Una guía para la generación y uso de hiPSC NPCs derivados para el Estudio de las Enfermedades Neurológicas

Resumen

Este protocolo describe cómo se pueden diferenciar las células progenitoras neurales de las células madre pluripotentes inducidas humanas, con el fin de producir una población de células neuronales robusta y replicativa, que puede usarse para identificar las vías de desarrollo que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad en muchos trastornos neurológicos.

Resumen

Los estudios post-mortem de enfermedades neurológicas no son ideales para identificar las causas subyacentes del inicio de la enfermedad, ya que muchas enfermedades incluyen un largo período de progresión de la enfermedad antes de la aparición de los síntomas. Debido a que los fibroblastos de los pacientes y los controles sanos pueden reprogramarse de manera eficiente en células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), y posteriormente diferenciarse en células progenitoras neurales (NPC) y neuronas para el estudio de estas enfermedades, ahora es posible recapitular los eventos de desarrollo que ocurrieron antes de la aparición de los síntomas en los pacientes. Presentamos un método mediante el cual se pueden diferenciar de manera eficiente las hiPSC en NPC, que además de ser capaces de diferenciarse aún más en neuronas funcionales, también pueden ser fuertemente transitadas, congeladas-descongeladas o transicionadas para crecer como neuroesferas, lo que permite un rápido cribado genético para identificar los factores moleculares que afectan a los fenotipos celulares, incluyendo la replicación, la migración, el estrés oxidativo y/o la apoptosis. Las NPC hiPSC derivadas de pacientes son una plataforma única, ideal para las pruebas empíricas de las consecuencias celulares o moleculares de la manipulación de la expresión génica.

Introducción

Estudios de expresión génica de las neuronas diferenciadas in vitro a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) por nosotros ¹ y otros ^2,3 indican que las neuronas hiPSC asemejan fetal en lugar de adultos tejido cerebral. En la actualidad, los modelos basados ​​en hiPSC pueden ser más apropiados para el estudio de la predisposición a, en lugar de características tardía de la enfermedad neurológica. Hemos informado anteriormente de que una fracción significativa de la firma genética de las neuronas hiPSC derivado de la esquizofrenia se conserva en las células esquizofrenia hiPSC derivados neurales progenitoras (NPC), indicando que NPC puede ser un tipo de célula útil para estudiar las vías moleculares que contribuyen a la esquizofrenia ¹ . Nosotros y otros han informado de la migración aberrante, aumento del estrés oxidativo y las especies reactivas de oxígeno, la sensibilidad a las tensiones ambientales sub-umbral y la función mitocondrial alterada en la esquizofrenia hiPSC NPC ^1,4-6, así como una disminución c neuronalonectividad y la función sináptica en las neuronas hiPSC esquizofrenia ^5,7-10. Si los factores moleculares que contribuyen a la migración aberrante y / o el estrés oxidativo en la esquizofrenia hiPSC NPCs también subyacen a la conectividad neuronal reducida en las neuronas hiPSC derivado de la esquizofrenia, NPC podrían ser una población neuronal robusta y altamente replicativa con el que estudiar los mecanismos responsables de la enfermedad. Además, porque se puede generar rápidamente un gran número de células y no es necesario esperar semanas o meses para la maduración neuronal, ensayos basados ​​en NPC son adecuados para el estudio de grandes cohortes de pacientes y son más susceptibles de cribado de alto rendimiento. Creemos que hiPSC NPCs puede servir como sustituto de las vías de desarrollo que posiblemente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad, como ya se ha demostrado en los trastornos tan diversos como la esquizofrenia ¹ y la enfermedad de Huntington ^11.

