Aquí presentamos un protocolo que proporciona una herramienta para examinar los mecanismos reguladores de genes específicos durante el desarrollo del hipocampo. El empleo de la electroporación ex útero y el cultivo de cortes organotípicos permite la regulación hacia arriba y hacia abajo de la expresión de genes de interés en células individuales y seguir su destino durante el desarrollo.
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Artículo de método
Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue
En este artículo
Resumen
Resumen
Mouse genetics ofrece una poderosa herramienta para determinar el papel de genes específicos durante el desarrollo. El análisis de los fenotipos resultantes mediante métodos inmunohistoquímicos y moleculares proporciona información sobre los posibles genes diana y las vías de señalización. Para dilucidar aún más los mecanismos reguladores específicos se requiere un sistema que permita la manipulación de solo un pequeño número de células de un tejido específico mediante sobreexpresión, ablación o reintroducción de genes específicos y seguir su destino durante el desarrollo. Para lograr esto, la electroporación ex utero de las estructuras del hipocampo, especialmente el giro dentado, seguida de un cultivo en corte organotípico, proporciona dicha herramienta. El uso de este sistema para generar deleciones en mosaico permite determinar si el gen de interés regula de forma autónoma los procesos de desarrollo celular, como la proliferación de células progenitoras o la diferenciación neuronal. Además, facilita el rescate de fenotipos mediante la reintroducción del gen delecionado o de sus genes diana. A diferencia de la electroporación en el útero, el enfoque ex útero mejora la tasa de éxito dirigido a las capas más profundas del cerebro, como el giro dentado. En general, la electroporación ex útero y el cultivo organotípico de cortes proporcionan una potente herramienta para estudiar los mecanismos reguladores en un entorno seminativo que refleja las condiciones endógenas.
Introducción
El hipocampo desempeña un papel importante en la memoria y el aprendizaje, así como el comportamiento emocional. Una función principal consiste en la consolidación de la memoria a corto plazo en memoria a largo plazo, lo que requiere una alta plasticidad del sistema nervioso. El giro dentado del hipocampo actúa como puerta de entrada principal de información de entrada y es también una de las dos regiones del cerebro con la neurogénesis continua a lo largo de la edad adulta 1,2. El desarrollo de la estructura del hipocampo se produce durante la embriogénesis tardía y en particular durante los primeros 3 a 4 semanas después del parto 3. Durante el desarrollo temprano de la circunvolución dentada de un grupo de células madre está establecido requiere para postnatal, así como la neurogénesis adulta 4. Las neuronas en desarrollo pasan a través de diversas etapas, desde la célula madre a través de varias etapas de células progenitoras a los inmaduros y, finalmente, la neurona madura durante postnatal así como la neurogénesis adulta. En diferentes etapas de la neurogénesis la expresión degenes específicos se requiere para permitir la maduración y la integración de nuevas neuronas en los circuitos del hipocampo 5,6.
Usando la genética del ratón y análisis de fenotipo por inmunohistoquímica así como los métodos moleculares permitió definir el patrón de expresión y la función de muchos de estos genes. Además el análisis de microarrays, así como la cromatina immunoprecipitation (CHIP) proporcionado información sobre posibles genes diana directos e indirectos 7,8. Sin embargo, todavía hay muchas preguntas abiertas acerca de los mecanismos de regulación del desarrollo del hipocampo, en particular el desarrollo del giro dentado. Para obtener una mayor comprensión de cómo los genes específicos se regulan un sistema es necesario permitir la manipulación de un pequeño número de células por abajo o sobre regulación del gen de interés y / o de sus genes diana y seguir su destino durante el desarrollo. En electroporación in utero de shRNAs, cDNA de genes de interés o Cre recombinase proporciona una herramienta de este tipo. Para asegurar la presencia del ADN deseado o ARNs pequeños plásmidos de expresión se debe utilizar para la electroporación. Este enfoque se implementa con mucho éxito en el estudio del desarrollo cortical 9,10, pero es un enfoque más difícil examinar el desarrollo de la circunvolución dentada debido a la posición de las estructuras del hipocampo en las capas más profundas del cerebro.
