Imagen Ca Local<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en las células de mamífero en cultivo

Resumen

Aquí presentamos técnicas para obtener imágenes de eventos locales de Ca²⁺ mediados por IP₃ utilizando microscopía de fluorescencia en células de mamíferos intactas cargadas con indicadores de Ca²⁺ junto con un algoritmo que automatiza la identificación y el análisis de estos eventos.

Resumen

Citosólica iones Ca2 ⁺ a regular diversos aspectos de la actividad celular en casi todos los tipos de células, el control de procesos tan diversos como la transcripción de genes, excitabilidad eléctrica y la proliferación celular. La diversidad y la especificidad de la señalización de Ca2 ⁺ se deriva de mecanismos por los que Ca ^{2 +} señales se generan para actuar sobre diferentes escalas de tiempo y espaciales, que van desde las oscilaciones y las ondas de todo el celulares que ocurren durante los períodos de minutos a locales transitorias de Ca2 ⁺ microdominios (Ca ²⁺⁾ bocanadas milisegundos duraderos. Los recientes avances en electrónica se multiplicaron CCD (EMCCD) cámaras permiten ahora para obtener imágenes de Ca ^{2 +} señales locales con una resolución espacial de 128 x 128 píxeles a una velocidad de> 500 marcos ^seg-1 (fps). Este enfoque es altamente paralelo y permite la monitorización simultánea de cientos de canales o de los sitios de hojaldre en un solo experimento. Sin embargo, las grandes cantidades de datos generados (aproximadamente 1 pe Gbr min) hacer la identificación visual y análisis de Ca ²⁺ local de eventos impracticable. Aquí describimos y demostrar los procedimientos para la adquisición, la detección y el análisis de IP local ₃ mediada por Ca ^{2 +} señales en células de mamífero intactas cargadas de Ca ²⁺ indicadores utilizando tanto de campo amplio epi-fluorescencia (WF) y la reflexión interna total fluorescencia (TIRF) microscopía. Además, se describe un algoritmo desarrollado en el entorno Python software de código abierto que automatiza la identificación y el análisis de estos Ca ^{2 +} señales locales. El algoritmo localiza sitios de liberación de Ca2 ⁺ con resolución sub-pixel; permite la revisión de los datos de usuario; y emite secuencias de tiempo de señales de relación de fluorescencia junto con amplitud y datos cinéticos en una tabla compatible con Excel.

Introducción

Los iones de calcio (Ca2 ⁺⁾ de forma ubicua regulan una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo la expresión génica, la secreción y cambios de larga duración en la plasticidad sináptica ^1. Una manera a través del cual Ca ²⁺ puede actuar de una manera tan diverso es a través de los diferentes patrones espaciales y temporales de Ca ^{2 +} señales de una célula puede generar. Por ejemplo, elevaciones globales en citosólico [Ca ^{2 +]} contracción de activación en el tejido muscular liso ^2, mientras más pequeño, elevaciones transitorias localizadas (locales Ca ²⁺ microdominios) estimular la expresión esencial para el aprendizaje y la memoria ³ gen.

Citosólico libre [Ca ^{2 +]} se mantiene a ~ 100 nM en reposo, pero puede aumentar rápidamente a varios micro-molar después de la afluencia de Ca2 ⁺ en el citosol a través de canales de Ca2 ⁺ de iones permeables situados en la membrana plasmática y por la liberación de Ca2 ⁺ intracelular de stores. Nuestro laboratorio se centra en el inositol 1,4,5-trifosfato receptor (IP ₃ R), que forma un canal de liberación de Ca ²⁺ situado en la membrana del retículo endoplasmático (ER). Tras la unión de ambos IP ₃ y Ca ²⁺ a la citosólica sitios del receptor activador, el canal R IP ₃ se abre para liberar Ca ²⁺ secuestrado dentro de la luz del RE. La liberación de Ca ²⁺ puede permanecer espacialmente restringida a un pequeño grupo de IP ₃ Rs para generar un microdomain citosólica local del Ca ²⁺ (Ca ²⁺ puff ⁴⁾ o, dependiendo de la proximidad de los grupos vecinos de IP ₃ Rs, puede propagar en una célula mediante la contratación de varios sitios de hojaldre a través de un proceso de Ca2 ⁺ inducida por Ca ^{2 + de liberación} (CICR) ^5,6.