Para diferenciar los NPCs de hiPSCs, neural inicial enla producción se lleva a cabo por doble SMAD inhibición (0,1 mM y 10 mM LDN193189 SB431542) ^12. Por antagonizar BMP y TGF señalización con estas pequeñas moléculas, endodermo y mesodermo especificación está bloqueada, la aceleración de la diferenciación neuronal y que conduce a la formación de rosetas neuronales visibles dentro de una semana de la siembra. Patrón Neural se produce temprano en este proceso, presumiblemente durante el período de formación de rosetas neural e inmediatamente después. A falta de otros indicios, estas células nerviosas primitivas suponen un-cerebro anterior como el destino anterior ^13. Inmediatamente después de la formación de rosetas neural, y continua a lo largo de la expansión de la APN, NPCs del cerebro anterior se cultivan con FGF2 ^8,14. Tienen potencial linaje dual y se pueden diferenciar de las poblaciones neuronales del 70-80% neuronas III-tubulina-positivas y 20-30% de proteína ácida glial fibrilar (GFAP) -positivos astrocitos (Figura 1). La mayoría de las neuronas del cerebro anterior hiPSC son VGLUT1-positivo, Y también lo son presumiblemente glutamatérgica, aunque aproximadamente el 30% de las neuronas son GAD67-positivo (GABAérgicas) ^8.

NPC se pasan rutinariamente más de diez veces in vitro, mientras que el mantenimiento de los perfiles de diferenciación consistentes, y sin acumular anomalías del cariotipo. Los grupos han reportado NPCs pases más de 40 veces ^15, sin embargo, nos encontramos con que más allá de diez pasajes, NPCs muestran una mayor propensión a la diferenciación de los astrocitos. NPCs bien tolera múltiples congelaciones deshielos y puede ser la transición a crecer como neuroesferas simplemente cultivando en placas no adherentes. NPCs son transducidas eficientemente por vectores virales, lo que permite una rápida evaluación de las consecuencias moleculares y celulares de la perturbación genética, y fácilmente ampliable para producir suficiente material para estudios bioquímicos. Además, porque los vectores virales permiten robusta sobre-expresión y / o desmontables de genes relevantes de la enfermedad, ya sea en el control o paciente derivada neurcélulas de Al, se puede utilizar esta plataforma para probar el efecto de los antecedentes genéticos de estas manipulaciones. Aunque no es adecuado para sináptica o ensayos basados ​​en actividades que requieren las neuronas maduras, NPCs puede ser una alternativa práctica para muchos análisis moleculares o bioquímicos directas de las células neuronales derivadas del paciente.

Protocolo

1. hiPSC Diferenciación de células progenitoras neurales

1. Crecer y expandirse hiPSCs en células madre embrionarias humanas (HES) medios de comunicación (Tabla 1) co-cultivadas en un fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) capa alimentadora hasta grandes (pero subconfluentes) colonias están listos para la diferenciación neural a través de un cuerpo embrioide (EB) intermedia (Figura 2). Condiciones de rutina cultura hiPSC están bien descritas en otra parte ^16,17; Brevemente, hiPSCs crecer en medios de HES en una capa de alimentación MEF hasta la confluencia, el paso entonces enzimáticamente con colagenasa (1 mg / ml en DMEM) y ampliar aproximadamente 1: 3 cada 7 días.
2. Para preparar placas recubiertas de poli-L-ornitina / laminina, placas de capa con 10 g / ml de poli-L-ornitina en agua estéril para superficies de plástico (50 g / ml para las superficies de vidrio) y se incuba a temperatura ambiente durante 3-24 horas. Lavar al menos una vez con agua estéril y luego cubra con 5 g / ml laminina en PBS estéril a temperatura ambiente durante 3-24 horas.
   NOTA: Si envuelto en plástico, placas pueden seralmacenada durante hasta seis meses a -20 ºC.
3. En el Día 1, enzimáticamente levantar hiPSCs subconfluentes (generalmente cultivadas en MEFs, o hiPSCs cultivadas en medios definidos, tales como TeSR ¹⁸ en Matrigel) de la placa como grandes colonias utilizando 1 mg / ml de colagenasa IV en DMEM / F12.
   NOTA: Después de 1-2 h de incubación a 37 ºC, las colonias se flotando en el plato.
4. Lave suavemente colonias hiPSC (por decantación, la centrifugación no) 1-2x con DMEM / F12, volver a suspender en 2 ml / pocillo de N2 / media B27 (Tabla 1) y la transferencia a los platos no adherente de 6 pocillos (combinar 3 pozos en 1 -bueno) ^19.
   NOTA: Durante la noche, las colonias se formarán grupos esféricas flotantes denomina "cuerpos embrionarios" (EBS). Esperar la muerte celular sustancial.
5. En el día 2, las placas de inclinación y permita EBS se asiente. Retire con cuidado los medios de comunicación y lavar una vez con DMEM / F12 para eliminar los residuos. Alimentar con N2 / B27 medio suplementado con inhibidores de Smad duales (0,1 M LDN193189 y 10M SB431542) ¹² .
6. En los días 3-7, neuralization se producirá en el contexto de la inhibición SMAD dual; comprobar que los OC son redondos pero no quística. Alimente EBS cada segundo día con los medios de comunicación N2 / B27 suplementado con 0,1 M LDN193189 y 10M SB431542.
7. En los días 7-14, después de chapado de EBS a la poli-L-ornitina / laminina placas recubiertas, comprobar usando un microscopio de campo claro que rosetas neurales comienzan a aparecer dentro de unos pocos días (caracterizado como racimos redondos de células neuroepiteliales con la polaridad-apico basal; la Figura 1). Continuar para alimentar EBS adherentes cada segundo día con los medios de N2 / B27 suplementado con 0,1 M LDN193189, 10M SB431542 y 1 g / ml de laminina.