Electroporación utero Ex seguido por cultivo de cortes organotípicos es un enfoque para evitar este problema 11,12. En contraste con la electroporación en el útero no todo el embrión, pero sólo la cabeza se utiliza permitiendo por lo tanto para colocar los electrodos de una manera más favorable para dirigir el shRNA / ADN hacia el hipocampo y la circunvolución dentada. Nuestro grupo emplea con éxito fuera del útero de la electroporación para estudiar el papel del factor de transcripción Bcl11b durante el desarrollo del giro dentado 8. Bcl11b tiene un doble papel en el desarrollo giro dentado por regulating proliferación de células progenitoras, así como la diferenciación como quedó demostrado por inmunohistoquímica. Para definir además un mecanismo para la participación Bcl11b en estos procesos, protocolos del grupo Polleux 11,12 se ajustaron para estudiar la circunvolución dentada como se describe a continuación en la sección de protocolo. En una primera aproximación a la cuestión se abordó si Bcl11b está regulando la diferenciación celular de las células neuronales de forma autónoma. Un segundo enfoque examinó si Desmoplakin, un gen diana directa de Bcl11b, es suficiente para rescatar el fenotipo Bcl11b.
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Protocolo
NOTA: Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la ley alemana y fueron aprobados por las oficinas gubernamentales en Tübingen.
1. Preparación de Micropipetas, Soluciones y Membranas
- Preparación de Micropipetas
- Tire micropipetas de vidrio con un extractor micropipeta con el siguiente programa: Heat: 540, Pull: 125, Velocidad: 20 y Delay: 140. Las cantidades longitud de la aguja a 5,5 cm.
- Agujas de bisel utilizando un microgrinder para obtener un tamaño de la punta adecuada de 4 mm. Almacenar las agujas en una caja o 15 cm placa de Petri que se eviten daños de las puntas.
- Preparación de Soluciones
- Solución de ADN plasmídico
- Preparar ADN de plásmido que contiene el constructo de ADNc deseado utilizando un kit Maxi-prep libre de endotoxina de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Ajuste solución de ADN plasmídico a una concentración final de 3 g / l (sin pico GFP vector) o 4 g /l (con 1 g de GFP pico vector) libre de endotoxinas en tampón Tris-EDTA que contiene verde rápido (concentración final 0,05%).
- Solución de laminina Stock
- Disolver 1 mg de laminina en agua estéril hasta un volumen final de 1 ml. Preparar alícuotas de 100 ly se almacena a -80 ° C.
- Poli-L-Lisina solución Stock
- Disolver 50 mg de poli-L-lisina en 50 ml de agua estéril a una concentración final de 1 mg / ml. Preparar alícuotas de 1 ml y se guardan en -20 ° C.
- Completa solución salina equilibrada de Hank (HBSS completo)
- Preparar completa HBSS mediante la combinación de 100 ml de HBSS 10x, 2,5 ml de 1 M de tampón HEPES (pH 7,4), 30 ml de 1 M D-glucosa, 10 ml de 100 mM CaCl 2, 10 ml de 100 mM MgSO 4, y 4 ml de 1 M de NaHCO3. Añadir agua estéril hasta 1 L y se almacena a 4 ° C.
NOTA: Autoclave todas las soluciones de esperar tampón HEPES 1 M y 1 M D-glucosa, que son filter esterilizado.
- Preparar completa HBSS mediante la combinación de 100 ml de HBSS 10x, 2,5 ml de 1 M de tampón HEPES (pH 7,4), 30 ml de 1 M D-glucosa, 10 ml de 100 mM CaCl 2, 10 ml de 100 mM MgSO 4, y 4 ml de 1 M de NaHCO3. Añadir agua estéril hasta 1 L y se almacena a 4 ° C.
- Rebanada medio de cultivo
- Preparar medio de cultivo rebanada mediante la adición de 35 ml de medio basal de Eagle, 12,9 ml de HBSS completo (1.2.4), 1,35 ml de 1 M D-glucosa, 250 l de 200 mM de L-glutamina, y 500 l de penicilina-estreptomicina a obtener un volumen final de 50 ml. Añadir suero de caballo a una concentración final de 5% y se almacena a 4 ° C.