La introducción de la pequeña molécula fluorescente Ca ²⁺ colorantes indicadores desarrollado por Roger Tsien ^7, junto con la avanzada imagi microscopíang técnicas, ha facilitado en gran medida nuestra comprensión de Ca ^{2 +} señalización. Los recientes avances en cámaras utilizadas para microscopía permiten ahora para obtener imágenes de transitorios de Ca2 ⁺ eventos locales, tales como soplos con resolución espacial y temporal sin precedentes. Actualmente cámaras EMCCD disponibles permiten imágenes de 128 x 128 píxeles a> 500 marcos seg ^-1 (fps) y la nueva generación de semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) cámaras proporcionan una mayor resolución de píxeles, y la velocidad aún más rápida a costa de un poco más alto los niveles de ruido. En conjunción con la reflexión interna (TIRF) microscopía total, ahora es posible de una sola imagen Ca ²⁺ eventos de canal ^8,9. Este enfoque permite la obtención de imágenes de cientos de canales / eventos simultáneamente, mientras que la generación de grandes conjuntos de datos (ca. 1Gb por minuto) que hacen que el tratamiento manual, la identificación visual y análisis impracticable y colocan una responsabilidad en el desarrollo de algoritmos automatizados.

A continuación, presentamos los procedimientos y protocolos para la formación de imágenes locales Ca ^{2 +} señales en células de mamífero intactas usando Ca ²⁺ indicadores fluorescentes. Además, demuestran un algoritmo desarrollado en el entorno Python de código abierto que automatiza la identificación y el análisis de Ca ²⁺ eventos locales fotografiados por tanto TIRF y amplio campo epi-fluorescencia convencional (WF) microscopía. Aunque estos enfoques se describen en el contexto de IP ₃ -generated Ca ^{2 +} señales, que son fácilmente susceptibles de estudiar los cambios locales en citosólico [Ca ^{2 +]} que emanan de una variedad de canales de Ca2 ⁺ de iones permeables situados en cualquiera de la superficie membrana o orgánulos intracelulares ^8-10.

Protocolo

Presentamos los procedimientos detallados para obtener imágenes locales de Ca2 ⁺ eventos en neuroblastoma humano SH-SY5Y células. Estos procedimientos pueden ser adaptados a la imagen intracelular de Ca ^{2 +} señales en muchos tipos de células ^8-10.

1. Preparación de las células

1. Cultura de las células para obtener imágenes de acuerdo a las instrucciones que aparecen en la página web de su proveedor.
2. Unos pocos días antes de la imagen, las células de cosecha cultivadas en un matraz de cultivo de tejido usando 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (2-3 min). Después de la separación, añadir un volumen igual de medio de cultivo para inactivar la tripsina.
3. Realizar un recuento de células usando un hemocitómetro y semillas células en placas de formación de imágenes de fondo de vidrio a una densidad de 3-7 x 10 ⁴ células por placa. Seleccione las celdas para los experimentos de imagen cuando llegan a 60% de confluencia (2-3 días).

2. Preparación de soluciones y reactivos

1. Preparar una Ca ^{2 + que contienen} HEPES buffersolución de sal (Ca ²⁺ -HBSS) compuesto de (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 _{CaCl2, MgCl2} 1, HEPES 10, y 10 de la glucosa; pH = 7,4 a temperatura ambiente (RT) con NaOH. Preparar Ca ²⁺ -HBSS sin la adición de glucosa y se almacena a 4 ° C; añadir glucosa a la solución inmediatamente antes de su uso.
2. Solubilizar formas de membrana permeable de la Ca ²⁺ indicador fluorescente Cal-520 (1 mM), ci-IP ₃ (200 mM), y EGTA (100 mM) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) que contiene 20% de Pluronic F-127. Alícuota de estos reactivos en tubos y tienda de Eppendorf, protegidos de la humedad y de la luz, a -20 ° C.