2. Cosecha de Neural Rosetas

NOTA: Se recomienda que rosetas neuronales pueden cosechar enzimáticamente usando Neural Rosette Selección Reactivo ²⁰ o reactivo de selección similar. Aunque rosetas neuronales pueden ser recogidos manualmente en 6 pocillos de poli-L-ornitina / laminina placa recubierta, thimetodología s lleva una amplia formación de dominar, y, dependiendo de la habilidad del usuario, puede requerir una segunda ronda de recoger en el día 20 para enriquecer aún más para NPCs y agotar tipos de células no neuronales.

1. Para la selección enzimática de rosetas neuronales en el día 14, los medios de aspirado de EBS adheridas y añadir 1 ml de reactivo neuronal selección roseta por pozo de una placa de 6 pocillos. Se incuba a 37 ºC durante 1 hora.
2. Con un Pipetman P1000, retire con cuidado la enzima de cada pocillo. Añadir 1 ml de DMEM / F12 por pocillo de lavar.
3. Con un P1000, recoger los 1 ml de DMEM / F12 y rápidamente expulsar al DMEM / F12 de nuevo en el pozo, separando así los rosetones de la placa. Recoge las rosetas en un tubo Falcon.
4. Pipetear otro 1 ml de DMEM / F12 y expulsar rápidamente en el mismo pozo para separar restantes rosetas. (No se tritura. Trate de no romper los agregados de roseta). Recoge las rosetas neuronales en mismo tubo Falcon.
5. Repita el paso 2.4, según sea necesario. Si rosetas no se desprenden fácilmente, añadir more enzima y repetir el proceso (pasos 2.1 a 2.4)
6. Girar las células a 300 xg durante 3 min. Aspirar el lavado, y volver a suspender rosetas en 2 ml de medio de NPC (Tabla 1). La transferencia de células (1: 1) en una poli-L-ornitina / laminina recubiertas 6 placa de pocillos.
7. De 15 a 21 días, las rosetas neuronales ampliarán; rosetas de alimentación cada segundo día con los medios de comunicación de la APN.
8. Evaluar la calidad de las rosetas neuronales y asegurarse de que las células de tipo fibroblasto planos no están expandiendo dentro de la cultura.
   NOTA: Si no rosetas persisten, la cultura de la APN a veces puede ser salvado por picking manual, seleccionando sólo los mejores de los rosetones recogido en Accutase. Disociar 15 min a 37 ºC. Pellet, lavar y placa en los medios de comunicación de la APN en 24 pocillos placa recubierta de poli-L-ornitina / laminina.