- Punto de bajo punto de fusión (LMP) de agarosa
- Preparar una solución de agarosa LMP 4% mediante la adición de 2 g de agarosa LMP a 50 ml de HBSS completo (1.2.4), seguido por calentamiento en un horno de microondas durante 1-2 minutos a alta potencia. Mantener esta solución en un baño de agua a 37-39 ° C. Guarde la solución a 4 ° C y la reutilización.
- Solución de paraformaldehído
- En una campana de humos preparar una solución de 4% de paraformaldehído (PFA) mediante la adición de 4 g de paraformaldehído a 100 ml de PBS 1x. Calentar la solución a 60 ° C y añadir unas gotas de NaOH 1 N hasta que la solución se convierte en clear.
- Solución de permeabilización
- Disolver 9 g de BSA en 300 ml de 1x PBS que contenía 0,3% Triton X-100 y se almacena a 4 ° C. Añadir 10% de azida de sodio para almacenamiento a largo plazo.
- Solución de ADN plasmídico
- Recubrimiento de insertos de membrana
- Diluir una alícuota de solución de stock laminina (1.2.2) y una parte alícuota de solución madre de poli-L-lisina (1.2.3) en agua estéril hasta un volumen final de 12 ml.
- Coloque los insertos de membrana en placas de 6 pocillos conteniendo cada pocillo 2 ml de agua estéril. Añadir 1 ml de solución de recubrimiento en la parte superior de la membrana y se incuba O / N a 37 ° C en un incubador de CO2 5%.
- Después de la incubación se lava la membrana inserta tres veces con 1 ml de agua estéril y seco. Use protectores de membrana recubiertos en el mismo día o se almacena a 4 ° C durante un máximo de cuatro semanas en una placa bien seco 6.
2. Inyección de ADN y la electroporación de E15.5 y E18.5 embriones
- Anestesie la vez acoplado hembra de ratón colocándolo en una cámara de anestesiante saturado con 5% de isoflurano y conectado a un vaporizador. Circular isoflurano y oxígeno a una velocidad de 1 L / min. Mantenga el animal en el cuadro de 2-4 minutos o hasta inconsciente que se prueba apretando entre las patas del ratón.
- La eutanasia del ratón inconsciente por dislocación cervical en el día embrionario (E) 15.5 o 18.5. Diseccionar el útero contiene los embriones 13 y colocarlo en una placa de Petri que contiene 15 a 20 ml de HBSS frío completa.
NOTA: A partir de este punto en adelante, mantener los embriones y tejidos en el hielo. - Use un par de tijeras para separar cada embrión a partir del cuerno uterino y el lugar en una segunda placa de Petri que contiene HBSS fría completa.
- Bajo un microscopio de disección, cortar la pared muscular uterina y la placenta usando un par de pinzas finas (# 55) y tijeras. Suelte con cuidado el embrión desde el saco vitelino.
- Use un par de tijeras de Bonn de decapitate los embriones justo por encima de las patas delanteras en un ángulo de 60 °. Si el experimento requiere el genotipado de los embriones, se recoge una muestra de tejido para el aislamiento de ADN genómico (un pequeño trozo de la cola).
- Transferir la cabeza a un plato limpio y seco Petri. Debido a que la cabeza había sido decapitado en un ángulo de 60 °, la cabeza debe incline hacia un lado cuando se coloca dorsal hacia arriba.
- Coloque una aguja cuidadosamente en el centro del hemisferio cerca de la bregma (Figura 1A, B). Inyectar aproximadamente 2-3 l (en 3 o 4 g / l) de solución de ADN pisando el pedal del Picospritzer III usando 30 libras de presión para la duración de 10-15 ms por impulso, aplicando 5-8 pulsos. La duración y el número de los impulsos depende del diámetro de la abertura de la aguja con aberturas más pequeñas que requieren más tiempo. El intervalo entre cada pulso asciende a 1 seg.