3. Carga de células con membrana permeable-Cal-520, ci-IP ₃ y EGTA

1. Preparar el "tampón de carga" mediante la dilución de las soluciones madre de la membrana permeable Cal-520 y ci-IP ₃ a una concentración final de 5 mM y 1 mM, respectivamente, en Ca ²⁺ -HBSS.
2. Aspirar cumedios lture y enjuagar las células mediante la sustitución de los medios de comunicación con Ca ²⁺ -HBSS tres veces.
3. Eliminar Ca ²⁺ -HBSS e incubar las células en tampón de carga durante 60 minutos a RT en la oscuridad.
4. Retire tampón de carga y enjuague células mediante la sustitución de los medios de comunicación con Ca ²⁺ -HBSS tres veces.
   1. Si lo desea, en este paso, células de carga con EGTA / AM por dilución de la solución madre a una concentración final de 5 mM de Ca ²⁺ -HBSS y luego se incuban las células durante 30-60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de esta incubación, lavar las células tres veces con Ca ²⁺ -HBSS antes de proceder al paso 3.5.
5. Se incuban las células en Ca ²⁺ -HBSS durante 30 min para permitir la de-esterificación de los reactivos cargados.
6. Inmediatamente antes de la proyección de imagen, reemplace Ca ²⁺ -HBSS con "fresco" Ca ²⁺ -HBSS con el fin de eliminar cualquier tinte que podrían haber filtrado al baño durante la incubación final.

4. Ca ²⁺ Adquisición de imágenes

1. Coloque una pequeña gota de aceite de inmersión sobre el objetivo 100X APO TIRF (NA 1.49).
2. Montar el plato de imagen en el escenario del microscopio invertido y traer las células en el foco con luz transmitida. Es importante asegurar el plato de formación de imágenes para evitar el movimiento durante la grabación.
3. Iluminar células con un láser de 488 nm para excitar Cal-520 y recoger la fluorescencia emitida (λ> 510 nm) utilizando una cámara EMCCD de alta velocidad.
   NOTA: El paquete de software que opera el microscopio permite al usuario para traducir una lente de enfoque permitiendo que el rayo láser para ser introducido ya sea en el borde extremo de la abertura de vuelta objetivo (para la excitación TIRF) o más en el centro (para la excitación "WF").
4. Usando el software EMCCD, reducir el campo de la imagen de los plenos 512 x 512 píxeles con el fin de recoger datos en la resolución temporal necesaria para capturar Ca ²⁺ eventos locales.
   NOTA: Por ejemplo, quad centroadquisición de 256 x 256 píxeles acelera la velocidad de adquisición a 66 fps. También es posible aumentar aún más la velocidad de fotogramas de la cámara EMCCD a 500 fps usando una función de modo de recorte aislado.
5. Configurar el software para grabar automáticamente unos pocos segundos de actividad basal, entregar un destello UV a las células y continuar la grabación por otro 10-30 seg.
   NOTA: Un destello UV se suministra usando una fuente de luz de arco de xenón introducido a través de un espejo dicroico que refleja UV en el puerto trasero del microscopio. La duración y la intensidad del flash UV se ajusta empíricamente para evocar una frecuencia deseada de Ca ²⁺ eventos locales.
6. Guardar archivos de imagen como las pilas para el análisis fuera de línea.

5. Análisis Automatizado Ca ²⁺ Imagen

NOTA: Es posible visualizar, procesar y analizar datos obtenidos con muchos paquetes de software comerciales. Sin embargo, hemos desarrollado un algoritmo para automatizar rápidamente una identificaciónanálisis d de Ca ^{2 +} señales locales. Una descripción detallada de los filtros espaciales y temporales utilizados en este algoritmo, la generación de las Delta F / F ₀ y la identificación / análisis rutinas se puede encontrar en ^11. Este algoritmo ha sido desarrollado para funcionar en la plataforma de software de código abierto Python, y puede obtenerse, junto con muestras de datos experimentales y las instrucciones detalladas de usuario, enviando un correo electrónico del autor correspondiente (ismith@uci.edu).