3. Ampliación de células progenitoras neurales

NOTA: hiPSC PNJ se puede cultivar en cualquier Matrigel- o poli-L-ornitina / laminina placas recubiertas. Utilizamos típicamente Matrigel-placas, ya que se pueden preparar con mayor rapidez y menor coste.

1. Para preparar placas Matrigel recubiertos, descongelar y volver a suspender rápidamente una alícuota de 1 mg de Matrigel congelado en 24 ml de frío DMEM / F12 y distribuir inmediatamente 2 ml a cada pocillo de dos placas de seis pocillos. Incubar durante al menos 1 hora a 37 ºC.
   NOTA: Matrigel sólo necesita ser aspirado, no se lava, inmediatamente antes del uso.
2. Alimente NPCs cada dos días y mantener a muy alta densidad o que de forma espontánea se diferenciarán a las neuronas.
   NOTA: NPCs Aunque más establecidos suelen dividieron 1: 4 cada semana, NPCs muy bajos de paso se pueden dividir 1: 2 con tan poca frecuencia como una vez cada dos semanas.
3. Para dividir, primeros medios de aspirado y añadir 1 ml cálido Accutase (1X) por pocillo de placa de 6 pocillos. Se incuba a 37 ºC durante 10-15 minutos.
4. Transferir suavemente las células desprendidas en un tubo de 15 ml que contenía DMEM / F12 con la menor tensión mecánica posible. No valorar las células, mientras que en la enzima. Células de pellets por spinning a 1000 xg durante 5 min.
5. Aspirar el lavado, y volver a suspender NPCs en ~ 1 ml NPC medios por pozo original de 6 pocillos.
   NOTA: Esperar que un pozo confluente de una placa de 6 pocillos tiene 5-10 millones de células; esto puede ser confirmado contando una alícuota de 10 l de células utilizando un hematocitómetro antes de volver a chapado.
6. Después de la resuspensión, NPCs re-placa como NPCs, neuronas o neuroesferas. Para mantener NPCs, placa aproximadamente 1-2 millones de células por pocillo de una placa de 6 pocillos. La eficacia de la formación neurosphere puede variar entre los experimentos y las líneas celulares, pero en general se produce mejor si entre 200.000 y 1.000.000 células se sembraron por pocillo de una placa de 6 pocillos no adherente; si se produce aglutinación de las neuroesferas, reducir el número de células sembradas. Para diferenciar a neuronas, placa de aproximadamente 200.000 células por pocillo de una placa de 6 pocillos, en sustitución de los medios de comunicación de la APN con los medios de comunicación neurona.
7. Inmunohistoquímicamente validar cada línea NPC establecido. Una vez que el material celular suficiente ha sido expanded, NPCs etiquetas con anticuerpos para Nestin y Sox2. Líneas Validado NPC también deben diferenciarse en neuronas durante 4-6 semanas, y se marcaron con anticuerpos para III-tubulina y MAP2AB.
   1. Fijar las células en paraformaldehído al 4% en PBS a 4ºC durante 10 min. Permeabilizar NPCs a TA durante 15 min en 1,0% de Triton en PBS, y luego bloquear en 5% de suero de burro con 0,1% Triton a TA durante 30 min.
   2. Incubar con el anticuerpo primario en 5% de suero de burro con 0,1% de Triton, durante la noche a 4ºC.
      NOTA: Se recomienda los siguientes anticuerpos: cabra anti-Sox2, 1: 200; Nestin de ratón anti-humano, 1: 200; de conejo anti-βIII-tubulina, 1: 500; ratón anti-βIII-tubulina, 1: 500; ratón anti-MAP2AB, 1: 200. (Figura 2).
   3. Después de un lavado con PBS, se incuban las células anticuerpos secundarios con el anticuerpo secundario conjugado apropiado cabra, ratón o conejo a 1: 300, en en 5% de suero de burro con 0,1% Triton durante 1-2 horas a TA. Para visualizar los núcleos, células de tinción con 0,5 g / ml DAPI (4 ', Montaje de 6-diamidino-2-fenilindol) y luego con Vectashield.