- Antes de colocar los electrodos, aplique unas gotas de HBSS completo en la cabeza del embryo. Coloque los electrodos de tal manera que el terminal "negativo 'está en el mismo lado que el ventrículo inyectado y el electrodo" positiva "en el lado opuesto del ventrículo inyectada debajo de la oreja de la cabeza del embrión (Figura 1C, D). Aplicar 5 pulsos de 50 V.
- Utilice 3 electrodos mm para E 15.5 y 5 mm para electrodos E 18.5.
3. La disección del cerebro
- Después de la electroporación, retire la piel de la cabeza con la ayuda de un par de pinzas finas. El uso de un par de tijeras de primavera hacer una pequeña incisión en el medio del cerebelo en la línea media del cráneo.
- Inserte las tijeras de primavera en la incisión y cortar longitudinalmente a lo largo de la sutura sagital. Despegar la calavera y separar el cerebro del cráneo mediante el uso de unas pinzas finas. Transfiera todo el cerebro en 15-20 solución HBSS completa ml frío.
- Mientras tanto, se vierte 4% de agarosa LMP,se mantiene a 37-39 ° C en un baño de agua, en un molde de desprendimiento.
- Tome el cerebro de la completa HBSS por una espátula pequeña pala y drenar el exceso de HBSS usando un pañuelo de papel fino o Kimwipes.
- Coloque todo el cerebro suavemente en la agarosa y ajuste su posición con una aguja fina. Mantener el molde en hielo hasta que la agarosa se solidifica y el bloque se secciona (para secciones coronales los bulbos olfativos apuntan hacia arriba).
4. Vibratome Seccionamiento y rebanada Cultura
- Recorte los bloques de agarosa LMP y pegarlas en la platina utilizando 'pegamento'. Después de que el pegamento se seca la fase de transferencia de la muestra a la bandeja de amortiguamiento de la vibratome y llene de hielo frío completar HBSS hasta que el bloque se encuentra inmersa en la solución.
NOTA: Esterilizar todas las superficies de instrumentos y equipos con etanol al 70% antes de la sección. - Preparar 250 micras vibratome secciones gruesas utilizando una nueva hoja de la siguiente manera.
- Recorte el wi bloqueº los siguientes ajustes; frecuencia - 60 Hz, amplitud - 0.7 micras, velocidad 16 a 18 mm / seg. Cortar las secciones que contienen el tejido deseado con los ajustes anteriores a velocidad lenta (9 mm / seg). Inicio del seccionamiento de la parte posterior del cerebro, recoger 5-7 secciones del cerebro.
- Transferencia de las secciones a una placa de cultivo de 6 pocillos limpia que contiene 5 ml de HBSS enfriado con hielo completar con la ayuda de una espátula doblada y mantener en hielo hasta que todas las secciones se recogen (Figura 1E).
- Humedecer la membrana de una manera cruzada con 100 l de HBSS completo antes de colocar las secciones en la membrana, para facilitar la orientación de las secciones.
- Transferir las secciones usando una espátula doblada sobre la membrana (recoger un rincón de la sección con unas pinzas y tire a la espátula y luego usar el fórceps para empujar la sección sobre la membrana). Coloque un máximo de cinco secciones en una membrana y organizar mediante el uso de fórceps (Figura 1F). No superponga las secciones entre sí.
- Tome el exceso de HBSS fuera de la membrana utilizando una pipeta. Las membranas específicas utilizadas aquí están unidos a un bastidor y se insertan en la placa de cultivo de tejido, lo que permite que el tejido esté en contacto pero no cubierto por el medio.
- Coloque los insertos de membrana en una placa de 6 pocillos que contiene 1,8 ml de medio de cultivo slice (1.2.5) (Figura 1G, H). Incubar la placa de cultivo a 37 ° C con 5% de CO2 durante 11 o 14 DIV DIV. Cambiar la mitad del medio (0,9 ml) cada segundo día.
NOTA: En esta etapa, añadir los reactivos como bromodesoxiuridina (BrdU; 10 mM concentración final) para el etiquetado de la proliferación de células a los medios de comunicación por primera 20 horas del tiempo de cultivo.