1. Convertir archivos a ser importados en el algoritmo de encargo por escrito al formato de archivo de la multi-plano .tiff.
2. Busque la carpeta que contiene el algoritmo de análisis y haga doble clic en el run.exe.
3. Seleccione el archivo .tiff para ser analizada.
4. Elija los parámetros de análisis en el cuadro de diálogo abierto. Ver Figura 2A para los parámetros por defecto de los datos de la muestra.
5. Determinar el nivel de negro para ser desplazada con respecto a la pila de imagen, ya sea moviendo el cursor a una parte del campo de vista que hace not contiene una celda (ver Figura 2B) o introduciendo manualmente un nivel de negro mediante el símbolo del "Nivel Negro Set '.
6. Observar cuatro ventanas en la pantalla siguiente análisis por el software (Figura 2C-F). C es una imagen monocroma de reposo de fluorescencia de las células que se analiza. Casillas blancas superpuestas en esta imagen son los lugares de actividades, determinadas como las posiciones de los centroides de funciones gaussianas bidimensionales instalados en eventos.
7. Haga clic en cada lugar del evento o presione las teclas de cursor para desplazarse entre los eventos. Al hacerlo, el fondo-resta, Gauss alisó cambios de relación de fluorescencia (? F / F ₀₎ en cada uno de estos sitios de actualización en la ventana D.
   NOTA: Rojo destacó eventos están decididos a proceder de ese sitio en particular y no de "sangrar a través 'de la actividad localizado en lugares adyacentes. El trazo azul inferior indica que la señal de fluorescencia en el sitio seleccionado superó la detecciónumbral, mientras que la línea negro identifica los eventos procedentes de ese sitio en particular (que corresponde al rojo eventos resaltado).
8. Haga clic en un rojo resaltado evento para actualizar la ventana E que muestra la evolución temporal del evento, y la ventana F, que muestra el perfil espacial del evento promedio durante su curso temporal, junto con el perfil espacial de la función de Gauss equipada.
9. Revisar manualmente los eventos que se han identificado para que los artefactos pueden ser rechazadas desde el análisis. Eliminar este tipo de eventos haciendo clic derecho en el rojo eventos resaltado.
   NOTA: En nuestras manos, Ca ²⁺ flujo a través de los canales individuales IP ₃ R evoca señales con Df / F ₀ alrededor de 0,11, por lo que es probable que sean falsos positivos ningún 'eventos' detectados apreciablemente más pequeños que esto.
10. Exportar datos seleccionando "Guardar en Excel" o exportar datos en una base por célula dibujando alrededor de la célula de interés y seleccionar 'Guardar CellR17 ;.
    Nota: Los datos se guardan en la misma carpeta que la pila imagen original.

Resultados

La figura 1A muestra una imagen WF de descansar Cal-520 fluorescencia en células de neuroblastoma humano SH-SY5Y también cargados de ci-IP _3. La exposición de estas células a un flash 100 ms UV para foto-release i-IP ₃ provocó transitorios de Ca2 ⁺ puffs en sitios discretos (señaladas por los círculos blancos en la figura 1A). Trazas fluorescencia medida en estos sitios mostraron una fase ascendente rápido debido a las aberturas transitorios de IP _3...

Discusión

Describimos aquí los protocolos locales para obtener imágenes de Ca ²⁺ eventos en células de mamífero en cultivo usando Ca ²⁺ indicadores fluorescentes. Además, se describe un algoritmo con una interfaz de usuario intuitiva que automatiza la identificación y análisis de los datos adquiridos. El procedimiento descrito aquí utilizan el Ca ²⁺ fluorescente indicador Cal-520, pero muchas otras Ca ²⁺ tintes sensibles como Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 y Oregon Green BAPTA-1 realiza suficie...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células de neuroblastoma humano SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropilideno-6-O-(2-nitro-4,5-dimetoxi)bencil-myo-Inositol 1,4,5-trisfosfato-Hexakis(propionoximetil) Éster	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% plurónico F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
Platos de imagen con fondo de vidrio de 35 mm	MatTek	P35G-1.5-14-C