficiente las hiPSC en NPC, que además de ser capaces de diferenciarse aún más en neuronas funcionales, también pueden ser fuertemente transitadas, congeladas-descongeladas o transicionadas para crecer como neuroesferas, lo que permite un rápido cribado genético para identificar los factores moleculares que afectan a los fenotipos celulares, incluyendo la replicación, la migración, el estrés oxidativo y/o la apoptosis. Las NPC hiPSC derivadas de pacientes son una plataforma única, ideal para las pruebas empíricas de las consecuencias celulares o moleculares de la manipulación de la expresión génica.

Introducción

Estudios de expresión génica de las neuronas diferenciadas in vitro a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) por nosotros ¹ y otros ^2,3 indican que las neuronas hiPSC asemejan fetal en lugar de adultos tejido cerebral. En la actualidad, los modelos basados ​​en hiPSC pueden ser más apropiados para el estudio de la predisposición a, en lugar de características tardía de la enfermedad neurológica. Hemos informado anteriormente de que una fracción significativa de la firma genética de las neuronas hiPSC derivado de la esquizofrenia se conserva en las células esquizofrenia hiPSC derivados neurales progenitoras (NPC....

Protocolo

1. hiPSC Diferenciación de células progenitoras neurales

1. Crecer y expandirse hiPSCs en células madre embrionarias humanas (HES) medios de comunicación (Tabla 1) co-cultivadas en un fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) capa alimentadora hasta grandes (pero subconfluentes) colonias están listos para la diferenciación neural a través de un cuerpo embrioide (EB) intermedia (Figura 2). Condiciones de rutina cultura hiPSC están bien descritas en otra parte ^16,17; Brevemente, hiPSCs crecer en medios de HES en una capa de alimentación MEF hasta la confluencia, el paso entonces enzimáticamente con colagenasa (1 mg / ....

Resultados

Rosetas neuronales pueden ser identificadas morfológicamente, utilizando un microscopio de campo claro, por su aspecto característico como racimos redondos de células neuroepiteliales con la polaridad-apico basal (Figura 1). Aunque NPCs son típicamente cultivaron a muy alta densidad celular, inmediatamente después de los pases, ligeramente soma de forma piramidal y la estructura de neuritas bipolar es visible (Figura 1D). NPCs validados expresan nestina y Sox2 en la mayoría de las célul.......

Discusión

Hemos descrito los métodos por los que pueda diferenciar hiPSCs en NPCs, un tipo de célula neuronal en la que se conserva una parte importante de la firma genética de neuronas derivadas de hiPSC y que pueden servir como un sustituto de las vías de desarrollo que posiblemente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad ^{8, 11.} Además, como hemos detallado, NPCs son una población neuronal robusta replicativa y fácilmente transducidas, que creemos que puede ser adecuado para los estudios moleculares y bioquímic.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12	Life Technologies	#11330	para medios HES
DMEM/F12	Life Technologies	#10565	para medios neuronales
KO-Serum Replacement	Life Technologies	#10828	Necesita ser probado por lotes
Glutamax	Life Technologies	#35050
NEAA	Life Technologies	#11140
N2	Life Technologies	#17502-048	Necesita ser probado por lotes
B27-RA	Life Technologies	#12587-010	Necesita ser probado por lotes
FGF2	Life Technologies	#13256-029	Resuspender en PBS + 1% BSA
	LDN193189 Stemgent	#04-0074
	SB431542 Stemgent	#04-0010
BDNF	Peprotech	#450-02	Resuspender en PBS + 0.1% BSA
GDNF	Peprotech	#450-10	Resuspender en PBS + 0.1% BSA
Dibutiril cíclico-AMP	Sigma	#D0627	Resuspender en PBS + 0.1% BSA
Ácido L-ascórbico	Sigma	#A0278	Resuspender en H20
STEMdiff Reactivo de selección de roseta neural	Stemcell Technologies	#05832
Accutase	Innovador Cell Technologies	AT-104
Colagenasa IV	Life Technologies	#17104019
CF1 mEFs	Millipore	#PMEF-CF
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
Laminina, Ratón Natural 1 mg	Life Technologies	#23017-015
BD Matrigel	BD	#354230	Vuelva a suspender en hielo en DMEM frío a 10 mg / ml, use 1 mg por dos placas equivalentes a 6 pocillos
Placas de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejidos	Corning	3506
Placa de 6 pocillos de fijación ultra baja	Corning	3471
cabra anti-Sox2	Santa Cruz	sc­ 17320	uso a 1:200
ratón anti-humano Nestin	Millipore	MAB5326	uso a 1:200
conejo anti-y beta; III-tubulina	Covance	PRB­ Uso de 435P	a 1:500
ratón anti-y beta; III-tubulina	Covance	MMS­ Uso 435P	a 1:500
ratón anti-MAP2AB	Sigma	M1406	uso a 1:200
Centrífuga de placas	Beckman Coulter	Beckman Coulter Allegra X-14 (con portador de placas SX4750)