4. NPC Transducción

1. Utilice spinfection (centrifugación de placas de cultivo celular en presencia de virus a 1.000 xg durante 1 hr) para aumentar el porcentaje de células transfectadas ^21. Aspirar los medios de comunicación y reemplazarla por la sobreexpresión relevante (o control) lentivirus (o retrovirus), tituladas a la multiplicidad deseado de infección (MOI) (típicamente 1-10), diluido en los medios de comunicación de la APN. Use 1,5 ml de volumen por pocillo de una placa de 6 pocillos (o un volumen escala apropiada para otros tipos de placas de cultivo tisular). Giran a 1000 xg y 37 ºC durante 1 hora en una centrífuga de placas.
   NOTA: Idealmente, la transducción de NPCs con lentiviral o vectores retrovirales dentro de 1-2 días de separación. Si el uso de virus comerciales o preparado en el laboratorio, puede ser útil para titular apropiadamente lotes de virus de antemano por dilución en serie. (Figura 3).
2. Para reducir celmuerte lular, sustitución de los medios dentro de 8 horas de spinfection.
   NOTA: la integración viral y la expresión transgénica deberían ser detectables dentro de las 24 horas por fluorescencia gen reportero. (Si el virus carece de un indicador fluorescente, esto es más difícil de evaluar; transfección exitosa mejor puede ser validada por inmunotransferencia, inmunohistoquímica o qPCR para los productos de sobreexpresión.) Expresión completa puede tardar de 3-7 días; spinfections repetidos con virus adicional puede ser necesaria para aumentar el porcentaje de células transfectadas. Spinfections recurrentes pueden ocurrir a diario, pero no tienen que ser tan frecuentes. Idealmente, si se utiliza un indicador fluorescente,> 80% de las células deben ser etiquetados.

5. Neurosphere ensayo de migración

NOTA: neuroesferas forma espontáneamente, tras la disociación enzimática de NPC (por una manera idéntica a la utilizada en la expansión NPC - los pasos 3.3 a 3.6), si las células se cultivan en suspensión en medios NPC.

1. Brevemente, se disocian crecerNPCs d en los medios de comunicación de la APN para 48 horas en placas adherentes a fin de generar neuroesferas. (Figura 4).
2. Para la migración neurosphere, preparar placas Matrigel frescas usando los medios de comunicación de la APN frío, en lugar de DMEM, en una placa de 96 pocillos, 1-2 horas antes de la neurosphere picking. No aspirar Matrigel de los pozos.
3. Como se publicó originalmente para neuroesferas derivadas de células madre embrionarias de ^22, recoger manualmente neuroesferas derivadas de NPC con un microscopio, después de lavar una vez en los medios de comunicación de la APN para eliminar restos celulares. Transferir una neuroesfera a cada pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta con Matrigel.
4. Añadir un 0,5 mg adicionales Matrigel, diluido en medios NPC frías, a las neuroesferas en cada placa de 96 pocillos.
5. Centrar manualmente cada neurosphere individuo en el centro del pozo utilizando una punta de pipeta.
   NOTA: Es importante escoger neurosferas de tamaño similar, con el fin de reducir la variabilidad en los resultados.
6. Permita que la migración se produzca durante 48 horas y luego fijar las células wITH paraformaldehído al 4% y tinción con marcadores inmunohistoquímicos deseados.
7. Si la migración radial se determinará, neurosferas fotografía en su totalidad utilizando un objetivo 4x microscopio. Excluir las neuroesferas en contacto con el borde del pozo o una segunda neurosphere del análisis.
   NOTA: Si la migración se produce durante más de 48 horas, la migración radial resultante probablemente será demasiado grande para la imagen con un objetivo 4x.
8. Medir la migración promedio de cada neurosphere utilizando el software NIH ImageJ (Figura 5). Esto se puede hacer utilizando cualquiera de los métodos de análisis descritos a continuación:
   1. Migración radial:
      1. Trazar manualmente el borde de las células más lejanos migrar utilizando la herramienta de selección a mano alzada a continuación, utilizar la función (Ctrl + M) Medida para calcular el área de la forma resultante. Antes de medir el área, asegúrese de que la zona está marcada en la ventana Set Medidas encontrado en la ficha Analizar. Utilice lavalor de la medición de área y la ecuación para el área de un círculo (A = πr ²⁾ para determinar el radio (exterior).
      2. Trazar el borde de la neurosphere original, medir el área y calcular el radio (interior) de la misma manera. Calcular la migración radial total como la diferencia entre los radios exterior e interior.
   2. Greatest migración celular:
      1. Medir la distancia recorrida de las cinco células más alejadas del borde de la neuroesfera interior con la función de selección de línea recta, seguido por la función (Ctrl + M) Medida.