5. Fijación de las Secciones Seguido por inmunofluorescencia tinción
- Utilice una hoja de bisturí limpio y afilado para cortar y recortar las membranas, dependiendo de la orientación delas secciones.
- Transferencia de las secciones, junto con la membrana a una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de PFA al 4% (1.2.7). Incubar las secciones durante 1 hora a RT seguido de 3 lavados con PBS 1x durante 15 min cada uno. Incubar las secciones O / N con solución de permeabilización a 4 ° C con agitación suave.
- El día siguiente, se incuban las secciones con anticuerpos primarios apropiados, diluidos en solución de permeabilización, O / N o durante 48 horas a 4 ° C con agitación suave.
- Lávese las secciones 3 veces durante 15 minutos con PBS 1x y se incuba O / N a 4 ° C con los anticuerpos secundarios apropiados diluido en solución de permeabilización.
- Después de la incubación con anticuerpos secundarios, lavar las secciones una vez con 1x PBS durante 15 min seguido de tinción con DAPI durante 10 min.
- Lávese las secciones 3 veces con 1x PBS durante 15 minutos cada uno y traslado al microscopio. Añadir ImmunoMount y colocar suavemente un cubreobjetos en la parte superior de las secciones. Seque el portaobjetos O / N a 4 ° C y seal con esmalte de uñas.
NOTA: Mantenga siempre las diapositivas a 4 ° C.- Analizar los cultivos de corte por microscopía confocal (Figura 1I).
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Resultados
La ablación del factor de transcripción Bcl11b hace que el deterioro de la proliferación de células progenitoras y la diferenciación neuronal que resulta en un tamaño giro dentado reducida y número de células. Además neuronas mutantes no pueden integrarse en los circuitos del hipocampo causando el aprendizaje y el deterioro de la memoria 8. Para responder a preguntas sobre el mecanismo regulador (s) de Bcl11b en estos procesos se empleó electroporación ex utero.
Abordar l...
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Discusión
El hipocampo tiene una función importante en el aprendizaje y la memoria. El giro dentado es también una de las dos regiones del cerebro donde se produce la neurogénesis no sólo durante el desarrollo sino también durante la edad adulta. Postnatal y adulto neurogénesis del hipocampo procede de manera similar que implica muchos factores comunes. La definición de los mecanismos de regulación de estos factores va a ser muy útil en la comprensión de las enfermedades neurodegenerativas que a su vez dará lugar a nuevas terapia...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft a SB (BR-2215; SFB 497/A9).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tirador de micropipetas Flamígero / Marrón | Sutter Instruments Company (EE. UU.) | P-97 | |
| Pipetas de vidrio fino | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japón | EG-44 | |
| Unidad de soporte anestésico | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Vaporizador Halovet | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Sistema Fluovac | Aparato Harvard | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Aparato Harvard | PY2 34-0415 | |
| Cámara de anestesia | Aparato Harvard | PY2 34-0460 | |
| Electroporador | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Pinzas con electrodos de disco | BEX Company LF650P3 | Electrodos de 3 mm para E15.5 | |
| Pinzas con electrodos de disco | BEX Company LF650P5 | Electrodos de 5 mm para E18.5 | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | N/P 052-0500-900 | |
| HM 650 V Microtomo de cuchilla vibratoria, 230 V | Microscopio | 920120 | |
| Microscopía Carl Zeiss Microscopía Gmbh | Stemi SV8 | ||
| Microscopio invertido | Microscopio | Leica Leica DM IL | |
| Leica | Sp5II | ||
| Plato de 6 pocillos | BD Falcon | #353502 | |
| Plato de 6 pocillos | CELLSTAR | #657160 | |
| Insertos para cultivo de tejidos | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | ||
| Poly-L-lisina | Sigma | #P5899 | |
| Tijeras de resorte | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Tijeras Bonn Extra Finas | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Pinzas | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10x | Life Technology | 14180-046 | |
| BME Life Technology | 41010-26 |
Referencias
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- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
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Reimpresiones y permisos