Resultados

Rosetas neuronales pueden ser identificadas morfológicamente, utilizando un microscopio de campo claro, por su aspecto característico como racimos redondos de células neuroepiteliales con la polaridad-apico basal (Figura 1). Aunque NPCs son típicamente cultivaron a muy alta densidad celular, inmediatamente después de los pases, ligeramente soma de forma piramidal y la estructura de neuritas bipolar es visible (Figura 1D). NPCs validados expresan nestina y Sox2 en la mayoría de las célul...

Discusión

Hemos descrito los métodos por los que pueda diferenciar hiPSCs en NPCs, un tipo de célula neuronal en la que se conserva una parte importante de la firma genética de neuronas derivadas de hiPSC y que pueden servir como un sustituto de las vías de desarrollo que posiblemente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad ^{8, 11.} Además, como hemos detallado, NPCs son una población neuronal robusta replicativa y fácilmente transducidas, que creemos que puede ser adecuado para los estudios moleculares y bioquímic...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12	Life Technologies	#11330	para medios HES
DMEM/F12	Life Technologies	#10565	para medios neuronales
KO-Serum Replacement	Life Technologies	#10828	Necesita ser probado por lotes
Glutamax	Life Technologies	#35050
NEAA	Life Technologies	#11140
N2	Life Technologies	#17502-048	Necesita ser probado por lotes
B27-RA	Life Technologies	#12587-010	Necesita ser probado por lotes
FGF2	Life Technologies	#13256-029	Resuspender en PBS + 1% BSA
	LDN193189 Stemgent	#04-0074
	SB431542 Stemgent	#04-0010
BDNF	Peprotech	#450-02	Resuspender en PBS + 0.1% BSA
GDNF	Peprotech	#450-10	Resuspender en PBS + 0.1% BSA
Dibutiril cíclico-AMP	Sigma	#D0627	Resuspender en PBS + 0.1% BSA
Ácido L-ascórbico	Sigma	#A0278	Resuspender en H20
STEMdiff Reactivo de selección de roseta neural	Stemcell Technologies	#05832
Accutase	Innovador Cell Technologies	AT-104
Colagenasa IV	Life Technologies	#17104019
CF1 mEFs	Millipore	#PMEF-CF
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
Laminina, Ratón Natural 1 mg	Life Technologies	#23017-015
BD Matrigel	BD	#354230	Vuelva a suspender en hielo en DMEM frío a 10 mg / ml, use 1 mg por dos placas equivalentes a 6 pocillos
Placas de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejidos	Corning	3506
Placa de 6 pocillos de fijación ultra baja	Corning	3471
cabra anti-Sox2	Santa Cruz	sc­ 17320	uso a 1:200
ratón anti-humano Nestin	Millipore	MAB5326	uso a 1:200
conejo anti-y beta; III-tubulina	Covance	PRB­ Uso de 435P	a 1:500
ratón anti-y beta; III-tubulina	Covance	MMS­ Uso 435P	a 1:500
ratón anti-MAP2AB	Sigma	M1406	uso a 1:200
Centrífuga de placas	Beckman Coulter	Beckman Coulter Allegra X-14 (con portador de placas SX4750)